棉花nodulin-like基因的一個耐鹽、耐旱新功能及其應用的製作方法

2023-05-11 00:46:01

專利名稱：棉花nodulin-like基因的一個耐鹽、耐旱新功能及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及植物中與抗脅迫相關的基因及其編碼產物與應用，特別涉及棉花中一 個耐鹽、耐旱基因及其編碼產物與其在培育耐鹽、耐旱性提高植物中的應用。
背景技術：
結瘤素基因是根瘤菌與豆科植物共生固氮過程中寄主植物特異表達的基因，參與 調控根瘤的生長、發育和形成，在共生結瘤固氮過程中起重要作用。其功能主要包括水分 子及甘油、甲醯胺等中性分子的跨膜運輸功能；參與細胞分化和細胞壁再生；組織發生和 信號轉導功能以及參與滲透脅迫的響應過程。隨著研究的深入，人們從非豆科植物中也分 離克隆到了與豆科植物結瘤素基因同源的類結瘤素基因，這些基因的功能有的與豆科植物 結瘤素基因相似，有的則在表達模式和功能上均有很大的不同，其中類結瘤素基因能否參 與滲透脅迫的響應過程，在逆境中起怎樣的作用受到了人們的廣泛關注。

發明內容
本發明的目的是提供棉花nodulin-like基因的一個新的耐鹽、耐旱功能。本發明所提供的耐鹽、耐旱基因是genebank中公布的棉花nodulin-like基因，登 錄號為AY217332本發明所提供的棉花nodulin-like基因的耐鹽、耐旱性功能將在培育抗逆性和 耐逆性增強的植物(特別是棉花)中發揮重要作用。


圖1為RT-PCR擴增棉花nodulin-like eDNA的瓊脂糖凝膠檢測結果圖2為轉棉花nodulin-like基因擬南芥PCR鑑定結果圖3為轉棉花nodulin-like基因擬南芥RT-PCR鑑定結果圖4為轉棉花nodulin-like基因擬南芥鹽脅迫處理後的表型圖5為轉棉花nodulin-like基因擬南芥鹽脅迫處理後的存活率圖6為轉棉花nodulin-like基因擬南芥乾旱脅迫處理後的表型圖7為轉棉花nodulin-like基因擬南芥乾旱脅迫處理後的存活率
具體實施例方式下述實施例中所有方法如無特別說明均為常規方法。實施例1、棉花nodulin-like基因的克隆根據genebank提供的序列設計引物上遊引物5，_GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATTTCATAAGTGTCTTTTCTCTTCCTTTG-3，下遊引物5，_
3
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTGAGGAAAGAAAGATTATTATTAATAATAG-3，(帶下劃線部分鹼基為重組序列)
以Y18幼蕾總RNA為模板，RT-PCR擴增棉花nodulin_like cDNA序列具體方法 包括以下步驟1、總RNA的提取1)將0. 2g冷凍的材料放入預冷的研缽中，研磨成粉狀，倒入2mL離心管中，加ImL 預熱至80°C的基本提取液，10 μ 1 DTT貯備液和25 μ 1蛋白酶K貯備液，混勻；2) 420C，IOOrpm,溫和搖動 90 分鐘；3)每管加入80 μ 1 2mol/L KCl溶液，調整KCl終濃度至160mmol/L，冰浴1小時；4) 12，OOOrpm 離心 20 分鐘，取 900 μ 1 上清液，加入 300 μ 1 8mol/L LiCl，混勻，冰 上過夜沉澱；5) 12，OOOrpm離心20分鐘，棄上清，沉澱用2mol/L LiCl (冰預冷)洗2 3次，直
至上清液無色；6)懸浮 LiCl-RNA 沉澱於 400 μ 1 10mmol/L Tris-Cl (ρΗ7· 5)，混勻，12，OOOrpm 離 心10分鐘，轉移上清至新離心管中；7)加入1/10體積的2mol/L KAc (ρΗ5· 5)，混勻，冰浴15分鐘；8) 12，OOOrpm離心10分鐘，除去鹽不溶性物質，取上清； 9)用2. 5倍體積的無水乙醇於-20 V沉澱過夜或-70 V沉澱2 3小時；10)用70%冷乙醇洗滌RNA沉澱，真空快速乾燥，溶於DEPC水中；11)力卩 RNase-Free DNase，37 °C，30 分鐘；12)加等體積的氯仿異戊醇抽提；13)用2. 5倍體積的無水乙醇於_20°C沉澱過夜或_70°C沉澱2 3小時；14)用70%乙醇洗滌沉澱，乾燥；15)將RNA溶於DEPC處理的水中備用。2、第一鏈cNDA的合成用東洋紡公司的ReverTra Ace- α -反轉錄酶試劑盒，按試 劑盒說明書進行操作反應體系RNA (1-5 μ g)11. 0μ 1RNase Inhibitor (IOU/μ 1)1·0μ15 X RT buffer4. 0 μ 1dNTP Mixture(IOmmo1/L each) 2. 0 μ 101igo(dT)20(10pmol/y 1)1·0μ1ReverTra Ace1·0μ1_total20. 0μ 1反應條件42°C，20min；99°C，5min ；4°C，5min ；瞬間離心，-20°C保存。3、RT-PCR 擴增 cDNAPCR反應體系cDNA1. 0μ 1反應buffer (10Χ)5. 0 μ 1
dNTP(2. 5mmol/L each) 4. 0 μ 1上遊引物(10μ Μ)1. 0μ 1下遊引物(10μ Μ)1. Ομ 1Taq 酶(2· 5υ/μ 1)1. 25μ 1ddH2036. 75 μ 1_total50. Ομ 1反應條件:95°C,5min；95°C，30 秒；55°C，45 秒；72°C，2min30s ；35 個循環；72°C, 5min ；4°C,pause。反應結束後，對PCR產物進行0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果如圖1所示 (泳道M為marker,泳道1為棉花nodulin-like RT-PCR產物)得到分子量約為1. 5kb的 條帶，與預期結果相符。用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(北京天根公司)回收該片段，然後將該 回收片段與pMD18-T(KAKARA公司)載體進行連接。連接體系PCR 回收產物3·0μ1pMD18-T1. 0μ 1Τ4 DNA Ligase1. 0μ 1反應buffer (10Χ) 1. 0μ 1ddH204· 0 μ 1_total10. 0μ 116 °C保溫過夜。用上述連接產物轉化大腸桿菌T0P10感受態。將重組體系加入感受態細胞溶液 中，輕輕混勻，置冰上30分鐘。在42 °C下熱激處理90秒，立即置冰上，冰浴2分鐘。加入 500 μ 1 LB液體培養基，37°C搖床180rp m，培養45分鐘，然後塗布在有氨苄青黴素(50mg/ L)的LB固體培養基上，倒置培養37°C過夜，篩選陽性克隆，得到重組質粒命名為T-NL。以 該載體上的M13-47和M13-48啟動子序列為引物對其進行核苷酸序列測定，測序結果表明 與genebank上提交的棉花的nodulin-like基因的mRNA(登錄號AY217332)在第373和 1030位上不同，兩個位點均是「G」替換了 「A」，但將核酸序列翻譯成胺基酸序列，通過序列 比對，發現與NCBI上提交的蛋白序列(登陸號AA060108. 1)完全一致。實施例2、棉花nodulin-like植物表達載體的構建利用Invitrogen公司的GATEWAY系統構建植物表達載體，將實施例1中的T-NL 與入門載體PD0NR211進行BP重組反應，將nodulin-like cDNA重組到pD0NR211上。BP重組體系T-NL 質粒(50 IOOng) 1. 0 μ 1pD0N0R221 (30 50ng) 0. 5 μ 1BP enzyme Mix1. 0μ 1ddH202. 5 μ 1_
total5· 0 μ 125°C保溫 1 小時，力卩 1 μ 1 Proteinase K, 37°C，IOmin 終止反應。將重組產物轉化 大腸桿菌T0P10感受態，經卡那篩選得到陽性克隆，將重組子命 名為 pD0NR211-NL。提取陽性克隆質粒pD0NR211-NL，利用LR重組反應將nodulin-like片段重組到植 物表達載體PH7WG2上。LR重組體系pD0N0R221-NL 質粒(50 IOOng) 1. 0 μ 1pH7WG2 (30 50ng)0. 5 μ 1LR enzyme Mix0. 5 μ 1ddH200. 5 μ 1_total2. 5 μ 125°C保溫 1 小時，力卩 1 μ 1 Proteinase K, 37°C，IOmin 終止反應。用上述重組體系轉化大腸桿菌T0P10感受態，經壯觀黴素篩選得到陽性克隆，將 重組子命名為PH7WG2-NL。實施例3、棉花nodulin-like轉基因擬南芥的篩選與獲得1、棉花nodulin-like植物表達載體轉化擬南芥用gene pulser Xcell電轉儀(美國Bio Rad公司)並參照說明書進行操作，將 質粒pH7WG2-NL用電擊轉化法轉化農桿菌LBA4404，經含利福平和壯觀黴素的抗性平板進 行篩選得到農桿菌陽性克隆，再利用蘸花法，在上述陽性克隆農桿菌的介導下將PH7WG2-NL 轉化擬南芥。2、抗性篩選轉基因植株蘸花法轉化後收到的種子，消毒後種於含有潮黴素(20mg/L)抗性的1/2MS培養基 上篩選陽性苗。待平板上的陽性苗長出四片真葉時可將其移至土中，蓋上保鮮膜保水兩天 後揭去，培養到幼苗長出8-10片真葉且較粗壯時可剪取葉片，提基因組DNA鑑定是否為轉 基因株系，鑑定正確的轉基因株系記為Tl代轉基因材料。3、轉基因擬南芥的PCR鑑定1)基因組DNA的提取Edwards 提取緩衝液200mmol/L Tris-Cl (ρΗ 7. 5)，250mmol/L NaCl, 25mmol/L EDTA,0. 5% SDS取1-2片小葉片放入EP管中；加入^OylEdwards提取緩衝液研磨，室溫下 12，OOOrpm離心10分鐘。將上清液逐滴加入等體積的異丙醇中(約350 μ 1)，_20°C放置20 分鐘；室溫下14，OOOrpm離心10分鐘；倒掉上清，沉澱用70%乙醇洗滌2次；將DNA吹乾， 加入 40 μ 1 ddH20, 37°C溶解 DNA2)轉基因植株的PCR鑑定以步驟1基因組DNA為模板，在上遊引物5，-TGCCCAGCTATCTGTCACTTCATC-3， 和下遊引物5 』 -AATTGGCATGGTGAGCTTAGGC-3 』的引導下，用PCR的方法對轉基因植株進 行鑑定，其中上遊引物根據植物表達載體PH7WG2 35啟動子序列設計，下遊引物根據棉花nodulin--like cDNA序列設計。
PCR反應體系
基因組DNA1. 0μ 1
反應 buffer (10X)2. 0μ 1
dNTP(2. 5mmol/L each)1. 6μ 1
上遊引物(10 μ Μ)0. 5μ 1
下遊引物( ο μ Μ)0. 5μ 1
Taq 酶(2. 5U/y 1)0. 5μ 1
dd H2O13. 9μ 1
total20. 0μ 1
反應條件:95°C,5min ；95°C，30 秒；58°C，45 秒；72°C，2min30s ；35 個循環；72°C,5min ；4°C,pause。
反應結束後，對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果如圖2所示(泳
道M為marker，泳道1_5為不同的轉基因株系，泳道6為野生型植株，泳道7為陽性質粒，泳 道8為陰性水對照)所有轉基因株系擴增出約SOObp的條帶，且與陽性質粒擴增條帶大小 一致，與預期大小相符，而野生型則沒有擴增條帶，表明目的基因成功轉入擬南芥中。3)轉基因植株的RT-PCR鑑定分別提取步驟2所用的野生型和5個轉基因株系的葉子的總RNA，各取2 μ g總RNA 進行反轉錄，RNA提取參考蓋寧公司的EASY spin植物RNA快速提取試劑盒，反轉錄參考實 施例1中的方法。以此反轉錄產物為模板，在棉花nodulin-like cDNA特異引物(上遊引 物TGCCAGCAGCCACATTTCTC ；下遊引物GGATGCACCATGACATTACGC。)引導下進行 RT-PCR 檢 測(以Actin2為內標)。PCR反應體系
cDNA1. 0μ 1
反應 buffer (10Χ)5. 0μ 1
dNTP(2. 5mmol/L each)4. 0μ 1
上遊引物(10 μ Μ)1. 0μ 1
下遊引物( ο μ Μ)1. 0μ 1
Taq 酶(2. 5U/y 1)1. 25μ 1
ddH2036. 75 μ 1_total50. 0μ 1反應條件95°C，5min；95°C,30 秒；58°C，30 秒；72°C，30 秒；30 個循環；72°C， 5min ；4°C，pause。反應結束後，對PCR產物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果如圖3 所示(泳道1-5為不同轉基因株系，泳道6為野生型株系)，所用轉基因株系都擴增出了清 晰的nodulin-like條帶，而野生型沒有，說明nodulin-like以成功轉入擬南芥中。實施例4、鹽脅迫處理後的轉棉花nodulin-like基因擬南芥的表型種子表面消毒後均勻的撒在V2MS平板，4°C避光春化2 3d，放入光照培養箱中生長(22°C，16h/光照8h黑暗，光強 4000LUX)。約3 4d後將小苗移到含200mmol/LNaCl鹽平板上。6 7d後統計植株的存活率，以整株植株發白為死亡標準。表型觀察如圖 4所示，在200mmol/L鹽平板上，轉nodulin-like基因植株存活率高於野生型。在200mmol/ L鹽平板上轉基因植株與野生型植株存活率統計結果圖5所示，經過三次處理，其中三個轉 基因株系的存活率平均值分別為64. 57%,76. 90%和67. 77%，而野生型植株的存活率為 38.67%。以上結果表明轉基因株系表現出對鹽的耐受性。實施例5、乾旱脅迫處理後的轉棉花nodulin-like基因擬南芥的表型種子消毒後4°C春化3d，正常培養約7d左右，選長勢比較一致的小苗移移至人工 土壤(營養土 蛭石=1 1)，每隔3 5d澆水，讓土壤保持溼潤，停水進行抗旱處理之 前，野生型與轉基因植株處於同一生長狀態，如圖6A所示。停水，進行極端處理，直至所有 植株均發生萎蔫。復水後野生型植株大部分變黃死亡，而轉棉花nodulin-like基因植株小 部分變黃死亡，一部分蓮座葉變黃，但不影響正常生長，如圖6B。復水2周後統計存活率如 圖7，重複三次，三個轉棉花nodulin-like基因株系的平均存活率分別為65. 9%、72. 6% 和68. 1%，而野生型的存活率僅為23.7%。轉基因株系的復水存活率分別為野生型對照的 2. 8倍，3. 1倍，2. 9倍，可見轉基因株系對乾旱的耐受性強於野生型植株。
權利要求
棉花nodulin like耐鹽、耐旱性基因，genebank登錄號為AY217332。
2.權利要求1所述的棉花nodulin-like耐鹽、耐旱性基因編碼的蛋白，其genebank登 錄號為AA060108。
3.含有權利要求1或2所述耐鹽、耐旱基因的表達載體。
4.含有權利要求1或2所述耐鹽、耐旱基因的轉基因細胞系。
5.含有權利要求1或2所述耐鹽、耐旱基因的宿主菌。
6.一種培育耐鹽、耐旱植物的方法是利用植物表達載體將權利要求1或2所述耐鹽、耐 旱基因導入植物細胞，獲得對高鹽、乾旱耐受能力增強的轉基因細胞系及轉基因植株。
7.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於所述被轉化的宿主植物為水稻、小麥、棉 花、玉米、擬南芥、油菜或大豆。
全文摘要
本發明公開了棉花nodulin-like基因，genebank登陸號為AY217332及其編碼的蛋白，genebank登錄號為AAO60108的新功能為該基因具有耐鹽、耐旱性。通過農桿菌介導法將棉花nodulin-like基因轉化擬南芥，轉基因植株的耐鹽性和耐旱性與野生型相比均增加，本發明的基因將在培育耐鹽、耐旱性增強的作物中發揮重要作用。
文檔編號C12N15/82GK101942448SQ20091015750
公開日2011年1月12日 申請日期2009年7月10日 優先權日2009年7月10日
發明者孫書琦, 張銳, 郭三堆 申請人:中國農業科學院生物技術研究所;郭三堆