水生藻類葉綠素測定方法
2023-05-10 15:53:46
專利名稱：水生藻類葉綠素測定方法
技術領域：
本發明涉及一種水生藻類葉綠素測定方法，特別涉及用分光光度法測定水生藻類葉綠素的方法，適合於測定水中藻類葉綠素a、葉綠素b、葉綠素c。
背景技術：
水體富營養化、藻類大量繁殖導致水質惡化。為了評價水體富營養化程度，應對藻類含量進行測定。藻類是綠色浮遊生物，體內含有葉綠素，用於進行光合作用。藻類葉綠素包括葉綠素a、葉綠素b和葉綠素c。所有藻類體內均包含有葉綠素a，其含量約佔有機體乾重的1～2％，部分藻類還含有葉綠素b、c。葉綠素a佔葉綠素的絕大部分，是整個光合作用過程中的能量傳遞中心。因此，用葉綠素、尤其是葉綠素a能比較準確地反映藻類生物量，可用于衡量水體富營養化的程度。測定藻類葉綠素的方法有三類，即分光光度法、螢光法、高效液相色譜法。分光光度法所需儀器設備簡易，操作簡便，是目前普遍採用的方法。美國水質監測標準方法提供了用分光光度法測定水中藻類葉綠素含量的美國標準。我國一些水質監測部門也借用此方法進行測定，但該方法所用試劑揮發強烈，並具有毒性，汙染工作環境，危害測試人員身體健康，且該方法所需過濾膜依賴進口，測試時間長，測試成本高。我國目前還沒有測定水中藻類葉綠素含量的國家標準方法，國內推薦使用的方法存在著測定結果偏差大、測定結果不穩定、重現性差、汙染工作環境等缺點。
發明內容
本發明提供一種水生藻類葉綠素測定方法，該方法運用分光光度法測定水生藻類葉綠素，該方法選用了無毒性的試劑和價格便宜的過濾膜，所需儀器設備簡易，操作簡便，測試時間短，測定結果準確、穩定、重現性好，測試費用低，安全無汙染。
為解決上述技術問題，本發明是這樣實現的本發明採用醋酸纖維微孔濾膜過濾水中藻類，用90％乙醇浸泡研磨截留了藻類的醋酸纖維膜，將藻類細胞中的葉綠素萃取到乙醇中，將萃取液離心獲得澄清液，以90％乙醇作參比，用分光光度計測定萃取液在630、647、664、750nm處的吸光度值，採用計算公式計算水中葉綠素a、b、c含量。
本發明計算公式如下Chla＝[12.12(D664-D750)-1.58(D647-D750)-0.08(D630-D750)]VE/(Vsδ)(1)Chlb＝[-5.55(D664-D750)+21.51(D647-D750)-2.72(D630-D750)]VE/(Vsδ)(2)Chlc＝[-1.71(D664-D750)-7.77(D647-D750)+25.08(D630-D750)]VE/(Vsδ)(3)式中Chla、Chlb、Chlc——分別為水樣中葉綠素a、b、c的濃度，ug/L；D630、D647、D664、D750——分別為萃取液在波長630、647、664、750nm處的吸光度值；VE-離心管中萃取液的定容體積，ml；Vs-水樣體積，L；δ-比色皿光程，cm。
所述採用醋酸纖維微孔濾膜過濾水中藻類是在真空條件下。
所述醋酸纖維微孔濾膜過濾前在慮膜上滴至少一滴1％的MgCO3懸濁液。
所述醋酸纖維微孔濾膜採用0.8μm孔徑。
本發明與現有技術比較如下
目前與本發明類似的方法有美國國家標準方法(簡稱美國方法)和國家環保局編著的《水和廢水監測分析方法》一書中提供的國內普遍採用的方法(簡稱國內方法)，現將本發明與這兩種方法做比較。
1、與美國方法比較在操作方法方面區別在於(1)提取液不同。美國方法提取液為90％丙酮。(2)過濾膜不同。美國方法採用玻璃纖維膜。(3)需要的測試時間不同。美國方法的萃取液需要在低溫(0～4℃)條件下放置2～24小時，使得藻類細胞中的葉綠素被提取液充分提取，然後再離心測定。本發明的提取液提取能力強，在短時間內能充分提取葉綠素，不需要延時提取，可直接離心測定。(4)計算公式不同。由於90％丙酮和90％乙醇的比吸光係數不同，因而計算公式不同。美國方法的計算公式為Chla＝[11.85(D664-D750)-1.54(D647-D750)-0.08(D630-D750)]VE/(Vsδ) (4)Chlb＝[-5.43(D664-D750)+21.03(D647-D750)-2.66(D630-D750)]VE/(Vsδ) (5)Chlc＝[-1.67(D664-D750)-7.6(D647-D750)+24.52(D630-D750)]VE/(Vsδ) (6)2、與國內方法比較區別在於(1)提取液不同，國內方法提取液為90％丙酮。(2)操作程序不同，國內方法的濾膜過濾後放在冰箱內低溫乾燥6～8小時，再取出加提取液研磨。(3)需要的測試時間不同，國內方法需要增加6～8小時的低溫乾燥時間。(4)測定波長不同。國內方法測定波長為630、645、663、750nm。(5)計算公式不同，國內方法的計算公式為Chla＝[11.64(D663-D750)-2.16(D645-D750)+0.1(D630-D750)]VE/(Vsδ)(7)Chlb＝[-3.94(D663-D750)+20.97(D645-D750)-3.66(D630-D750)]VE/(Vsδ) (8)Chlc＝[-5.53(D663-D750)-14.18(D645-D750)+54.22(D630-D750)]VE/(Vsδ) (9)3、在測定效果方面的比較(1)本發明測定結果穩定，重現性好。對同一份水樣分別用三種方法進行10次重複測定，測定結果見表1。從表1可以看出，本發明測定結果的標準偏差與美國方法相當，比國內方法小得多，重現性有了大幅度提高。
表1各測定方法重現性比較
注總葉綠素為Chla、Chlb、Chlc的和。
(2)本發明測定結果準確。選擇了一系列不同葉綠素濃度的水樣，分別用三種方法進行測定，測定結果列於表2。從表2可看出，本發明與美國標準方法的測定結果基本一致，12個試樣的葉綠素a的平均相對誤差僅為0.55％，總葉綠素的平均相對誤差也只有2.5％。而國內方法與美國標準方法的測定結果相差較大，6個試樣的葉綠素a的平均相對誤差為-19.7％，總葉綠素的平均相對誤差為-3.45％。本發明的測定結果的準確程度與國內方法相比有了較大程度的提高。
實施例1-7單位分
(2)色素提取。用90％的乙醇提取液浸泡研磨截留了藻類的濾膜，將葉綠素提取到提到乙醇中，再將提取液倒入離心管中，定容到數毫升。
(3)離心分離。將盛有葉綠素提取液的離心管裝入離心機中離心，使得被研碎的濾膜紙屑沉澱到離心管底，獲得澄清的萃取液。
(4)測定。將澄清的萃取液倒入比色皿中，用90％乙醇作參比，在分光光度計上測定萃取液在630、647、664和750nm波長處的吸光度值。
(5)計算。根據測得的各波長處的吸光度、水樣體積、萃取液體積，計算水樣中葉綠素a、b、c的濃度。計算公式為Chla＝[12.12(D664-D750)-1.58(D647-D750)-0.08(D630-D750)]VE/(Vsδ)(1)Chlb＝[-5.55(D664-D750)+21.51(D647-D750)-2.72(D630-D750)]VE/(Vsδ)(2)Chlc＝[-1.71(D664-D750)-7.77(D647-D750)+25.08(D630-D750)]VE/(Vsδ)(3)式中Chla、Chlb、Chlc——分別為水樣中葉綠素a、b、c的濃度，ug/L；D630、D647、D664、D750——分別為萃取液在波長630、647、664、750nm處的吸光度值；VE——離心管中萃取液的定容體積，ml；Vs——水樣體積，L；δ——比色皿光程，cm。
實施例1、設備和試劑(1)真空泵，真空度不大於0.05MPa；(2)全玻真空抽濾裝置；(3)磁質或瑪瑙研缽；
(4)醫用離心機，轉速3500～4000r/min，負載能力500～675g；(5)離心管，15mL，帶分刻度和螺帽；(6)分光光度計，最小刻度0.5～2nm；(7)比色皿，光程1～3cm；(8)醋酸纖維膜，直徑50mm，孔徑0.8～1.0μm；(9)90％乙醇水溶液(體積比)；(10)1％MgCO3懸濁液在100ml蒸餾水中加入1.0g MgCO3粉末；2、測定程序(1)樣品準備。在水面下一定深度取水樣500mL，若藻類含量高，水量可酌減。因藻類在不同水深處含量差別較大，取樣時應準確記錄取樣點水深。取樣後應儘快進行下一步測定程序，若水樣需要保存，可在避光和低溫(0～4℃)條件下保存24h。
(2)藻類過濾。將醋酸纖維膜裝入全玻真空抽濾裝置，濾膜的光亮面朝上。連接好真空泵，在過濾膜上均勻滴加數滴MgCO3懸濁液，用量筒量取500ml水樣(藻類含量高時可酌減)，倒入抽濾裝置中。待水樣全部通過濾膜後再抽濾1分鐘，以濾幹濾膜上的水分。停止抽濾，取下濾膜，將濾膜向截留了藻類的一側摺疊，將其放在摺疊的濾紙內，以吸乾濾膜上的水分。
(3)葉綠素提取。用剪刀將濾膜剪碎，放入研缽中，加入2～3mL90％乙醇，研磨2～3分鐘，幫助提取液萃取藻細胞中的葉綠素，將萃取了葉綠素的萃取液倒入離心管中。再向研缽中加入2～3mL90％乙醇，研磨1～2分鐘，直到濾膜變白，說明葉綠素已全部溶解到萃取液中，將萃取液連同濾膜一起倒入離心管中。用90％乙醇涮洗研缽1～2遍，併入離心管。用90％乙醇將離心管中萃取液定容到8～10mL。
(4)離心。用螺帽蓋好離心管，放入離心機中，在500g離心機中離心20～25分鐘，或在675g離心機中離心15～20分鐘。
(5)測定。小心取出離心管，將上清液倒入比色皿中，以90％乙醇作參比，在630、647、664、750nm波長處測定吸光度。750nm處的吸光度反映的是萃取液的混濁程度，該值不應超過0.005，若超過該值，應重新離心後測定。
(6)計算。根據萃取液在各波長處的吸光度值、比色皿光程、水樣體積、萃取液定容體積，利用式(1)、(2)、(3)計算水中葉綠素a、b、c的含量。
權利要求
1.一種水生藻類葉綠素測定方法，其特徵是採用醋酸纖維微孔濾膜過濾水中藻類，用90％乙醇浸泡研磨截留了藻類的醋酸纖維膜，將藻類細胞中的葉綠素萃取到乙醇中，將萃取液離心獲得澄清液，以90％乙醇作參比，用分光光度計測定萃取液在630、647、664、750nm處的吸光度值，採用計算公式計算水中葉綠素a、b、c含量。
2.根據權利要求1所述的水生藻類葉綠素測定方法，其特徵是計算公式如下Chla＝[12.12(D664-D750)-1.58(D647-D750)-0.08(D630-D750)]VE/(Vsδ)(1)Chlb＝[-5.55(D664-D750)+21.51(D647-D750)-2.72(D630-D750)]VE/(Vsδ) (2)Chlc＝[-1.71(D664-D750)-7.77(D647-D750)+25.08(D630-D750)]VE/(Vsδ) (3)式中Chla、Chlb、Chlc——分別為水樣中葉綠素a、b、c的濃度，ug/L；D630、D647、D664、D750——分別為萃取液在波長630、647、664、750nm處的吸光度值；VE——離心管中萃取液的定容體積，ml；Vs——水樣體積，L；δ——比色皿光程，cm。
3.根據權利要求1所述的水生藻類葉綠素測定方法，其特徵是所述採用醋酸纖維微孔濾膜過濾水中藻類是在真空條件下。
4.根據權利要求1所述的水生藻類葉綠素測定方法，其特徵是所述醋酸纖維微孔濾膜過濾前在慮膜上滴至少一滴1％的MgCO3懸濁液。
5.根據權利要求1所述的水生藻類葉綠素測定方法，其特徵是所述醋酸纖維微孔濾膜採用0.8μm孔徑。
全文摘要
本發明公開了一種水生藻類葉綠素測定方法，該方法用分光光度法測定水中藻類葉綠素含量，採用醋酸纖維微孔濾膜過濾水中藻類，用90％乙醇浸泡研磨截留了藻類的醋酸纖維膜，將藻類細胞中的葉綠素萃取到乙醇中，將萃取液離心獲得澄清液，以90％乙醇作參比，用分光光度計測定萃取液在630、647、664、750nm處的吸光度，利用測定數據計算水樣中葉綠素a、b、c的含量。本發明測定結果準確穩定，重現性好；安全無汙染；測試迅速，耗時短，為同類方法的1/5～1/13；所需設備少，測試費用低，僅為同類方法的1/5。
文檔編號A01H13/00GK1631117SQ20041007354
公開日2005年6月29日 申請日期2004年12月30日 優先權日2004年12月30日
發明者黃廷林, 叢海兵, 何文杰 申請人:西安建築科技大學, 天津市自來水集團有限公司