一種驗證cidec基因5端調控區單核苷酸多態性位點遺傳效應的方法與應用的製作方法

2023-05-02 13:17:31

專利名稱：一種驗證cidec基因5端調控區單核苷酸多態性位點遺傳效應的方法與應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於分子遺傳學領域，涉及基因單核苷酸多態性(SNP)位點遺傳效應的驗證方法與應用，特別涉及一種驗證黃牛CIDEC基因單核苷酸多態性位點遺傳效應的驗證方法。
背景技術：
SNP是基因組上的單個核苷酸的變異所形成的遺傳標記，基因組上的SNP數量多，而且多態性豐富。據研究SNP在基因組中分別相當廣泛，人類基因組中每300個鹼基對就出現一次。SNP可以分為單個核苷酸的置換、顛換、缺失和插入。從對生物的遺傳性狀的影響的分子機制上來看，SNP又可分為2種:一種是同義cSNP (synonymousc SNP),即SNP所致的編碼序列的改變並不影響其所翻譯的蛋白質的胺基酸序列，突變鹼基與未突變鹼基的含義相同；另一種是非同義cSNP(non-synonymousc SNP),指鹼基序列的改變可使以其為藍本翻譯的蛋白質序列發生改變，從而影響了蛋白質的功能，這種改變常是導致生物性狀改變的直接原因，cSNP中約有一半為非同義cSNP。錯義SNP功能分析的一個重要問題是預測一個特定的錯義SNP是否是有害的，一般採用一系列離散或連續的特徵來構造預測模型，包括SNP位點的胺基酸物理和化學特徵，SNP位點和附近區域的序列保守性，蛋白質結構特徵，進化特徵等，這些特徵可大致分為基於序列的和基於結構的。同義SNP雖然不改變基因編碼的蛋白質序列，但其也具有重要的作用，特別在影響基因外顯子剪切方面。按照SNP在基因組上的位置不同又可以將SNP分為以下幾類:大約有95%的SNP位於非編碼區，其中有一小部分位於基因調控區的SNP位點成為調控SNP (rSNP);而存在於基因編碼區的SNP位點稱為編碼SNP (cSNP).目前對編碼區SNP研究比較多，對於非編碼區的SNP，雖然其功能研究意義重大，但是該區域的SNP數據難以收集，所以沒有得到和編碼區SNP的研究那樣的重視。而本專利以CIDEC基 因為例提供了一種新的驗證位於非編碼區SNP遺傳效應的思路。CIDEC基因屬於CIDE家族，該家族成員還有CIDEA和CIDEB。該家族成員序列有高度同源性，它們都包含一個CIDE氮端結構域和一個CIDE碳端結構域。以前的研究結果認為CIDE家族成員與胰島素誘導的細胞凋亡有關，近些年來很多研究證明CIDE家族也參與了很多重要代謝過程的調控，例如肥胖。尤其是CIDEC基因，在小鼠上該基因也叫脂肪特異蛋白27 (Fsp27)，該基因對於單房性脂滴的形成和白色脂肪組織的能量儲存非常重要。Fsp27敲除小鼠表現出由於高能量消耗引起的消瘦體型，同時這些小鼠還表現出抵抗飲食誘導性肥胖和胰島素抵抗。一個女性患者CIDEC基因碳端的突變導致其患有脂肪代謝障礙綜合症。從這些研究可以推測出CIDEC基因可能對牛的脂肪代謝也很重要，尤其是對牛肉的肌間脂肪沉積有重要作用。我們經過試驗也驗證了這個推測，我們在牛CIDEC基因5端調控區發現了 10個SNP突變位點，這10個多態位點在213頭的南陽牛群體中共形成了 9種單倍型，經與南陽牛體重和日增重進行關聯分析發現，不同單倍型與南陽牛18月齡體重和日增重顯著相關，差異極顯著。本專利描述了一種驗證CIDEC基因5端SNP位點遺傳效應的新思路，以便促進中國黃牛肉用生長性狀的標記輔助選擇(MAS)，快速建立遺傳資源優良的黃牛種群。

發明內容
本發明解決的問題在於通過CIDEC基因不同單倍型所顯示的不同活性來驗證它們與黃牛生長性狀的關聯分析結果，進一步驗證其是否可以作為黃牛分子育種中輔助選擇的分子標記，從而加快良種選育速度。本發明是通過以下技術方案來實現:黃牛CIDEC 基因(AC_000179.1) 5 端調控區有十處 SNP 位點:g.-501G>A;-546T>C;-643T>G; -714T>C; -727C>T; -762C>T; -763C>T; _841T>C; _956G>A; -974C>T,這十處 SNP 位點在南陽牛群體中共形成了 9種單倍型，其中單倍型5，6，7頻率過低，所以在轉錄活性分析中只分析了單倍型1，2，3，4，8，9六種。黃牛CIDEC基因不同單倍型轉錄活性的檢測方法包括以下步驟:(I)、以包含CIDEC基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，使用引物P來擴增黃牛CIDEC基因不同單倍型；(2)、對步驟(I)的擴增產物進行PCR產物的切膠回收及純化；(3)用限制性內切酶KpnI和XhoI分別消化步驟(2)的純化產物和螢光素酶報告基因載體pGL3_Basic質粒；(4)步驟(3)中的消化產物經切膠回收及純化；
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(5)使用T4DNA連接酶將步驟(4)中的純化產物進行連接；(6)將步驟(5)中的連接產物轉化ToplO大腸桿菌感受態細胞中，挑取的單克隆通過菌液PCR、雙酶切鑑定以及測序三重驗證；(7)將步驟(6)中連接正確的質粒轉入3T3-L1前脂肪細胞系中，48小時以後使用雙螢光報告系統試劑盒測定不同單倍型的轉錄活性；(8)將步驟(7)中的不同單倍型轉錄活性與其與生產性狀的關聯分析結果進行比對，達到驗證關聯分析結果的目的。(9)將包含十個突變序列的相應CIDEC片段輸入Genomatix資料庫(http://www.genomatix.de),搜索識別序列包含或臨近這十個突變位點的順式作用元件。從順式作用元件與其對應的轉錄因子水平解釋關聯分析結果。如上述技術方案所述的黃牛CIDEC基因不同單倍型轉錄活性的檢測方法，其中，步驟(I)所述的引物對P為:上遊引物:cggggtacctgggaacaggagaacatttcag 3Ibp ；下遊引物:ccgctcgagacaagatgccaaggtgacttaca 32bp0所述的PCR擴增反應程序為:94°C預變性 5min ;30 個循環 94°C變性 30s，65°C退火 30s，72°C延伸 60s ;72°C延伸lOmin。如上述技術方案所述的黃牛CIDEC基因不同單倍型轉錄活性的檢測方法，其中，步驟(2)、(4)所述的瓊脂糖凝膠的質量濃度為1.5%。
如上述技術方案所述的黃牛CIDEC基因不同單倍型轉錄活性的檢測方法，其中，步驟(3)所述的酶切體系為:KpnI和XhoI各5 μ L，IOXBuffer MlO μ L，純化產物或pGL3-Basic載體質粒〈5 μ g,超純水補至100 μ L。如上述技術方案所述的黃牛CIDEC基因不同單倍型轉錄活性的檢測方法，其中，步驟(5)所述的連接體系為:10XT4DNA Ligase Bufferl μ L, DNA 片段 XyL，pGL3_Basic載體(約50叩/^1^)1口1^，T4DNA Ligase (3U/μ L) I μ L，加超純水至10 μ L，其中載體與目的片段的摩爾比控制在1:3-1:8。如上述技術方案所述的黃牛CIDEC基因不同單倍型轉錄活性的檢測方法，其中，步驟(6)所述的菌液PCR所使用的引物和擴增條件與步驟(I)中的一樣，步驟(6)所述的雙酶切體系為:KpnI和XhoI各I μ L，IOXBuffer Ml μ L，連接產物質粒〈0.5 μ g，超純水補至10 μ L0如上述技術方案所述的黃牛CIDEC基因不同單倍型轉錄活性的檢測方法，其中，步驟(7)所述的轉染體系為:385ng不同單倍型載體，15ng內參質粒載體pRL_TK, I μ L脂質體2000，60 μ L無血清DMEM培養基。


圖1為黃牛CIDEC基因PCR產物電泳圖；圖2為黃牛pGL3-Basic_CIDEC系列表達載體雙酶切鑑定圖；圖3為黃牛pGL3-Basic_CIDEC系列表達載體菌液PCR檢測圖；圖4牛CIDEC基因不同 單倍型轉錄活性示意圖。將不同單倍型(BtCIDEC_Hl，BtCIDEC-H2, BtCIDEC-H3, BtCIDEC_H4，BtCIDEC_H8 和 BtCIDEC_H9)轉染小鼠 3T3-L1 細胞後測定螢光素酶活性。使用螢火蟲螢光素酶和海腎螢光素酶的比值來表示單倍型的相對轉錄活性。誤差棒表示平均值的標準誤差(SE)。
具體實施例方式為使本發明的技術方案便於理解，以下結合具體實施例對本發明作進一步的說明。本發明通過PCR擴增得到黃牛CIDEC基因不同單倍型，擴增產物通過純化、酶切後連接到螢光素酶報告基因載體pGL3-Basic上，代表不同單倍型的連接產物轉染到3T3-L1細胞中，通過雙螢光報告系統試劑盒測定不同單倍型的轉錄活性，通過與關聯分析結果進行比對，達到驗證關聯分析結果的目的。下面結合對本發明做進一步的詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。1、CIDEC基因不同單倍型的擴增及真核表達載體的構建1.1黃牛CIDEC基因不同單倍型的擴增以包含CIDEC基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，使用引物P來擴增黃牛CIDEC基因不同單倍型(具體單倍型信息如表I)。表1.南陽牛CIDEC基因10個SNPs的單倍型及其頻率
權利要求
1.黃牛CIDEC 基因(AC_000179.1 )5 端調控區有十處 SNP 位點:g.-501G>A;-546T>C;-643T>G; -714T>C; -727C>T; -762C>T; -763C>T; _841T>C; _956G>A; -974C>T,這十處 SNP 位點在南陽牛群體中共形成了九種單倍型，其中單倍型5，6，7頻率過低，所以在轉錄活性分析中只分析了單倍型1，2，3，4，8，9六種。
2.黃牛CIDEC基因不同單倍型轉錄活性的檢測方法包括以下步驟: (1)以包含CIDEC基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，使用引物P來擴增黃牛CIDEC基因不同單倍型； (2)對步驟(I)的擴增產物進行PCR產物的切膠回收及純化； (3)用限制性內切酶KpnI和XhoI分別消化步驟(2)的純化產物和螢光素酶報告基因載體pGL3_Basic質粒； (4)將步驟(3)中的消化產物經切膠回收及純化； (5)使用T4DNA連接酶將步驟(4)中的純化產物進行連接； (6)將步驟(5)中的連接產物轉化ToplO大腸桿菌感受態細胞中，挑取的單克隆通過菌液PCR、雙酶切鑑定以及測序三重驗證； (7)將步驟(6)中連接正確的質粒轉入3T3-L1前脂肪細胞系中，48小時以後使用雙螢光報告系統試劑盒測定不同單倍型的轉錄活性； (8)將步驟(7)中的不同單倍型轉錄活性與其與生產性狀的關聯分析結果進行比對，從轉錄活性水平解釋關聯分析結果 。
(9)將包含十個突變序列的相應CIDEC片段輸入Genomatix資料庫(http://www.genomatix.de),搜索識別序列包含或臨近這十個突變位點的順式作用元件。從順式作用元件與其對應的轉錄因子水平解釋關聯分析結果。
如上述技術方案所述的黃牛CIDEC基因不同單倍型轉錄活性的檢測方法，其中，步驟(I)所述的引物對P為: 上遊弓I物:cggggtacctgggaacaggagaacatttcag 31bp ； 下遊弓I物:ccgctcgagacaagatgccaaggtgacttaca 32bp0 所述的PCR擴增反應程序為: 94°C預變性5min ；30個循環94°C變性30s，65 °C退火30s，72 °C延伸60s ;72°C延伸lOmin。
3.如上述技術方案所述的黃牛CIDEC基因不同單倍型轉錄活性的檢測方法，其中，步驟(2)、(4)所述的瓊脂糖凝膠的質量濃度為1.5%。
4.如上述技術方案所述的黃牛CIDEC基因不同單倍型轉錄活性的檢測方法，其中，步驟(3)所述的酶切體系為:KpnI和XhoI各5yL，IOXBuffer MlOyL,純化產物或pGL3-Basic載體質粒〈5 μ g,超純水補至100 μ L。
5.如上述技術方案所述的黃牛CIDEC基因不同單倍型轉錄活性的檢測方法，其中，步驟(5)所述的連接體系為:10XT4DNALigaseBufferl μ L，DNA 片段 Χμ L，pGL3_Basic 載體(約50ng/yL) lyL，T4DNA連接酶(3U/μ L) I μ L，加超純水至10 μ L，其中載體與目的片段的摩爾比控制在1:3-1:8。
6.如上述技術方案所述的黃牛CIDEC基因不同單倍型轉錄活性的檢測方法，其中，步驟(6)所述的菌液PCR所使用的引物和擴增條件與步驟(I)中的一樣，步驟(6)所述的雙酶切體系為:KpnI和XhoI各I μ L，IOXBuffer Ml μ L，連接產物質粒〈0.5 μ g，超純水補至10 μ L0
7.如上述技術方案所述的黃牛CIDEC基因不同單倍型轉錄活性的檢測方法，其中，步驟(7)所述的轉染體系為:385ng不同單倍型載體，15ng內參質粒載體pRL_TK，I μ L脂質體2000,60 μ L無血清DMEM培 養基。
全文摘要
本發明公開了一種驗證黃牛CIDEC基因SNPs位點遺傳效應的方法，以包含CIDEC基因的黃牛全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增黃牛CIDEC基因不同單倍型；用限制性內切酶KpnI和XhoI分別消化PCR擴增產物和pGL3-Basic空載體後，再使用DNA連接酶將不同單倍型連接到pGL3-Basic載體上，構建pGL3-Basic-CIDEC-H1、H2、H3、H4、H8、H9表達載體，將構建成功的表達載體轉染至3T3-L1細胞中，使用雙螢光報告系統試劑盒檢測不同單倍型的轉錄活性。綜合不同單倍型的轉錄活性，以及SNP位點改變順式作用元件的信息來驗證關聯分析結果。本發明提供的檢測方法為驗證CIDEC基因的單核苷酸多態性遺傳效應奠定了基礎，以便用於中國黃牛肉用生長性狀的標記輔助選擇(MAS)，快速建立遺傳資源優良的黃牛種群。
文檔編號C12Q1/68GK103243156SQ20131000390
公開日2013年8月14日 申請日期2013年1月6日 優先權日2013年1月6日
發明者陳宏 , 王璟, 滑留帥, 潘虹, 曹修凱, 藍賢勇, 胡沈榮, 雷初超 申請人:西北農林科技大學