高包封率長效神經生長因子脂質體及其製備方法

2023-05-10 20:32:46

專利名稱：高包封率長效神經生長因子脂質體及其製備方法
技術領域：
本發明涉及高包封率長效神經生長因子脂質體，屬於蛋白多肽類藥物技術領域。
背景技術：
神經生長因子(Nerve Growth Factor, NGF)是人體神經系統最重要的生物活性物質之一，已證明確有促進神經突起生長和營養神經的雙重作用，並能對中樞和周圍神經系統損傷有明顯修復作用，國外兩位科學家(Levi-Montaleini和S. Cohen)因發現和提純NGF 於1986年獲諾貝爾醫學獎。NGF具有三種亞基(α β Y )，當前NGF通常指具有生物活性的 β亞基，根據沉降係數也稱2. 5S NGF，分子量^KD,等電點9. 3，由兩條含118個胺基酸相同的單鏈組成。2001年我國在世界上首先批准生產上市NGF肌肉注射凍乾粉針劑，製劑中採用 β-NGF加入5%甘露醇和人血白蛋白保護劑，主要用於周圍神經損傷以及視神經病變， 多發性神經炎、帶狀皰疹和神經麻痺等。對老年痴呆，可明顯緩解病人的認知記憶障礙。但因NGF不能通過血腦屏障，因此只能採取腦室注射方法。NGF在體內外均不穩定，體外採用凍幹方法可以基本得到解決，而體內在多種酶的作用下，NGF靜脈注射體內的半衰期僅為9分鐘，因此NGF無論應用於周圍神經，還是直接應用於中樞神經均難於滿足臨床要求，療效也大打折扣。為了解決NGF體內的穩定性和通過血腦屏障這兩大難題，在國家自然科學基金立項資助下(批准號30070901 2001. 01 2003. 12)將NGF製成脂質體，並且採取添加長循環輔料、柔性輔料、陽離子輔料等製成荷正電的長循環柔性納米脂質體，動物試驗初步證明在高劑量給藥時，具有一定的腦靶向作用。但體內藥動學實驗結果其半衰期僅為Tl/2 = 0. 22池，包封率為34%，作為實際臨床應用尚須進一步研究改進。國內有專利將NGF製成一般的長循環脂質體，加入酶抑制劑製成脂質體凝膠鼻噴霧劑，以期達到腦靶向作用，結果體內半衰期由9分鐘提高到35分鐘，包封率為34%，這仍難於滿足臨床要求。國內外也有大量研究論文及專利將肽類藥包封在脂質體內以達到提高體內穩定性的作用，但其肽類的分子量限定在IOKD以下，而通常應用的i3-NGF(2.5SNGF)分子量為 ^KD,又因為其水溶性難將其包入脂質體中，包裹的NGF也因其水溶性容易洩漏。因其龐大的分子量，暴露在外，難以抵擋體內酶類的攻擊。

發明內容
本發明要解決的第一個技術問題是提供一種高包封率長效神經生長因子脂質體。本發明要解決的第二個技術問題是提供這種高包封率長效神經生長因子脂質體的製備方法。為實現上述目的，本發明採用以下技術方案一種高包封率長循環脂質體製劑的製備方法，將NGF與脂質體活性膜材聯結後，與其他脂質體成份用常規方法製成長循環脂質體。一種高包封率長循環脂質體製劑的製備方法，將脂質體活性膜材與脂質體其他成分一起用常規方法製成長循環脂質體，加入NGF與活性膜材反應聯結。一種高包封率長循環脂質體製劑的製備方法，以常規方法製成長循環脂質體，將 NGF與脂質體活性膜材反應聯結，將二者加到一起孵育，利用疏水作用，將後者插入到脂質體雙分子層中。所述長循環脂質體的常規製備方法是成膜法、反向蒸發法、復乳法、注入法、熔融法、冷凍乾燥法或離心法。所述脂質體活性膜材可以是DSPE-PEG-MAL、DSPE_PEG_SC、DSPE-PEG-BTC，其中 PEG平均分子量是2，000 6，000。活性成膜材料可以是以下三種1) DSPE-PEG-BTC (二硬脂醯乙醇胺-聚乙二醇-苯並三唑磷酸酯)其中活性基因BTC可以和NGF肽鏈中的α -氨基反應，並將二者結合起來。2)DSPE-PEG-SC(DSPE-PEG-Succinimidyl Carbonate, 二硬酯醯乙醇胺-聚乙二醇-琥珀醯亞胺碳酸酯)活性基團SC與NGF肽鏈中的氨基反應，並將二者結合起來。3) DSPE-PEG-MAL (DSPE-PEG-Maleimie，二硬酸醯乙醇胺-聚乙二醇-馬來醯亞胺)活性基團MAL可以和NGF肽鏈中半胱氨酸的-SH反應，並將二者結合起來。以上反應均在常溫下數小時內完成，隨後進入凍幹，確保NGF不被破壞。所述脂質體的常規其他成份是磷脂、膽固醇或各種表面活性劑。所用的脂質體活性成膜材料中含有磷脂部分(如DSPE)可以參與組成脂質體雙分子層，所含的 PEG(PEG2000 6000)具有長鏈聚乙二醇分子，吸附大量水分子可以起屏蔽作用，阻擋體內的吞筮細胞的吞噬作用，避免酶類對NGF的破壞。此外常規脂質體雙分子膜層，對NGF也具有一定的保護作用。所述方法中添加凍幹支持劑，通過常規凍幹工藝製成前體脂質體。所述方法中添加抗氧化劑和其他具有穩定作用或影響釋放性能的助劑。一種高包封率長循環脂質體製劑，採用上述方法製備得到。可以在凍幹前或以後加入酶抑制劑，增稠劑、防腐劑、支持劑，可以製成注射劑、凝膠劑、噴霧劑、溶液劑、粉針劑、 眼用鼻腔給藥或局部給藥劑型。所述製劑為靜脈注射製劑、皮下注射製劑、肌肉注射製劑、髓鞘內注射製劑、呼吸道吸入製劑、口服製劑或外用製劑。本發明的創新之處還在於發現以上方法製備的NGF脂質體NGF收率可達到70 %以上(相當於包封率> 70% )，包封的NGF不能自由滲漏到外相水溶液中。如除去外水相的 NGF，則其包封率可達90%以上。本發明的創新之處在於製備NGF高包封長效脂質體，採用先製成含活性成膜材料的空白脂質體，再加入NGF與之反應連接。也可製成常規的長循環脂質體，將NGF與活性膜材結合，二者混合後，利用疏水作用後者插入前者的雙分子層中。或者先將活性膜材與NGF 結合再與其他膜材一起製備脂質體。本發明的創新之處還在於如此製備的NGF高包封率的脂質體體內半衰期可以大大延長，以便於NGF更好的發揮對周圍神經的再生營養作用，也便於NGF能更有效的通過血腦屏障。 本發明的優點是本發明通過NGF分子中的-SH，-NH2與脂質體特殊活性膜材_活性脂鍵合，大大提高了包封率，在活性酯中長鏈PEG保護下提高體內穩定性，解決NGF應用的關鍵問題。本發明通過脂質體活性膜材與NGF的鍵合可以達到90%以上的高包封率，粒度可以控制在50 IOOOnm範圍內，並且在體內外穩定性均明顯提高。脂質體的膜材為大豆磷脂，DSPE-PEG，膽固醇和其他脂質成份，可通過薄膜分散法，加壓擠出法等脂質體的常規製備方法製備，也可將上述方法製備的脂質體加入適當的凍幹保護劑製成前體脂質體凍乾粉針。可用於靜脈注射、肌肉注射、局部注射、霧化吸入等多種給藥方法。下面結合本發明實施例對本發明作進一步說明，凡是依照本發明公開內容進行的任何本領域的等同替換均屬於對本發明專利權的侵犯。
具體實施例方式實例1稱取卵磷脂400mg,膽固醇 80mg，DSPE-PEG 108mg, DSPE-PEG-Mal 108mg 溶於 10 20ml氯仿溶液中，得到脂質體液在55°C水浴下旋轉蒸發製成均勻薄膜，繼續55°C下減壓蒸發30min，除去氯仿，得到稠厚的膠壯物。加入適量硫酸銨溶液(123mm0l/L pH5. 4)，水浴冷卻超聲洗脫20分鐘，得到的脂質體混懸液加入NGF，數量相當DSPE-PEG-Mal摩爾數的1 1/4，室溫孵育4 10h。NGF 反應率為 74%，平均粒徑 140nm VC = 0. 590。過膜後可得不同的粒徑範圍脂質體。上柱分離游離的NGF，成品包封率可以更高，並不滲漏。實例2DSPE-PEG-SC 與 NGF 摩爾比為 3 1，用 pH7. 5HEPES[N_(2_ 羥乙基)哌嗪-N-2-乙磺酸]緩衝液分別溶解，前者滴加到後者的緩衝液中，4°C下溫和攪拌4h，透析純化後凍幹， 得DSPE-PEG-NGF。以DSPE-PEG-NGF為膜材一部分，用實例1或其他常規方法製備脂質體。實例3用實例1方法製備不含活性脂的普通長循環脂質體，用實例2方法製備 DSPE-PEG-NGFJf 2者混合孵育，利用疏水性後者插入前者脂質體的雙分子層中。實例 4稱取DSPE-PEG-BTC 和 NGF，[二者者摩爾比 O 5) 1]，分別以 4°C HEPES 緩衝液(0. Immol/mL)溶解，前者滴入後者緩衝液中，於4°C緩慢攪拌4h，用TLC或HPLC 跟蹤反應，直到NGF完全消失，加入過量的甘氨酸經止反應，產物經透析純化凍幹得 DSPE-PEG-NGF。稱取大豆磷脂，膽固醇，DSPE-PEG，DSPE-PEG-NGF(摩爾的比20 10 1 1)，溶於氯仿後，37°C旋轉減壓蒸發成膜，用硫酸銨緩衝液(123mm0l/L，pH5. 4)渦旋振蕩，水溶超聲，反覆擠壓過200nm聚碳酯膜，即得。包封率可達80%以上。
權利要求
1.一種高包封率長循環脂質體製劑的製備方法，其特性在於將NGF與脂質體活性膜材聯結後，與其他脂質體成份用常規方法製成長循環脂質體。
2.一種高包封率長循環脂質體製劑的製備方法，其特性在於將脂質體活性膜材與脂質體其他成分一起用常規方法製成長循環脂質體，加入NGF與活性膜材反應聯結。
3.一種高包封率長循環脂質體製劑的製備方法，其特性在於以常規方法製成長循環脂質體，將NGF與脂質體活性膜材反應聯結，將二者加到一起孵育，利用疏水作用，將後者插入到脂質體雙分子層中。
4.根據權利要求1或2或3所述的一種高包封率長循環脂質體製劑的製備方法，其特徵在於所述長循環脂質體的常規製備方法是成膜法、反向蒸發法、復乳法、注入法、熔融法、冷凍乾燥法和離心法。
5.根據權利要求1或2或3所述的一種高包封率長循環脂質體製劑的製備方法，其特徵在於所述脂質體活性膜材是DSPE-PEG-MAL、DSPE-PEG-SC、DSPE-PEG-BTC，其中PEG平均分子量是2，000 6，000。
6.根據權利要求5所述的一種高包封率長循環脂質體製劑的製備方法，其特徵在於 所述脂質體的常規其他成份是磷脂、膽固醇或各種表面活性劑。
7.根據權利要求1或2或3所述的一種高包封率長循環脂質體製劑的製備方法，其特徵在於所述方法中添加凍幹支持劑，通過常規凍幹工藝製成前體脂質體。
8.根據權利要求1或2或3所述的一種高包封率長循環脂質體製劑的製備方法，其特徵在於所述方法中添加抗氧化劑和其他具有穩定作用或影響釋放性能的助劑。
9.根據權利要求1至8中任何一項所述的方法製備的一種高包封率長循環脂質體製劑，其特徵在於所述製劑為靜脈注射製劑、皮下注射製劑、肌肉注射製劑、髓鞘內注射製劑、呼吸道吸入製劑、口服製劑和外用製劑。
全文摘要
本發明涉及高包封率長效神經生長因子脂質體，屬於蛋白多肽類藥物技術領域。一種高包封率長循環脂質體製劑的製備方法，將NGF與脂質體活性膜材聯結後，與其他脂質體成份用常規方法製成長循環脂質體。本發明的優點是本發明通過NGF分子中的-SH，-NH2與脂質體特殊活性膜材-活性脂鍵合，大大提高了包封率，在活性酯中長鏈PEG保護下提高體內穩定性，解決NGF應用的關鍵問題。
文檔編號A61K38/18GK102485214SQ200910250359
公開日2012年6月6日 申請日期2009年12月4日 優先權日2009年12月4日
發明者於彬, 陳春園, 陳春在, 陳騏 申請人:李曉為, 陳春園