一種由微生物（單細胞真菌高山被孢黴）產生的富含花生四烯酸的油及其製備工藝的製作方法
2023-05-10 22:17:21
一種由微生物（單細胞真菌高山被孢黴）產生的富含花生四烯酸的油及其製備工藝的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種能夠大量生產花生四烯酸（或ARA）的高山被孢黴菌株，一種使用該菌株的相關脂類化合物的生產方法，以及使用該菌株製備的產物和化合物。
【專利說明】—種由微生物(單細胞真菌高山被孢黴)產生的富含花生四烯酸的油及其製備工藝
[0001]本發明涉及一種富含花生四烯酸油的新化合物，其是由微生物產生，且最好是被孢黴類的單細胞真菌(絲狀黴)產生，本文指的是高山被孢黴的特殊菌株。
[0002]脂類、蛋白質和碳水化合物是三大營養素。
[0003]脂類中又特別包括甘油三酯和磷脂。
[0004]甘油三酯約佔口服食用脂類的95%。在人體內，它們主要存在於脂肪組織，是貯存能量的主要形式。
[0005]磷脂是結構性脂類，它們是細胞膜的組成部分，尤其是保證細胞膜的流動性。
[0006]甘油三酯和磷脂的主要組成部分是脂肪酸，脂肪酸既可獲自食物，也可以通過人體自身合成。
[0007]從生物化學角度，脂肪酸可分為(根據脂肪酸分子包含的雙鍵數量)飽和脂肪酸(AGS)、單不飽和脂肪酸(AGMI)和多不飽和脂肪酸(AGPI )。
[0008]從生理學角度，我們將它們分成:
[0009]-必需脂肪酸:人體成長和正常運行必需，但又不能自身合成的脂肪酸；
[0010]-「條件性」必需脂肪酸，是保證細胞正常生長和生理功能的主要物質，如果是通過食物獲取的，則可以通過它們的前體化合物獲取。如果沒有它們必需的前體，則為嚴格必
需脂肪酸。
[0011]-非必需脂肪酸。
[0012]所有必需脂肪酸和「條件性」必需脂肪酸組成了必需脂肪酸。
[0013]其它脂肪酸則未非必需脂肪酸。
[0014]我們將必需脂肪酸分成兩大類:0mega 6脂肪酸(或AGPI n_6)，其前體和主要代表是亞油酸(LA)，以及omega 3脂肪酸(或AGPI n_3)，其前體是α-亞麻酸(ALA)。
[0015]在非必需脂肪酸中，尤其包括:
[0016]-omega 3脂肪酸類的二十碳五烯酸(EPA),
[0017]-油酸、食物中大量存在的單飽和脂肪酸以及
[0018]-飽和脂肪酸。
[0019]除了產自花生、紅花、油菜、玉米、亞麻、核桃、芝麻、大豆、向日葵外，多種不飽和脂肪酸還可以由多種單細胞生物化合物(藻類、真菌等)產生。
[0020]花生四烯酸(「ARA」)是我們在有些植物油中發現的一種長鏈脂肪酸。
[0021]這是一種C 20:4 (n-6、n-9、n-12、n-15)多不飽和脂肪酸，比如20個碳原子和碳原子上的四個乙烯鍵5(11-15)、8(11-12)、11(11-9)和14(n_6)組成的脂肪酸。
[0022]這種脂肪酸也被稱作「四烯酸」，因為它具有4個不飽和有機物(4個碳-碳雙鍵)。
[0023]我們還可在專題著作中發現把它稱作「全順式-5，8，11,14- 二十碳四烯酸」(其中「順式」定義了雙鍵的構型，而且「全部」雙鍵均為「順式」構型)。
[0024]AM是人體內最豐富的一種C20的AGPI，人體可以通過亞油酸合成。
[0025]機體、肌肉和血液中都存在花生四烯酸。[0026]ARA是多種生物活性化合物的重要前體，這些生物活性化合物被統稱為「類二十烷酸」，該家族包括前列腺素、凝血氧烷和白細胞三烯。
[0027]這些類二十烷酸對脂蛋白代謝、血液流變、肌肉緊張、白細胞功能、血小板激活和細胞生長具有調節作用。
[0028]ARA還是人乳乳脂成分之一，並被視為嬰幼兒神經最佳生長必不可少的物質。科學家和食品監管機構努力獲得與人乳中的長鏈脂肪酸性質一致的嬰幼兒製品，他們建議在可在嬰幼兒製品中添加花生四烯酸，尤其是用於給早產兒的配方中。
[0029]用於嬰幼兒製品的含有花生四烯酸的油中最好特別含少量或不含其他AGPI (比如，二十碳五烯酸或EPA)。
[0030]實際上並不推薦其他AGPI，因為其中有些脂肪酸可能與嬰幼兒製品中使用的花生四烯酸互相干擾，並且/或者可能妨礙含有花生四烯酸的油與其他油類混合，從而損害人乳中脂肪酸的恰當比例(重組人乳)或其他希望的應用。
[0031]此外，ARA還有多種應用，比如不僅用於人類食品的製備，還用於動物的食物中。
[0032]實際上ARA在動物營養學方面有許多公認的性質:
[0033]-消炎作用，因為ARA是系列2前列腺素和大麻素的前體(主要在豬身上得到證明)，
[0034]-在魚類(鯛魚)身上的抗應激性，通過與前列腺素不同的途徑，
[0035]-在豬身上的調節免疫性。
[0036]此外還進行了傳遞研究，以顯示花生四烯酸在肉體、奶和產出的卵內的轉移。
[0037]當從微生物中被分離出來時，商業產物的主要可用形式為通過被孢菌類的絲狀黴發酵獲得的富含花生四烯酸的油。
[0038]在EP 276541 中描述了米用 alpina, hygrophila, spinosa 被抱菌生產 ARA 的工藝。
[0039]國際專利申請WO 94/28913則描述了一種使用高山被孢黴來生產基本上沒有EPA的ARA的發酵工藝。
[0040]然而，正如EP 726.321中所斷定的，用來測試其生產ARA能力的所有被孢菌(alpina, hygrophila, spinosa, schmuckeri 和 carmagensis),其中生產倉泛力最優秀的是被抱菌 schmuckeri 或 carmagensis 的菌株。
[0041]所以，ARA生產領域的專家們承認，與M.alpina、hygrophila或spinosa相比,選擇M.Schmuckeri或M.carmagensis菌株,才能保證最佳效率、生產率和重量。
[0042]然而，我們仍舊需要具備可以生產ARA含量高、並且具有長鏈飽和脂肪酸或長鏈多不飽和脂肪酸全部特性的優質油。
[0043]此外，對於眾多國家監管當局而言,嬰兒食品中只允許使用高山被孢黴。
[0044]首先，要由申請公司提供富含花生四烯酸並同時具有下列成分的油的新配方:
[0045]-含有少量除ARA以外的多不飽和脂肪酸(比如EPA)，
[0046]-含量有限的一些長鏈飽和脂肪酸(比如山嵛酸、肉豆蘧酸、棕櫚酸或木焦油酸)。
[0047]此外，申請公司注意到含有少量這些飽和脂肪酸可以獲得在透明度、冷濁度低方面比商品油重量更好的油。
[0048]申請公司還關注調試比現有技術中描述的工藝更高效和更經濟的替代生產工藝，所以在研究中鑑別了具有傑出的生產花生四烯酸的能力的高山被孢黴的新菌株，因為它可以生產50%的花生四烯酸(這裡的％表示佔全部脂肪酸的重量百分百)。
[0049]因此,與在M.Schmuckeri或M.carmagensis類型的菌株中進行研究的技術先例不同，申請公司找到了生產AM的最佳菌株。
[0050]此外，除了非凡的花生四烯酸生產能力之外，該菌株還可以獲得(這裡的％表示佔全部脂肪酸的重量百分百):
[0051]-低於0.5%，最好是低於0.2%的EPA，
[0052]-低於0.5%，最好是低於0.2%的肉豆蘧酸(C14:0)，
[0053]-低於9%，最好是低於7%的棕櫚酸(C16:0)，
[0054]-低於3%，最好是低於2.5%的山嵛酸(22:0)，以及
[0055]-低於3%，最好是低於2.5%的木焦油酸(C 24:0)。
[0056]2012年6月12日將這種高山被孢黴菌株交存至法國的巴斯德研究所的法國國家微生物保藏中心(CNCM)，編號為CNCM 1-4642，同時交存至中國的武漢大學的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，中華人民共和國武漢市，郵編:430072，編號為M 209116。
[0057]它的特徵是:ARN 25S編碼基因Dl - D2部位的順序排列(ID序列號I):
[0058]
【權利要求】
1.一種高山被孢黴(Mortierella alpina)菌株,其於2012年6月12日在法國國家微生物保藏中心(CNCM)以保藏號1-4642保藏。
2.—種高山被孢黴(Mortierella alpina)菌株，其通過突變或基因工程從權利要求1的菌株獲得，並且其具有產生以總脂肪酸的重量計至少50%的花生四烯酸的能力。
3.一種目的脂類化合物的生產方法，包括培養權利要求1或權利要求2的菌株，以及回收富含目的脂類化合物的生物質，以及任選地，回收目的脂類化合物。
4.權利要求3的方法，其中目的脂類化合物為花生四烯酸(或ARA)。
5.權利要求4的方法，其中花生四烯酸(ARA)以油形式存在。
6.權利要求5的方法，其中包含花生四烯酸的油通過包括下列步驟的方法來製備: -在異養條件下培養菌株，以生產生物質，所述生物質以重量計脂類為40到55%，優選以重量計脂類為40到50%，更優選以重量計脂類為約45%，並且具有以總脂肪酸的重量計50到55%的AM。 -回收所獲得的生物質， -乾燥所述生物質， -用選自己烷和丁烷的溶劑，尤其是用液體丁烷萃取油， -精煉和回收所萃取的油。
7.權利要求1或權利要求2 的菌株在生產目的脂類化合物，例如花生四烯酸(ARA)中的應用。
8.由權利要求3的方法產生的脂類化合物，例如花生四烯酸(ARA)在製備食品組合物中的應用。
9.一種產物或者組合物，其包含權利要求1或權利要求2的菌株，或者其富含目的脂類化合物，例如花生四烯酸(ARA)的細胞裂解物或者萃取物。
10.權利要求9的產物或組合物，其中所述產物或組合物富含花生四烯酸(ARA)。
11.權利要求10的產物或組合物，其中所述產物或組合物包含以總脂肪酸的重量計50%以上的花生四烯酸(ARA)，並且具有: -低於0.5%，優選低於0.2%的二十碳五烯酸(EPA)， -低於0.5%，優選低於0.2%的肉豆蘧酸(C14:0)， -低於9%，優選低於7%的棕櫚酸(C16:0)， -低於3%，優選低於2.5%的山嵛酸(C22-.0)，以及 -低於3%，優選低於2.5%的木焦油酸(C24:0)。
12.權利要求9到11任一項的產物或組合物，其中所述產物或組合物是食品或膳食補充劑。
13.—種生產高山被孢黴(Mortierella alpina)菌株的方法,所述高山被孢黴菌株具有產生以總脂肪酸的重量計至少50%的花生四烯酸，該方法包括權利要求1的菌株的突變和基因工程。
【文檔編號】C12R1/645GK103667068SQ201210343057
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月14日 優先權日:2012年9月14日
【發明者】錢雲, 周潔, 伯納德·波拉 申請人:羅蓋特兄弟公司