PRMT5基因作為預測診療急性心肌梗死標記物的用途的製作方法

2023-05-02 13:25:01 1

發明領域：本發明公開一種prmt5基因作為預測診療急性心肌梗死標記物的用途，涉及外周血急性心肌梗死標誌物檢測及其應用，屬於疾病風險預測評估，基因診斷和生物醫藥領域。發明背景：心肌梗死是一種以高發病率和高死亡率為特點的全球性疾病。全球每年超過300萬人新患st段抬高型心肌梗死，超過400萬人新患非st段抬高型心肌梗死。心肌梗死在發達國家中的發病率較高，在中國等發展國家中的發病率正呈快速上升趨勢。流行病學、基礎科學相關研究表明，生活方式因素和遺傳因素共同促進了冠脈粥樣硬化發展和心肌梗死發生。大多數mi是由已知致冠脈粥樣硬化危險因素（吸菸、血脂異常、高血壓、腹型肥胖、糖尿病等）和易感基因相互作用及其之間相互作用引起。冠心病是一個複雜遺傳疾病，現代基因技術已從大量的基因研究中識別出冠心病進展中重要誘發基因或易感基因。文獻表明外周血中基因表達水平可能反應了複雜心血管疾病的變化，是極具意義的檢驗心血管疾病的生物標誌物。發明人前期進行的外周血急性心肌梗死差異基因表達譜分析結果顯示：在急性心肌梗死患者和穩定型冠心病患者的外周血白細胞中存在著大量差異表達的基因。其中，prmt5基因在急性心肌梗死病人外周血中呈現顯著低表達，並且在現有研究中未見對prmt5基因與心肌梗死的相關報導。發明人在前期研究成果的基礎之上，通過擴大樣本量，來進一步驗證prmt5基因在急性心肌梗死發病過程中的差異表達，並分析prmt5基因促進穩定型冠心病發展為急性心肌梗死的可能機制。本發明提供了一種新的急性心肌梗死風險預測和診斷治療靶點，具有重要的臨床應用意義和開發價值。技術實現要素：本發明的目的在於提供一種prmt5基因作為預測診療急性心肌梗死標記物的醫用用途，用於急性心肌梗死風險預測和診斷，所述急性心肌梗死風險預測和診斷製劑檢測prmt5基因和或基因的表達產物。進一步的，所述的prmt5基因和或基因的表達產物在急性心肌梗死外周血中低表達。進一步的，所述的prmt5基因和或基因的表達產物的表達水平螢光定量檢測方法。本發明的目的在於所述急性心肌梗死風險預測和診斷製劑檢測prmt5基因和或基因的表達產物進一步的，採用螢光定量試劑盒、基因晶片、酶聯免疫、抗體雜交方法外周血中基因的表達檢測方法和相關的生物製劑。本發明的目的在於所述急性心肌梗死風險預測和診斷製劑檢測prmt5基因和或基因的表達產物進一步的，包含本prmt5基因和或表達產物用於急性心肌梗死風險預測和診斷的生物製劑。本發明中螢光定量pcr檢測中使用的引物對，其序列如下：上遊引物序列：5’tgtagggagaaggaccgtga3』；下遊引物序列：5』atggctgaaggtgaaacagg3』。本發明中螢光定量pcr檢測體系及反應條件：螢光定量pcr反應體系：20ul反應體系，每個反應包括:10ulsybrpremixextaqtm，上、下遊引物各0.5ul(濃度為10umol/l)，無核酸酶的雙蒸水8ul，cdna模板1ul。權利要求3中所述的螢光定量pcr反應條件：應用實時螢光定量pcr系統擴增。反應條件為95℃預變性10分鐘；40個循環：95℃變性15秒,60℃退火20秒,72℃20延伸秒；溶解曲線和擴增曲線95℃1分鐘，55℃30秒,95℃30秒。以gapdh基因為內參基因，所有樣本至少重複測量三次，結果取均值。本發明進行的外周血急性心肌梗死差異基因表達譜分析結果顯示：在急性心肌梗死病人的外周血白細胞中存在著大量差異表達的基因。其中，prmt5基因在急性心肌梗死病人外周血中呈現顯著低表達。發明人在前期研究成果的基礎之上，通過擴大樣本量，來進一步驗證prmt5基因在急性心肌梗死發病過程中的差異表達，並分析prmt5基因促進急性心肌梗死發病的可能機制。本發明的積極效果在於：提供了以prmt5基因和或基因的表達產物一種新的急性心肌梗死風險預測和診斷治療靶點，利用prmt5基因及其表達產物製備急性心肌梗死風險預測標記物和診斷製劑，具有重要的臨床應用意義和開發價值。附圖說明圖1為本發明prmt5基因螢光定量pcr的擴增曲線；圖2為本發明prmt5基因螢光定量pcr特異性引物的溶解曲線；圖3為本發明prmt5基因mrna表達水平在急性心梗組和穩定冠心病組的比較；圖4為本發明prmt5在蛋白水平上的表達水平比較。ami組，樣本編號為1、2、3；scad組，樣本編號為4、5、6；圖5為本發明prmt5在蛋白水平灰度分析在急性心肌梗死組和穩定型冠心病組的比較；圖6為本發明實施例3中prmt5基因相對表達量的roc曲線。具體實施方式結合實例具體實例，進一步闡述本發明，僅用於解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。本領域的普通技術人員可以理解，在不脫離本發明的原理和宗旨的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型。實施例1以受試者或急性心肌梗死患者外周血提取基因組dna為模板，螢光定量檢測prmt5基因mrna表達水平使用的特異性檢測基因的引物對p序列，其序列如下所示：上遊引物序列：5’tgtagggagaaggaccgtga3』下遊引物序列：5』atggctgaaggtgaaacagg3』。所述的螢光定量pcr反應體系：20ul反應體系，每個反應包括:10ulsybrpremixextaqtm，上、下遊引物各0.5ul(濃度為10umol/l)，無核酸酶的雙蒸水8ul，cdna模板1ul；所述的螢光定量pcr反應條件：應用實時螢光定量pcr系統擴增。反應條件為95℃預變性10分鐘；40個循環：95℃變性15秒,60℃退火20秒,72℃20延伸秒；溶解曲線和擴增曲線95℃1分鐘，55℃30秒,95℃30秒；以gapdh基因為內參基因，所有樣本至少重複測量三次，結果取均值。根據prmt5基因在外周血中mrna表達水平的高低來預測穩定型冠心病患者發生急性心肌梗死風險的大小。通過以下試驗表明本發明醫療效果病例的收集選取2014年11月-2016年11月於吉林大學中日聯誼醫院心血管內科住院治療並行冠脈造影術的患者，依據2012年公布的心肌梗死全球統一定義明確診斷為急性心肌梗死的病人91例為ami組，2013年esc指南公布的穩定型冠心病定義診斷為穩定型冠心病的病人87例為scad組。並根據冠狀動脈造影結果，按照gensini評分系統對研究對象的冠狀動脈血管病變嚴重程度進行評分，分值越高病變越嚴重。本發明排除標準：1.和經皮冠狀動脈介入治療（pci）或冠狀動脈旁路移植術（cabg）相關的心肌梗死。2.mitypeii。繼發於供血失衡相關的心梗：如兒茶酚胺水平升高或冠脈痙攣導致的心梗。3.伴有心臟手術或非心臟手術的心梗。4.合併多因素或不確定疾病的心肌損傷：嚴重心力衰竭、應激性心肌病、嚴重肺栓塞或肺動脈高壓、敗血症和危重病人、腎功能衰竭、嚴重的急性神經系統疾病，如卒中、蛛網膜下腔出血等。5.患有免疫系統疾病和（或）正在服用激素。6.（活動性或潛伏性）結核感染史或證據。7.正在患有的、慢性的或復發性的傳染性疾病史。8.合併有嚴重感染性疾病、惡性腫瘤。懷疑或證實處於免疫缺陷狀態的患者。9.臨床資料或者冠脈造影資料不全者。詳細記錄臨床資料，包括：血脂水平、空腹血糖水平、靜息血壓、體質指數（bmi）、冠心病家族史、吸菸史、冠狀動脈造影資料，以及合併其它臨床疾病情況（如高血壓、糖尿病）等。一、急性心肌梗死患者組及對照組外周血中prmt5基因表達情況1.1外周血採集、總rna提取及cdna合成留取各研究對象晨起空腹外周靜脈血4ml，利用血液總rna提取試劑盒（rnasimpletotalrnakit,天根生化科技有限公司，北京），依據試劑盒說明書對已獲取的外周血進行總rna提取，並利用1.5%瓊脂糖電泳及紫外分光光度計（nanodrop2000）對rna的質量及濃度進行檢測。合格的rna樣本a260/a280值在1.9和2.1之間，且a260/a230值大於2。瓊脂糖凝膠電泳可見明亮的28s和18srrna條帶，且28srrna條帶亮度約為18srrna的兩倍。採用反轉錄試劑盒（toyoborevertraaceqprcrtkit，上海），取總量為1ug合格的總rna進行反轉錄，得到cdna樣品保存於-20℃以便下一步進行實時螢光定量pcr。實時螢光定量pcr檢測利用sybr螢光定量試劑盒(sybrpremixextaqtm，takara,大連)進行pcr擴增。採用20ul反應體系，每個反應包括:10ulsybrpremixextaqtm，上、下遊引物各0.5ul(濃度為10umol/l)，無核酸酶的雙蒸水8ul，cdna模板1ul。應用mx3005p實時螢光定量pcr系統（stratagene）擴增。反應條件為95℃10分鐘；40個循環：95℃15秒,60℃20秒,72℃20秒；95℃1分鐘，55℃30秒,95℃30秒。以gapdh基因為內參基因，所有樣本至少重複測量三次，結果取均值。每個樣本所得循環閾值（ct）以相對表達量2-△ct表示（△ct=目的基因ct-內參基因ct），並進行比較。急性心肌梗死組對於對照組的相對表達量以2-△△ct法進行統計分析，△△ct=急性心肌跟死組△ct-對照組△ct。所用pcr引物根據ncbi資料庫提供的prmt5基因序列進行設計，並由上海生工生物技術有限公司合成，引物序列見表1表1.rt-pcr引物序列genesgenesprimersequence(5』-3』)prmt5fatgtagggagaaggaccgtgarbatggctgaaggtgaaacagggapdhfaacggatttggtcgtattgggcgrbctcctggaagatggtgatggfa,上遊引物rb,下遊引物。二、prmt5基因相對表達量與急性心肌梗死患者血脂，血糖等性狀的相關性分析1.1方法統計學分析數據使用spss24.0軟體進行統計學分析，計量資料服從正態分布使用x±s進行統計描述，組間差異比較使用獨立t檢驗分析，不服從正態分布的使用中位數和四分位數間距進行統計分析描述，組間差異使用秩和檢驗；計數資料採用頻數進行統計分析描述，組間差異使用x²檢驗分析；ami相關危險因素採用二元logistic回歸分析。prmt5基因相對表達量與心肌肌鈣蛋白i和gensini評分的相關性採用雙變量相關分析；統計結果以雙側p0.013）和低表達組（2-△ct≤0.013），進一步採用逐步二元logistic回歸分析prmt5基因mrna水平表達量、血清tc、ldl-c水平與ami的相關性。結果表明：prmt5基因低表達是ami的獨立危險因素，與prmt5高表達相比，prmt5基因低表達組ami的風險增加5.472倍，而血清tc、ldl-c水平升高不是心梗發生的獨立危險因素。詳見表4。基因相對表達量在急性心肌梗死診斷中的roc曲線和cutoff值根據急性心肌梗死組和對照組各樣本實時螢光定量pcr所得prmt5相對表達量2-△ct值繪製roc曲線，見圖5。從圖5可知prmt5基因的相對表達量對急性心肌梗死的診斷具有一定的參考價值，曲線下面積（auc）為0.709±0.039。，以約登指數最大值確定的prmt5基因相對表達量cutoff值0.014，診斷ami的敏感度為0.713特異性為0.681。陽性預測值為71.26%，陰性預測值為68.13%。基因相對表達量與冠狀動脈病變嚴重程度的相關性分析根據冠狀動脈造影結果，按照gensini評分系統對急性心肌梗死組冠狀動脈病變嚴重程度進行評分。分值越高代表冠狀動脈狹窄越重。急性心肌梗死組gensini評分結果為42（19.5-84.75），對prmt5基因和gensini分值進行雙變量相關分析，結果顯示：prmt5基因mrna表達量與gensini分值呈顯著負相關（rs=-0.205，p=0.015），即prmt5基因mrna的相對表達量越低，gensini分值越高，冠狀動脈病變則越重。基因的相對表達量與心肌肌鈣蛋白i（tni）的相關性急性心肌梗死組心肌肌鈣蛋白檢測結果為0.52（0.115-8.252）ng/ml。血清肌鈣蛋白i（tni）濃度的高低反應了急性心肌梗死的範圍的大小。血清tni和prmt5基因相對表達量的雙變量相關分析結果顯示：外周血中prmt5基因表達量的高低與血清tni濃度無關（rs=-0.125，p=0.413）。即prmt5基因mrna水平表達量與心肌梗死的範圍無關。基因相對表達量與急性心梗患者發病距採血的時間的相關性急性心肌梗死組發病距採血的時間結果為24（9-54）h。prmt5基因相對表達量和急性心肌梗死發病距採血時間相關分析結果顯示：外周血中prmt5基因表達量與急性心肌梗死發病距採血的時間無關（rs=-0.146，p=0.211）。本發明主要採用螢光定量pcr篩選出穩定型冠心病患者發生急性心肌梗死的相關基因，結合分子生物學實驗和臨床病例關聯分析，證實了是急性心肌梗死診治標誌物。sequencelisting吉林大學3patentinversion3.51111mrna人（homo）1tgtagggagaaggaccgtgaccctgaggcccagtttgagatgccttatgtggtacggctg60cacaacttccaccagctctctgcaccccagccctgtttcaccttcagccat111220dna人工序列2tgtagggagaaggaccgtga20320dna人工序列3atggctgaaggtgaaacagg20當前第1頁12