B型肝炎病毒耐藥基因突變的檢測探針、檢測試劑盒及其檢測方法
2023-05-10 21:12:31 4
專利名稱：B型肝炎病毒耐藥基因突變的檢測探針、檢測試劑盒及其檢測方法
技術領域：
本發明屬於分子生物學領域，涉及醫學和生物技術，具體涉及與B型肝炎病毒的核苷類似物治療耐藥性相關的基因突變檢測。
背景技術：
B型肝炎病毒(h印atitis B virus, HBV)屬啫肝DNA病毒科，基因組長約3. 2Kb， 為部分雙鏈環狀DNA。B型肝炎是全球廣泛分布的傳染病，但不同地區HBV感染的流行強度差異很大。據世界衛生組織報導，全球約20億人曾感染過HBV，其中3. 5億人為慢性HBV 感染者，每年約有100萬人死於HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝癌。2006年全國B型肝炎流行病學調查結果表明，我國1 59歲一般人群B肝病毒表面抗原(HBV surface antigen, HBsAg)攜帶率為7. 18%，5歲以下兒童的HbsAg攜帶率僅為0. 96%。據此推算， 我國現有的慢性HBV感染者約有9300萬人，其中慢性B型肝炎患者約2000萬例。我國每年因肝病死亡的約有30萬人左右。近年來，慢性B型肝炎的治療取得了很大改善，目前獲得批准的用於治療慢性B型肝炎的藥物有兩大類，一類是幹擾素，一類是核苷類似物。目前已經上市的核苷類似物藥物有5種，分別是拉米夫定(Lamivudine，LAM, 1998年上市)、阿德福韋酯(Adefovir，ADV, 2002 年上市)、恩替卡韋(Entecavir, ETV，2005 年上市)、替比夫定(Telbivudine, LDT， 2007年上市)、替諾福韋(Tenofovir，TDF)、恩曲他濱(Emtricitabine, FTC)。這類藥物是通過幹擾病毒的逆轉錄過程和抑制DNA合成來抑制病毒DNA的複製，使患者的病毒DNA水平快速下降。這類藥物的優勢在於口服藥物且安全可靠。但是核苷類似物藥物只能抑制病毒複製，而不能根除病毒，因此需要長期使用。而隨著核苷類藥物在國內使用頻率及年限的增加，HBV耐藥突變率逐年增高，例如1998年批准使用的拉米夫定(LAM)，治療1 4年的基因耐藥率分別為14%、38%、49%、66%，且呈現繼續上升趨勢，其他類藥物也出現不同程度的耐藥性。目前報導的核苷類似物藥物拉米夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋、替比夫定、替諾福韋、恩曲他濱在中國人群中常見的耐藥基因突變位點有18個。rtV173L、rtL179P、rtL180M、 rtA181V/T、rtT184A/G/I/S、rtA194T/M、rtA200V、rtS202G/I、rtM204V/I/S、rtV207M/I/ L、rtS213T、rtV214A、rtQ215S、rtN236T、rtP237H、rtN238T/D、rtK241E、rtM250V。其中， rtV173L、rtM204V/I/S、rtL180M 與恩曲他濱的耐藥有關；rtV173L、rtL179P、rtL180M、 rtA200V、rtM204V/I/S、rtV207M/I/L、rtS213T 與拉米夫定的耐藥有關；rtV173L、rtL180M、 rtT184A/G/I/S、rtS202G/I、rtM204V/I/S、rtM250V 與恩替卡韋的耐藥有關；rtM204V/I/ S與替比夫定耐藥有關，rtA194T/M與替諾福韋耐藥有關；rtA181V/T、rtK241E、rtQ215S、 rtN236T、rtP237H、rtN238T/D、rtV214A與阿德福韋酯耐藥有關。耐藥位點基因突變導致病人對核苷類似物產生耐藥後，病人血清的谷丙轉氨酶水平和病毒DNA水平升高，甚至病情惡化。
因此，建立簡單、快速的B型肝炎病毒耐藥基因突變檢測方法，能夠監測上述18 個耐藥基因突變位點中的一個或數個的突變情況，及時發現病人的耐藥性情況，從而調整用藥和治療方案，這對於促進B型肝炎病毒的臨床治療有非常重要的意義。
發明內容
本發明提供了一種檢測B型肝炎病毒的多耐藥基因突變位點方法，檢測探針以及檢測試劑盒。本發明所能夠檢測的B型肝炎病毒的耐藥基因突變位點列表如下表1B型肝炎病毒的耐藥基因突變位點列表
核苷類似物藥物相關的耐藥基因突變位點拉米夫定 (LAM)rtV173L、rtL 179P、rtL 180M、rtA200V、rtM204V、rtM204I、rtM204S、 rtV207M、rtV207K rtV207L、rtS213T阿德福韋酯(ADV)rtA181V、rtA181T、rtV214A、rtQ215S、rtN236T、rtP237H、rtN238T、 rtN238D、rtK241E替諾福韋 (TDF)rtA194T, rtA194M恩替卡韋 (ETV)rtV173L、rtL180M、rtT184A、rtT184G、rtT184I、rtT184S、rtS202G、 rtS202K rtM204V、rtM204K rtM204S. rtM250V替比夫定 (LDT)rtL 18OM、rtM204V、rtM204I、rtM204S恩曲他濱 (FTC)rtV173L、rtL180M、rtM204V, rtM204I、rtM204S本發明提供了一種B型肝炎病毒耐藥基因突變的檢測探針，所述的耐藥基因突變位點為 rtV173L、rtL179P、rtL180M、rtA181V/T、rtT184A/G/I/S、rtA194T/M、rtA200V、 rtS202G/I、rtM204V/I/S、rtV207M/I/L、rtS213T、rtV214A、rtQ215S、rtN236T、rtP237H、 rtN238T/D、rtK241E、rtM250V中的任意一種或幾種，所述的檢測探針為5，-TAGGTCTATTTAC AGGCAGTTTTCG-3』。本發明還提供了一種B型肝炎病毒耐藥基因突變的檢測試劑盒，所述的耐藥基因突變位點為 rtV173L、rtL179P、rtL180M、rtA181V/T、rtT184A/G/I/S、rtA194T/M、rtA200V、 rtS202G/I、rtM204V/I/S、rtV207M/I/L、rtS213T、rtV214A、rtQ215S、rtN236T、rtP237H、 rtN238T/D、rtK241E、rtM250V中的任意一種或幾種，所述的試劑盒包含有用於擴增所述耐藥基因突變位點的PCR試劑和上述的檢測探針，所述的PCR試劑中包含有一對引物，其序列如下正向引物5，-TTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCAC-3，反向引物5，-TAGGTCTATTTACAGGCAGTTTTCG-3，。
再一方面，本發明還提供了使用上述的檢測試劑盒來檢測B型肝炎病毒耐藥基因突變的方法，該方法包括以下步驟(1)取空腹受檢者血清進行DNA抽提；(2)使用權利要求2中所述的PCR試劑對步驟(1)所提取的DNA進行PCR擴增；(3)將步驟⑵獲得的PCR擴增產物酶解；(4)將權利要求1所述的檢測探針與步驟(3)所獲得的酶解產物混合進行測序 PCR反應；(5)用測序儀對步驟⑷獲得的測序PCR產物進行測序，找出所述各耐藥基因突變位點所在位置的對應序列，並與所述各耐藥基因突變位點的標準序列比較，判斷是否發生突變。本發明的一個具體實施方案中，步驟(2)所述的PCR擴增的反應體系為PCR Buffer 2. 5 μ 1、2· 5mM 的 dNTP Mix 2· 5 μ 1、5 IOU 的 Taq 酶 0. 2 μ 1、0· lug/ulDNA 模板 1μ l、10uM 引物各 1μ l、ddH20 16. 8 μ 1 ；所述的引物為權利要求2中所述的正向引物和反向引物；在本發明的一個具體實施例中，1 μ 1 DNA模板大約含有IOOngDNA ；反應條件為94°C 4分鐘變性和酶激活，94°C 15秒變性，50°C 15秒退火，72°C 2分鐘延長，循環25次，最後4°C延長5分鐘以上。本發明的另一個具體實施方案中，步驟⑷所述的測序PCR的反應條件為960C 1分鐘變性和酶激活，96°C 10秒變性，50°C 5秒退火，60°C 4分鐘延長，循環 25次，最後4°C延長5分鐘以上。所述的測序試劑可以為本領域技術人員所熟知的測序PCR反應所需試劑，例如 BigDye Terminator循環測序試劑盒。在本發明的一個具體實施方式
中，驟(4)所述的測序PCR的反應體系為所述的步驟(3)獲得的酶解產物3 μ l、BigDye Terminator循環測序試劑1 μ 1和7pm/ul檢測探針 2μ 1。本發明能夠非常方便地檢測出B型肝炎病毒耐藥基因突變情況，運用1對PCR擴增引物，以及一個檢測探針就能檢測出目前所公開的18個B型肝炎病毒耐藥基因突變位點中的任意一個或數個。不僅特異性好，並且所有的突變位點檢測均可在一次檢測過程中完成，操作方便，避免了多次操作過程中存在的諸多不確定因素，因而可大大提高檢測準確率。另外，本發明提供的檢測方法不僅能夠檢測出B型肝炎病毒耐藥基因突變情況， 還能夠在同一次操作中也檢測出B型肝炎病毒的基因分型情況，操作簡單、高效率。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用於本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示範之用。實施例1B型肝炎病毒耐藥基因突變位點檢測1、取空腹受檢者血清進行DNA抽提採集空腹受檢者靜脈血1ml，注入無菌1. 5ml離心管中，於室溫靜置2小時，轉入 4°C靜置1小時，8000rpm/分離心5分鐘，吸取200 μ 1上清轉入另一無菌1. 5ml離心管中， 獲得血清標本；(如測定在5日內進行，標本存放於4°C，如果測定時間延遲，標本必須存於-20°C。標本運送應保存4°C以下。)取50 μ 1濃縮液(主要成分聚乙二醇)到確定數量的0. 5ml離心管中，再加入上述獲得的血清標本50 μ 1，振蕩混勻後4°C靜置5分鐘，15000rpm離心10分鐘，吸棄上清。 加入20 μ 1裂解緩衝液(主要成分NaCl)，劇烈振蕩或用槍頭攪碎至無沉澱後短暫離心，沸水浴10分鐘，15000rpm離心5分鐘，取上清液，即獲得本實施例的檢測用DNA樣本。2、PCR擴增反應所採用的一對正反向引物如下正向引物5，-TTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCAC-3，反向引物5，-TAGGTCTATTTACAGGCAGTTTTCG-3，。PCR 擴增的反應體系為PCR Buffer 2. 5 μ 1、2. 5mM 的 dNTP Mix 2. 5μ1、5 IOU的Taq酶0. 2μ 1、DNA模板1μ l(100ng左右)、IOuM正向引物反向引物各1 μ 1、ddH20 16. 8μ 1 ；反應條件為94°C 4分鐘變性和酶激活，94°C 15秒變性，50°C 15秒退火，72°C 2分鐘延長，循環25次，最後4°C延長5分鐘以上。3、PCR擴增產物的酶解上述的PCR擴增產物取1 μ 1(檢測用DNA樣本濃度彡5X 103IU/ml)，再向其中加入2μ1酶試劑(其中包含2U SAP酶、IU核酸外切酶)後混勻。37°C 60分鐘，80°C 15分鐘，最後4°C保存。4、酶解後產物的測序PCR反應該測序PCR反應所採用檢測探針為5』 -TAGGTCTATTTACAGGCAGTTTTCG-3，。測序PCR的反應體系為步驟3獲得的酶解產物(取陽性)3μ1、測序試劑 (BigDye Terminator循環測序試劑盒)1 μ 1和7pm/ul檢測探針2 μ 1。反應條件為96°C 1分鐘變性和酶激活，96°C 10秒變性，50°C 5秒退火，60°C 4分鐘延長，循環25次，最後4°C延長5分鐘以上。5、測序以及結果分析步驟4獲得的測序PCR反應產物進行純化後，在自動化的基因測序儀(ABI3730) 上進行測序。分析測序結果，找出表1中所述18個耐藥基因突變位點所在位置的對應序列， 並與表1中所述18個耐藥基因突變位點的標準序列比較，判斷是否發生突變。具體來說，採用測序結果分析程序Chromas，按Find快捷鍵，找到第173位B肝病毒耐藥基因突變位點前的保守序列「CTATGGGA」後，按照順序統計出第173位-第250位之間的18個耐藥基因突變位點序列；將統計完成的18個耐藥基因突變位點序列與對應的標準序列比較，找出發生突變的耐藥位點。檢測結果參下表2 ；表2實施例IDNA樣本的B肝病毒耐藥基因突變位點檢測結果
權利要求
1.一種B型肝炎病毒耐藥基因突變的檢測探針，所述的耐藥基因突變位點為 rtV173L、rtL179P、rtL180M、rtA181V/T、rtT184A/G/I/S、rtA194T/M、rtA200V、rtS202G/I、 rtM204V/I/S、rtV207M/I/L、rtS213T、rtV214A、rtQ215S、rtN236T、rtP237H、rtN238T/D、 rtK241E、rtM250V中的任意一種或幾種，其特徵在於，所述的檢測探針為5，-TAGGTCTATTTA CAGGCAGTTTTCG-3』。
2.—種B型肝炎病毒耐藥基因突變的檢測試劑盒，所述的耐藥基因突變位點為 rtV173L、rtL179P、rtL180M、rtA181V/T、rtT184A/G/I/S、rtA194T/M、rtA200V、rtS202G/I、 rtM204V/I/S、rtV207M/I/L、rtS213T、rtV214A、rtQ215S、rtN236T、rtP237H、rtN238T/D、 rtK241E、rtM250V中的任意一種或幾種，其特徵在於，所述的試劑盒包含有用於擴增所述耐藥基因突變位點的PCR試劑和權利要求1所述的檢測探針，所述的PCR試劑中包含有一對引物，其序列如下正向引物5』 -TTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCAC-3，反向引物5』 -TAGGTCTATTTACAGGCAGTTTTCG-3，。
3.—種B型肝炎病毒耐藥基因突變的檢測方法，其特徵在於，該檢測方法使用如權利要求2所述的檢測試劑盒，其包括以下步驟(1)取空腹受檢者血清進行DNA抽提；(2)使用權利要求2中所述的PCR試劑對步驟(1)所提取的DNA進行PCR擴增；(3)將步驟(2)獲得的PCR擴增產物酶解；(4)將權利要求1所述的檢測探針與步驟(3)所獲得的酶解產物混合進行測序PCR反應；(5)用測序儀對步驟(4)獲得的測序PCR產物進行測序，找出所述各耐藥基因突變位點所在位置的對應序列，並與所述各耐藥基因突變位點的標準序列比較，判斷是否發生突變。
4.如權利要求3所述的檢測方法，其特徵在於，步驟(2)所述的PCR擴增的反應體系為PCR Buffer 2. 5 μ 1、2· 5mM 的 dNTP Mix 2· 5 μ 1、5 IOU 的 Taq 酶 0· 2 μ 1、0· lug/ul DNA 模板 1 μ IUOuM 引物各 1 μ UddH2O 16. 8 μ 1 ；所述的引物為權利要求2中所述的正向引物和反向引物；反應條件為94°C 4分鐘變性和酶激活，94°C 15秒變性，50°C 15秒退火，72°C 2分鐘延長，循環25次，最後4°C延長5分鐘以上。
5.如權利要求3或4所述的檢測方法，其特徵在於，步驟(4)所述的測序PCR的反應條件為960C 1分鐘變性和酶激活，96°C 10秒變性，500C 5秒退火，60°C 4分鐘延長，循環25次， 最後4°C延長5分鐘以上。
全文摘要
本發明提供了一種檢測B型肝炎病毒的多耐藥基因突變位點方法，檢測探針以及檢測試劑盒。本發明能夠非常方便地檢測出B型肝炎病毒耐藥基因突變情況，運用1對PCR擴增引物，以及一個檢測探針就能檢測出目前所公開的18個B型肝炎病毒耐藥基因突變位點中的任意一個或數個。不僅特異性好，並且所有的突變位點檢測均可在一次檢測過程中完成，操作方便，避免了多次操作過程中存在的諸多不確定因素，可大大提高檢測準確率。另外，本發明提供的檢測方法不僅能夠檢測出B型肝炎病毒耐藥基因突變情況，還能夠在同一次操作中也檢測出B型肝炎病毒的基因分型情況，操作簡單、高效率。
文檔編號C12Q1/70GK102286645SQ20111025427
公開日2011年12月21日 申請日期2011年8月30日 優先權日2011年8月30日
發明者潘加奎 申請人:解碼(上海)生物醫藥科技有限公司