貝萊斯芽孢桿菌JS25R及其應用的製作方法
2023-06-12 23:40:51
本發明涉及微生物學和植物病害生防技術領域，具體地說，涉及一株貝萊斯芽孢桿菌js25r及其應用。
背景技術：
禾穀鐮刀菌(fusariumgraminearum)是禾本科作物的重要病原菌之一，可引起麥類赤黴病(fusariumheadblight，fhb)，禾穀鐮刀菌為限制小麥產量的一個主要因素(dubin,1997)。我國氣候條件十分有利於麥類赤黴病的發生，長江中下遊地區常年病害造成產量損失10％-15％，大流行年份減產近50％。由於全球氣候變暖以及秸稈還田、免耕栽培等耕作制度改變的影響，我國麥類赤黴病的發生區域由長江流域迅速向西北、華北擴展，特別是在2008、2010和2012年，全國麥類赤黴病發生十分嚴重，造成了嚴重的產糧損失和不良的社會影響，嚴重威脅我國糧食安全。
禾穀鐮刀菌產生的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(don，3,7,15三羥基-12,13環氧單端孢黴-9烯-8酮)是存在於赤黴病菌感染麥粒中的主要天然毒素之一。don已被認定為最危險的自然發生食品汙染物之一，被列入國際研究的優先地位。don可致人免疫力下降、貧血、頭痛、腹痛、噁心；致動物拒食、生長延滯和流產(rochaetal.,2005；sobrovaetal.,2010；pestka,2010)。don廣泛存在並大量汙染小麥及其製品，對人畜構成很大危害，嚴重威脅我國食品安全。因此，加強禾穀鐮刀菌防控研究已成為保障我國糧食安全和食品安全的迫切需求。
多年來對麥類赤黴病防治主要依靠化學農藥，但隨著化學農藥帶來的環境問題，加之多年用藥已導致病原菌抗藥性禾穀鐮刀菌菌株的出現，使防治難度加大。雖然在赤黴病抗性品質方面國內外投入大量的精力開展相關研究，但至今尚無理想的高抗小麥品種(李正輝等，2007)。
生物防治不僅可降低對環境的影響，還不易產生抗藥性，相關理論和技術的研究日益為人們所關注。貝萊斯芽孢桿菌營養簡單，在自然界中廣泛存在,對人畜無毒無害,不汙染環境,能產生多種抗菌素和酶,具有廣譜抗菌活性和極強的抗逆能力，較其他微生物更具有開發為生物防控菌劑的潛力。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一株貝萊斯芽孢桿菌js25r及其在生物防治由鐮刀菌引起的植物病害中的應用。
本發明從江蘇採集的小麥病穗中分離純化出對禾穀鐮刀菌拮抗能力強的一株菌命名為js25r，根據其菌落和菌體形態特徵，生理生化特性以及16srdna序列分析，鑑定其為貝萊斯芽孢桿菌(bacillusvelezensis)。菌株js25r現已保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101，保藏編號cgmccno.14240，保藏日期2017年6月13日。
本發明還提供所述的貝萊斯芽孢桿菌js25r在生物防治由鐮刀菌引起的植物病害中的應用。
本發明所述鐮刀菌為禾穀鐮刀菌(f.graminearum)。所述病害為赤黴病或穗腐病或根腐病。所述植物為穀物，所述穀物為小麥或玉米，優選小麥。
在本發明的一個具體實施方式中，驗證了貝萊斯芽孢桿菌js25r在減輕由禾穀鐮刀菌(f.graminearum)j07引起的小麥品種『石新828』赤黴病病害中的作用。
本發明還提供含有所述貝萊斯芽孢桿菌js25r的微生物菌劑。
本發明還提供所述貝萊斯芽孢桿菌js25r或所述菌劑在製備防治由鐮刀菌引起的植物病害的藥物中的應用。
本發明還提供一種含有所述貝萊斯芽孢桿菌js25r或所述菌劑的用於防治由鐮刀菌引起的植物病害的藥物。
所述藥物可按如下方法製備得到：
通過常規的液體後固體培養，獲得包括細菌菌體培養物，通過常規的液體發酵生產，加入表面活性劑如分散劑、穩定劑、溼潤劑、粘結劑、消泡劑、崩解劑、抗凍劑等中的一種或幾種，或吸附載體按一定比例混合後，製備成可溼性粉劑、水分散粒劑、懸浮劑、懸乳劑、水乳劑或微乳劑。
本發明還提供所述貝萊斯芽孢桿菌js25r或所述菌劑在製備農用復混肥中的應用。
本發明進一步提供一種農用復混肥，其由含有所述貝萊斯芽孢桿菌js25r的微生物菌劑，與氮肥、磷肥、鉀肥或複合肥組成。
利用本發明的貝萊斯芽孢桿菌s25r防治鐮刀菌引起的植物病害的方法也屬於本發明的保護範圍，該方法是在植物生長過程中進行噴霧處理。噴霧製劑為該貝萊斯芽孢桿菌的菌懸液或發酵液或代謝產物或製備的農藥製劑。
本發明至少具有下列優點及有益效果：
本發明提供的貝萊斯芽孢桿菌js25r不僅在平板培養時可高效抑制禾穀鐮刀菌，而且在溫室實驗中其防治效果高達77.4％。作為小麥和玉米赤黴病的生物防治材料，無論開發新的生物農藥或者生物防治菌劑，該菌都都具有很好的應用前景。
附圖說明
圖1為本發明實施例2中js25r對禾穀鐮刀菌的對峙培養實驗結果；其中，a為以僅接種禾穀鐮刀菌菌盤的pda平板對照組，b為在距pda平板中心25mm處四點劃線接種相同體積和濃度的js25r。
圖2為本發明實施例4中js25r產生的揮發性氣體的抑菌實驗結果；其中，a為接種禾穀鐮刀菌菌盤的pda平板的對照組，b為在na平板中心接種js25r，倒扣於接有禾穀鐮刀菌的平板。
具體實施方式
以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。若未特別指明，實施例均按照常規實驗條件，如sambrook等分子克隆實驗手冊(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照製造廠商說明書建議的條件。
以下實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
nb液體培養基：由溶劑和溶質組成；溶質為蛋白腖、牛肉膏和nacl，溶劑為水；蛋白腖在nb液體培養基中的濃度為1％，牛肉膏在nb液體培養基中的濃度為0.3％，nacl在nb液體培養基中的濃度為0.5％，所述％均為質量體積百分比(g/100ml)。
na固體培養基：在nb液體培養基中加入瓊脂(瓊脂與液體培養基的比例為1.5g：100ml)，得到na固體培養基。
pda培養基：馬鈴薯200g,加入少量水煮20min，三層紗布過濾，取濾液用水定容至1l，加入20g葡萄糖，15g瓊脂，121℃高壓滅菌20min。
磷酸鹽緩衝液：由溶劑和溶質組成；溶質為磷酸二氫鉀和氯化鎂，溶劑為水；磷酸二氫鉀的濃度為0.004％,氯化鎂的濃度為0.019％，所述％均為質量體積百分比(g/100ml)。
禾穀鐮刀菌(f.graminearum)j07已在文獻「王瑤、趙月菊、邢福國、王龑、劉陽.禾穀鐮刀菌拮抗菌株的篩選及鑑定.核農學報2017，31(6):1128-1136.」中公開，公眾可從中國農業科學院農產品加工研究所獲得。
小麥石新828品種已在文獻「孫志軍，楊曉麗，張輝，張廣輝.小麥新品種石新828選育過程及高產栽培技術.現代農業科技，2011(09)，96-97.」中公開，公眾可從中國農業科學院農產品加工研究所獲得。
實施例1菌株js25r的分離與鑑定
一、菌的分離
(一)在超淨工作檯中，將30穗江蘇採集(2012年6月)的小麥病穗放在100ml無菌蒸餾水中震蕩15分鐘製備菌懸液，然後80℃水浴處理10分鐘。
(二)將菌懸液用無菌蒸餾水進行濃度梯度稀釋後塗布在na培養基平板上，30℃條件下培養24小時，菌落布滿整個平板，用接種環挑取平板上形態、大小、顏色、透明度不同的菌株平板劃線純化，點接純化後的菌株應用於禾穀鐮刀菌對峙培養實驗。將得到的對禾穀鐮刀菌拮抗能力強的一株菌命名為js25r。
二、鑑定
(一)按照「伯傑細菌鑑定手冊」(第八版)和「常見細菌系統鑑定手冊」(東秀珠，蔡妙英等編著，北京：科學出版社，2001.2)中描述的方法，對菌株js25r進行形態特徵、培養特性和生理生化特性鑑定，具體結果如下：
菌體的形態和生理生化特性：
在na培養基，28℃培養1天，菌體杆狀，直徑約為0.6μm×2.0-2.5μm；菌落奶白色，圓形，微凸，邊緣整齊。
生理生化特徵：
氧化酶：+；精氨酸雙水解酶：-；明膠水解：+；澱粉水解：+；過氧化氫酶：+；三丁酸甘油脂水解：+；硝酸鹽還原：+；七葉靈水解：+；酪素水解：+；tween80水解：-；吲哚實驗：-；脲酶：-；檸檬酸利用：+；h2s生成：-；vp實驗：+；厭氧生長：-；4％nacl：-；ph4.0：+；50℃：-；20℃：+。
可利用甘油、d-阿拉伯糖、l-阿拉伯糖、d-核糖、d-木糖、l-木糖、阿東醇、d-半乳糖、d-葡萄糖、d-果糖、d-甘露糖、l-鼠李糖、肌醇、甘露醇、山梨醇、α-甲基-d-葡萄糖苷、n-乙醯葡糖胺、七葉靈、水楊苷、d-纖維二糖、d-麥芽糖、d-乳糖、d-蜜二糖、d-蔗糖、d-棉籽糖、澱粉、糖原、d-來蘇糖、d-塔格糖、d-巖藻糖和l-巖藻糖產酸。
(二)16srdna序列測定
提取js25r的總dna，以其為模板，利用細菌16srdna通用引物進行pcr擴增，得到長度約為1.4kb的擴增產物，將擴增產物回收並進行測序，測得的序列如seqidno.1所示。
根據genbank序列同源性比較，菌株js25r與bacillusmethylotrophicusstrainlk6(genbank登錄號kc790234.1)同源性為99％，與bacillussp.ap-1(2015)(genbank登錄號km974803.1)同源性為99％，初步判定該菌為芽孢桿菌屬細菌(bacillussp.)。
基於以上特徵，將菌株js25r鑑定為貝萊斯芽孢桿菌(bacillusvelezensis)。
實施例2貝萊斯芽孢桿菌js25r對禾穀鐮刀菌的拮抗作用
採用對峙培養法檢測貝萊斯芽孢桿菌js25r對禾穀鐮刀菌的拮抗。
一、用直徑為5mm的打孔器在培養好的病原真菌禾穀鐮刀菌(f.graminearum)j07菌落邊緣打取菌盤，用滅菌的牙籤將菌盤挑入pda平板中心。
二、在距pda平板中心25mm處四點劃線接種相同體積和濃度的js25r，以僅接種禾穀鐮刀菌菌盤的pda平板為對照組，28℃培養4-5天，觀察有無抑菌帶形成。每個組做三個平行。結果如表1和圖1所示：
表1培養5天後js25r對禾穀鐮刀菌的抑制作用
如圖1和表1可知，貝萊斯芽孢桿菌js25r對禾穀鐮刀菌有很強的抑制效果。
實施例3貝萊斯芽孢桿菌js25r發酵液對禾穀鐮刀菌的抑制效果
採用對峙培養法檢測貝萊斯芽孢桿菌js25r對禾穀鐮刀菌的拮抗。
一、用直徑為5mm的打孔器在培養好的病原真菌禾穀鐮刀菌(f.graminearum)j07菌落邊緣打取菌盤，用滅菌的牙籤將菌盤挑入pda平板中心。
二、在距pda平板中心25mm處四點打孔接種相同體積和濃度的js25r，以僅接種禾穀鐮刀菌菌盤的pda平板為對照組，28℃培養4-5天，觀察有無抑菌帶形成。每個組做三個平行。結果如表2所示，表明js25r對禾穀鐮刀菌有很強的抑制效果。
表2培養5天後js25r對禾穀鐮刀菌的抑制作用
實施例4貝萊斯芽孢桿菌js25r揮發性氣體對禾穀鐮刀菌的抑制效果
採用對峙培養法檢測貝萊斯芽孢桿菌js25r產生的揮發性氣體對禾穀鐮刀菌的拮抗。
一、用直徑為5mm的打孔器在培養好的病原真菌禾穀鐮刀菌(f.graminearum)j07菌落邊緣打取菌盤，用滅菌的牙籤將菌盤挑入pda平板中心。
二、在na平板中心接種js25r，倒扣於接有禾穀鐮刀菌的平板，以僅接種禾穀鐮刀菌菌盤的pda平板為對照組，28℃培養4-5天，觀察有無抑菌效果。每個組做三個平行。結果如圖2所示。表明js25r可產生抑制禾穀鐮刀菌的揮發性氣體。
進一步對揮發性氣體的成分進行了分析，gc-ms檢測結果顯示，共檢測到36種物質(表3)。
表3通過gc-ms分析鑑定js25r的vocs
實施例5貝萊斯芽孢桿菌js25r對禾穀鐮刀菌抑制效果的溫室實驗
一、將js25r在nb培養基中28℃振蕩過夜培養，採用磷酸鹽緩衝液稀釋至濃度為2×108cfu/ml。
二、將禾穀鐮刀菌j07用綠豆湯培養基振蕩培養(28℃，5天)，得到菌懸液，採用磷酸鹽緩衝液稀釋菌液濃度為2×105cfu/ml。
三、將稀釋後的js25r與禾穀鐮刀菌j07按照1:1的體積比混合，終濃度分別為108cfu/ml和105cfu/ml。
四、在石新828品種的揚花早期進行麥穗中部接種，接菌體積為10μl，作為實驗組。同時以僅含有禾穀鐮刀菌的磷酸鹽緩衝液作為陽性對照組，以僅接種磷酸緩衝液的作為陰性對照。每組設10個重複，實驗重複3次，結果取平均值。
禾穀鐮刀菌菌懸液接種16天後，觀察麥穗的發病，有麥穗乾枯發白或發紅，內部籽粒不飽滿、重量減輕表現的麥穗為發病麥穗。其中赤黴病指數＝發病率×發病指數/100。
表4js25r對禾穀鐮刀菌的田間防治效果
結果如表4所示，貝萊斯芽孢桿菌js25r在溫室條件下能很好防治禾穀鐮刀菌引起的小麥赤黴病。
雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之做一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬於本發明要求保護的範圍。
參考文獻
1.dubinhj.fusariumheadscab:globalstatusandfutureprospects:proceedingsofaworkshopheldatcimmyt,elbatan,mexico,13-17october,1996.cimmyt；1997.
2.rochao,ansarik,doohanfm.effectsoftrichothecenemycotoxinsoneukaryoticcells:areview.foodadditivesandcontaminants:parta:chemistry,analysis,control,exposureandriskassessment,2005,22:369-378.
3.sobrovap,adamv,vasatkovaa,beklovam,zemanl,kizekr.deoxynivalenolanditstoxicity.interdisciplinarytoxicology,2010,3:94–99.
4.pestkajj.deoxynivalenol:mechanismsofaction,humanexposure,andtoxicologicalrelevance.archivesoftoxicology,2010,84:663-679.
5.李正輝,向晶晶,陳婧鴻,葛翠風,葛紹榮.小麥赤黴病拮抗菌的分離與鑑定.麥類作物學報,2007:149-152.
6.王瑤、趙月菊、邢福國、王龑、劉陽.禾穀鐮刀菌拮抗菌株的篩選及鑑定.核農學報2017，31(6):1128-1136.
序列表
中國農業科學院農產品加工研究所
貝萊斯芽孢桿菌js25r及其應用
khp171113873.2
1
patentinversion3.3
1
1448
貝萊斯芽孢桿菌(bacillusvelezensis)
人工序列
1
taattcggcggctataatgcagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgttagc60
ggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaa120
ccggggctaataccggatggttgtttgaaccgcatggttcagacataaaaggtggcttcg180
gctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcacca240
aggcaacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggc300
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atccggat1448