結核分枝桿菌之超氧化物歧化酶的製作方法

2023-05-03 06:35:01

專利名稱：結核分枝桿菌之超氧化物歧化酶的製作方法
本申請是申請號為99815528.4，申請日為1999年11月9日，發明名稱為「結核分枝桿菌之超氧化物歧化酶」的中國專利申請的分案申請。
背景技術：
超氧化物歧化酶催化超氧化物自由基(O2-)成為氧分子(O2)及過氧化氫(H2O2)的轉變。因為這樣的分子會與細胞的基因組DNA作用而誘導突變，所以超氧化物自由基的轉變通常對細胞而言是有利的。
超氧化物歧化酶(SOD)基於它們對於活性所需要的無機原子而分類。已定義了三個SOD家族需要錳的超氧化物歧化酶(MnSOD)、需要鐵的超氧化物歧化酶(FeSOD)以及需要銅和鋅的超氧化物歧化酶(Cu，ZnSOD)。
MnSODs已發現存在於線粒體及原核生物中，而FeSODs已發現存在於原核生物、遠古真核生物以及一些植物之中。Cu，ZnSODs起初發現於真核生物，後來在數種細菌之中發現。
巨噬細胞是脊椎動物免疫系統的重要力量。這樣的細胞可藉由吞入病菌並以超氧化物自由基攻擊而殺死病原體(例如細菌)。因此，分泌的Cu，ZnSOD可能在細菌性病原體，特別是在巨噬細胞中生存及生長的病原體的生存中起作用。
發明概述本發明是以在結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)中發現分泌的Cu，ZnSOD為基礎。已發現特異性地與這個結核分枝桿菌SOD結合的抗體，可用於檢測此細菌之存在。也發現結核患者發展出抗結核分枝桿菌Cu，ZnSOD的抗體。因此，患者所產生之抗結核分枝桿菌Cu，ZnSOD的抗體，是在該患者中對於結核病的診斷特徵。
因此，本發明以一種抗體為特徵，例如，一種可特異性地結合由SEQ ID NO2的胺基酸序列所組成之多肽的單克隆抗體，而SEQ ID NO2是結核分枝桿菌Cu，ZnSOD的胺基酸序列。抗體特異性地結合多肽是指它基本上不會結合樣品內的其它成份。Cu，ZnSOD或銅/鋅超氧化物歧化酶，是加速超氧化物自由基轉變至氧分子及過氧化氫的多肽，並且其超氧化物歧化酶的活性取決於銅及鋅原子或離子的存在。
本發明也包括一種檢測哺乳動物感染結核分枝桿菌的方法，包括(1)提供一段包括SEQ ID NO2之胺基酸序列的多肽；(2)在足以使抗體結合至此多肽的條件下，使此多肽與收集自哺乳動物的生物學樣品接觸(例如，人類血清樣品)；以及(3)測定結合至此多肽之抗體的存在，其中此抗體的存在表示哺乳動物感染結核分枝桿菌。這個方法任選地包括移除不與此多肽結合的抗體的步驟。
本發明的特徵還在於測試一化合物是否抑制多肽之超氧化物歧化酶活性的方法，包括(1)將此化合物與一多肽接觸，此多肽是Cu，ZnSOD(也稱為銅/鋅超氧化物歧化酶)並具有與SEQID NO2至少50％相同性(例如，至少60、70、80、90或100％相同性)的胺基酸序列；(2)測量超氧化物歧化酶活性水平；以及(3)比較此化合物存在時與不存在時之超氧化物歧化酶活性水平。當此化合物存在時的超氧化物歧化酶活性水平比此化合物不存在時的超氧化物歧化酶活性水平低時，此化合物稱為可抑制多肽的超氧化物歧化酶活性。此多肽可以在細胞(例如細菌)內，例如，在細菌的周質內。
為了加速本方法的檢測或測試方法，可將多肽結合至固體的支持物(例如，塑料的支持物，例如微滴板)。此外，也可將多肽共價結合至固體支持珠(例如，瓊脂糖)上。在此多肽與支持物之間的共價連結，可藉由本領域中所熟知的方法而達成。例如，此多肽可藉由將此多肽與化學活化形式的支持物反應，而共價連結至支持物(例如，CNBr活化的瓊脂糖4B或EAH瓊脂糖4B，可從Pharmacia獲得)。此外，可將等量的多肽沉積在微滴板的每個孔中，藉此產生一種陣列(array)，在這種陣列上可平行地比較多個化合物，或針對結核分枝桿菌的存在分析多個樣品。
發明詳述本發明涉及一種用於檢測樣品中之結核分枝桿菌的抗體，檢測哺乳動物感染結核分枝桿菌的方法，以及測試化合物之抑制超氧化物歧化酶活性的能力之方法。本發明的這些方面通過發現結核分枝桿菌所產生之一種新的Cu，ZnSOD而實現。
I.多肽在本發明之方法中，有用的Cu，ZnSOD多肽包括以下所說明的結核分枝桿菌Cu，ZnSOD多肽。在本發明之方法中，有用的Cu，ZnSOD多肽並不限於天然發生的序列。也可使用含有取代、刪除或插入的Cu，ZnSOD，只要那些多肽保留至少一種與天然發生之多肽相關的活性，並且至少與天然發生之序列有至少50％的相同性。
為了測定兩個序列的相同性百分比，針對理想比較之目的而比對序列(例如，為了與第二個胺基酸序列有理想的比對，可在第一個胺基酸序列之中插入間隙)。接著比對在相對應之胺基酸位置的胺基酸殘基。當在第一序列的位置被第二序列中之相對應位置的相同胺基酸殘基所佔據時，則這些分子在那個位置就是相同的。在這兩個序列之間的相同性百分比，是這些序列所共有的相同位置之數目的函數(也就是，相同性％＝相同位置的數目/所有位置的數目×100)。
兩個序列之間的同源性及相同性之百分比的測定，可使用數學算法來達成。用於比較兩個序列的數學算法之實例是Karlin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268(1990)的算法，修正版是Karlin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5877(1993)的算法。這樣的算法被納入Altschul等人，J.Mol.Biol.215403-410(1990)的NBLAST及XBLAST的程序中。BLAST蛋白質搜索可與XBLAST程序一起執行，分數＝50，字長度＝3，以得到同源於在本發明的方法中是有用之蛋白質分子的胺基酸序列。為得到有間隙的比對之比較目的，可使用Gapped BLAST，如Altschul等人，Nucleic Acids Res.253389-3402(1997)所說明。當使用BLAST及Gapped BLAST程序時，可使用個別程序(例如，XBLAST及NBLAST)的預設參數。參見http//www.ncbi.nlm.nih.gov。另一個用於比對序列的數學算法是Myers等人，CABIOS(1989)的算法。這樣的算法是併入ALIGN程序(第二版)之中，其為GCG序列比對軟體包的部份。當使用此ALIGN程序來比較胺基酸序列時，可使用PAM120重量殘基表、12的間隙長度障礙以及4的間隙障礙。
在兩個序列之間的相同性百分比，是使用上述的技術並允許間隙的存在而測定。在計算相同性百分比時，只有完全符合的才計算。
Cu，ZnSOD的實例是Cu，ZnSOD-穀胱甘肽-S-轉移酶融合蛋白，這不是天然發生的，但在本發明之方法中是有效用的。這樣的蛋白質可在細菌中大量製造，並可藉由穀胱甘肽親和柱而輕易地分離。在SOD之候選抑制劑的存在或不存在下(即，候選結核分枝桿菌抗微生物劑)，此融合蛋白可用於活體外的SOD分析。
II.抗體此處所使用的名詞「抗體」，是指免疫球蛋白分子以及免疫球蛋白分子之免疫活性的部份，也就是，包含抗原結合位點的分子，其可特異性地結合至抗原，例如，結核分枝桿菌Cu，ZnSOD。特異性地結合至結核分枝桿菌Cu，ZnSOD的分子是可結合結核分枝桿菌Cu，ZnSOD，但基本上不與樣品，例如，一種天然地包含結核分枝桿菌Cu，ZnSOD的生物學樣品，中的其它分子結合之分子。免疫球蛋白之免疫活性部份的實例包括F(ab)及F(ab』)2片段，這些片段可藉由以酶(例如，胃蛋白酶)處理抗體而產生。本發明提供與結核分枝桿菌Cu，ZnSOD結合的多克隆以及單克隆抗體。此處所使用的名詞「單克隆抗體」或「單克隆抗體組合物」，是指一群抗體分子，其只包含一種抗原的結合位點，這個位點有能力與結核分枝桿菌Cu，ZnSOD之特定的抗原決定位點引起免疫反應。單克隆抗體組合物因此對於與其免疫反應的結核分枝桿菌Cu，ZnSOD，典型地表現出單一的結合親和性。
抗結核分枝桿菌Cu，ZnSOD的多克隆抗體，可藉由以結核分枝桿菌Cu，ZnSOD免疫原，免疫適合的個體而製備。被免疫的個體之抗結核分枝桿菌Cu，ZnSOD的抗體效價，可藉由標準方法隨著時間監測，例如，使用固定化的結核分枝桿菌Cu，ZnSOD之酶聯免疫吸附分析(ELISA)。如果需要的話，針對抗結核分枝桿菌Cu，ZnSOD的抗體分子，可從哺乳動物中分離(例如，從血液中)，並進一步藉由熟知的方法而純化，例如，藉由蛋白質A柱層析分析而得到IgG的部份。在免疫後的適當時間，例如，當抗結核分枝桿菌Cu，ZnSOD的抗體效價是最高的時候，可從此個體得到製造抗體的細胞，並藉由標準技術而製備單克隆抗體，例如，在以下文獻所說明的，Kohler等人，Nature 256495-497，1975；Kozbor等人，Immunol.Today 472，1983；以及Cole等人，單克隆抗體及癌症治療，Alan R.Liss公司，77-96頁，1985。用於生產各種單克隆抗體雜交瘤的技術是熟知的(參見，例如，Coligan等人編輯，免疫學的現今方法，John Wiley Sons公司，紐約，1994)。簡言之，將永生細胞系(典型地是骨髓瘤)與淋巴細胞(典型地是脾細胞)融合，而此淋巴細胞是來自以如上所述結核分枝桿菌Cu，ZnSOD作為免疫原而免疫的哺乳動物，並且篩選所產生之雜交瘤細胞的培養上清液，鑑定產生與結核分枝桿菌Cu，ZnSOD結合之單克隆抗體的雜交瘤。
許多用來融合淋巴球細胞與永生細胞系的熟知方法中的任何一種，皆可應用於產生抗結核分枝桿菌Cu，ZnSOD之抗體的目的(參見，例如，免疫學的現今方法，同上；Galfre等人，Nature 26655052，1977；Kenneth，單克隆抗體生物學分析的新方面，Plenum Publishing公司，紐約，1980；以及Lerner YaleJ.Biol.Med.，54387-402，1981)。此外，本領域技術人員將會體認，在這樣的方法中有許多變異也是有用的。典型地，永生細胞系(例如，骨髓瘤細胞系)是衍生自與淋巴細胞相同的哺乳動物。例如，藉由將來自本發明之免疫原製備物所免疫的小鼠之淋巴細胞，與永生小鼠細胞系，例如，對含有次黃嘌呤、氨基喋呤及胸苷的培養基(「HAT培養基」)敏感的骨髓瘤細胞系，融合而製成小鼠的雜交瘤。許多骨髓瘤細胞系的任何一種細胞系，根據標準技術，皆可用作融合配偶體，例如P3-NS1/1-Ag4-1，P3-x63-Ag8或Sp2/O-Ag14骨髓瘤細胞系。這些細胞系可從ATCC獲得。典型地，使用聚乙二醇(「PEG」)將對HAT敏感的小鼠骨髓瘤細胞與小鼠脾細胞融合。由此融合所導致的雜交瘤細胞，接著用HAT培養基篩選，HAT培養基會殺死未融合的骨髓瘤細胞以及雖融合但無效的骨髓瘤細胞(未融合的骨髓瘤細胞過幾天就會死亡，因為它們並沒有轉化)。使用標準的ELISA分析，針對結合結核分枝桿菌Cu，ZnSOD的抗體，藉由篩選雜交瘤的培養上清液而檢測產生本發明之單克隆抗體的雜交瘤細胞。
另一種製備分泌單克隆抗體之雜交瘤的方法，是藉由以結核分枝桿菌Cu，ZnSOD來篩選重組的組合免疫球蛋白文庫(例如，抗體噬菌體展示文庫)，而鑑定並分離抗結合結核分枝桿菌Cu，ZnSOD的單克隆抗體，藉此分離可結合結核分枝桿菌Cu，ZnSOD之免疫球蛋白文庫的成員。用於產生及篩選噬菌體展示文庫的試劑盒是商業上可獲得的(例如，Pharmacia重組噬菌體抗體系統，目錄編號27-9400-01；以及Stratagen SurfZAPTM噬菌體展示試劑盒，目錄編號240612)。此外，對於使用在產生及篩選抗體展示文庫是特別經得起考驗的方法及試劑的實例，可在以下文獻中發現，例如，美國專利第5,223,409號；PCT出版編號WO 92/18619、WO 91/17271、WO 92/20791、WO92/15679、WO 93/01288、WO 92/01047、WO 92/09690及WO90/02809；Fuchs等人，Bio/Technology 91370-1372，1991；Hay等人，Hum Antibod Hybridomas 381-85，1992；Huse等人，Science 2461275-1281，1989；以及Griffiths等人，EMBO J.12725-734，1993。
此外，抗結核分枝桿菌Cu，ZnSOD的重組抗體，例如，嵌合的及人源化的單克隆抗體，包括人類及非人類兩個的部份，可藉由標準的重組DNA技術而達成，也是在本發明的範圍內。這樣的嵌合及人源化的單克隆抗體，可藉由本領域中所熟知的重組DNA技術而製造，例如，使用下列文獻所說明的方法，例如，PCT出版物WO 87/02671及WO 86/01533；歐洲專利申請第184187、171496、173494及125023號；美國專利第4,816,567及5,225,539號；Better等人，Science 2401041-1043，1988；Liu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 843439-3443，1987；Lie等人，J.Immunol.1393521-3526，1987；Sun等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84214-218，1987；Nishimura等人，Canc.Res.47999-1005，1987；Wood等人，Nature 314446-449，1985；Shaw等人，J.Natl.Cancer Inst.801553-1559，1988；Morrison，Science 2291202-1207，1985；Oi等人，Bio/Techniques 4214，1986；Jones等人，Nature 321552-525，1986；Verhoeyan等人，Science 2391534，1988；以及Beidler等人，J.Immunol.1414053-4060，1988。
抗結核分枝桿菌Cu，ZnSOD的抗體(例如，單克隆抗體)，可藉由標準技術(例如，親和性柱層析分析或免疫沉澱)而分離結核分枝桿菌Cu，ZnSOD。抗結核分枝桿菌Cu，ZnSOD的抗體，可加速來自細菌之天然結核分枝桿菌Cu，ZnSOD的純化，以及宿主細胞表達之重組產生的結核分枝桿菌Cu，ZnSOD的純化。此外，抗結核分枝桿菌Cu，ZnSOD之抗體，可用來檢測結核分枝桿菌Cu，ZnSOD(例如，在細胞溶胞物中或在血清樣品中)，以評估結核分枝桿菌Cu，ZnSOD蛋白質的豐富度。藉由將抗體與可檢測的物質連結在一起而可加速檢測。可檢測的物質之實例包括各種酶、輔基、螢光物質、發光物質、生物發光物質以及放射性物質。適合的酶之實例包括，辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼脂酶。適合的輔基之實例包括，鏈黴抗生物素/生物素以及抗生物素/生物素。適合的螢光物質之實例包括，傘形酮、螢光素、異硫氰酸螢光素、若丹明、二氯三嗪基胺螢光素、丹磺醯氯、藻紅蛋白。發光材料之實例包括，魯米諾(Luminol)。生物冷發光材料之實例包括，蟲螢光素酶、蟲螢光素以及水母發光蛋白(aequorin)。適合的放射性材料之實例包括，125I、131I、35S或3H。
III.以Cu，ZnSOD接觸一化合物對於活體外的分析，可藉由將Cu，ZnSOD與此化合物在溶液、懸浮液或凝膠中混合，而使Cu，ZnSOD接觸化合物。這個溶液、懸浮液或凝膠接著用於SOD分析。
對於細胞分析，任何Cu，ZnSOD多肽可在細胞中表達，如果此細胞並不是已經表達Cu，ZnSOD的，或任何Cu，ZnSOD多肽可在細胞中過度表達，如果此細胞已經表達Cu，ZnSOD的話。在細胞中表達蛋白質的方法是在本領域中所熟知的。
如果Cu，ZnSOD在細胞中，化合物可藉由本領域中所熟知的方法輸送至細胞內。如果此化合物是可通透膜的分子，則此化合物可直接與此細胞混合，使得Cu，ZnSOD與此化合物接觸。如果此化合物不是可通透膜的分子，例如許多大分子，或者如果此化合物是多肽、核酸或病毒載體，那麼此化合物可藉由電穿孔輸送至細胞內。
此外，細胞可以是體內的動物細胞。此化合物可藉由任何本領域公知的途徑輸送至此細胞，包括靜脈內注射。另外，如果輸送進細胞是需要的，則多肽化合物可藉由核酸或病毒載體而給藥。
IV.超氧化物歧化酶分析對於超氧化物歧化酶活性的分析可藉由任何本領域所知的標準技術而測定。例如，參見說明於Beauchamp等人，Anal.Biochem.44276-287，1971以及其中之參考文獻的分析方法。
許多的這些分析是依靠氮藍四唑(NBT)的光還原，其為一種由超氧化物自由基的產生所調節的過程。超氧化物歧化酶的活性是反應在NBT之還原的抑制上。NBT曝露適當光源會使之轉變成藍色染劑，可藉由560nm的吸光值而定量。然而在超氧化物歧化酶存在的情況下，NBT之光還原成藍色染劑的情形會減少或排除。基於此概念的特異程序是本領域中已知的。例如，參見以下所說明的程序。
不需詳細闡述，基於以上的揭露及以下的說明，相信本領域技術人員可利用本發明於極致。以下的實施例只是說明本領域技術人員如何實施此發明，並非用以限制本文之其餘部份。任何在本文中所引用的出版物，都併入為參考資料。
實施例1結核分枝桿菌Cu，ZnSOD的克隆和鑑定分別使用大腸桿菌株XL1 blue(Stratagen)以及BL21(DE3)(Novagen)進行克隆及重組蛋白的過度表達。使用結核分枝桿菌H37Rv作為電子顯微鏡分析。
根據標準方法執行克隆程序。藉由PCR從結核分枝桿菌的基因組擴增sodC基因的片段，使用寡核苷酸對5』-CATATGTCTACAGTTCCGGGTACCA-3』(SEQ ID NO3)以及5』-GGATCCAAGCTAGCCGGAACCAATGA-3』(SEQ IDNO4)，以用於全長克隆，而5』-CATATGCCAAAGCCCGCCGATCA-3』(SEQ ID NO5)以及5』-GGATCCAAGCTAGCCGGAACCAATGA-3』(SEQ ID NO6)則用於截短形式的克隆(說明如下)。將此PCR產物克隆進T-載體pT7-Blue(Novagen)，並隨後亞克隆進表達載體pET15B(Novagen)的NdeI及BamHI位置。根據製造商的操作說明，使用ABIBigDye(PE Applied Biosystems)螢光測序化學及ABI PRISM310基因分析自動測序儀(PE Applied Biosystems)，而測序此克隆之片段的兩條鏈。
測序的結果顯示sod C基因包含下列開放讀框ATGCCAAAGCCCGCCGATCACCGCAATCACGCAGCTGTCAGCACGTCGGTCCTGTCCGCGTTGTTTCTGGGCGCCGGTGCCGCGCTGCTGAGCGCATGCTCGTCGCCGCAGCACGCGTCTACAGTTCCGGGTACCACGCCGTCGATTTGGACCGGATCGCCCGCGCCGTCGGGACTTTCGGGTCACGACGAGGAGTCGCCCGGTGCGCAGAGCCTGACCAGTACCCTGACGGCGCCCGACGGCACGAAGGTAGCGACCGCGAAGTTCGAGTTCGCCAACGGCTATGCCACCGTCACGATCGCGACGACCGGCGTCGGTAAGCTCACGCCCGGCTTCCACGGCCTACACATCCACCAGGTGGGTAAGTGTGAGCCCAACTCGGTTGCCCCCACCGGCGGTGCGCCCGGCAACTTTCTGTCCGCCGGCGGCCACTACCACGTGCCAGGGCATACCGGCACCCCCGCCAGCGGCGACCTGGCCTCGCTGCAGGTACGCGGTGACGGTTCGGCGATGCTGGTGACCACCACCGACGCCTTCACCATGGACGACCTGCTGAGCGGCGCGAAAACCGCGATCATCATTCACGCCGGCGCCGACAACTTTGCCAACATTCCGCCAGAACGCTACGTCCAGGTCAATGGGACTCCGGGTCCCGACGAGACGACGTTGACCACCGGCGACGCCGGCAAGCGGGTGGCGTGCGGTGTCATTGGTTCCGGC(SEQ ID NO1).
此開放讀框結束於一個緊接於上述序列的天然TAG停止密碼。此開放讀框編碼一段240個胺基酸的多肽，其序列如下MPKPADHRNHAAVSTSVLSALFLGAGAALLSACSSPQHASTVPGTTPSIWTGSPAPSGLSGHDEESPGAQSLTSTLTAPDGTKVATAKFEFANGYATVTIATTGVGKLTPGFHGLHIHQVGKCEPNSVAPTGGAPGNFLSAGGHYHAVPGHTGTPASGDLASLQVRGDGSAMLVTTTDAFTMDDLLSGAKTAIIIHAGADNFANIPPERYVQVNGTPGPDETTLTTGDAGKRVACGVIGS (SEQ IDNO2).
使用PSORT程序分析(http//psort.nibb.ac.jp/)，在這個多肽的氨基端發現一個推定的信號肽(下劃線者)。
使用編碼上述SOD版本的pET15B表達載體轉化BL21(DE3)細胞。L-sodC質粒包括SEQ ID NO1。S-sodC質粒包括SEQ ID NO1的核苷酸118-720，也就是不包括編碼信號肽的序列。M-sodC質粒包括核苷酸118-720，但在天然終止密碼子由一T至A的突變，因此變成編碼賴氨酸。接著在編碼該新的賴氨酸之密碼子的下遊加入額外的序列(CCGAATTCCAGCACACTGGCGGCCGTTACTAGTGGATCCGGCTGCTAA；SEQ ID NO7)，藉此編碼額外的胺基酸序列PNNSSTLAAVTSGSGC(SEQ ID NO8)。藉由將此攜帶重組sodC質粒的BL21(DE3)細菌在包含0.5mM IPTG的LB培養液，以37℃培養100分鐘而誘導此重組蛋白的表達。離心回收細菌，並經由在10mM磷酸鹽緩衝液(pH7.4)及10mM咪唑中超聲處理而使細胞溶解。變性在包涵體(inclusion bodies)中的重組蛋白，並溶解於20mM Tris-HCl(pH8.0)、100mM NaCl、8M尿素及50mM咪唑中。接著根據製造商操作說明，將蛋白質在組氨酸捕獲螯合柱上(Pharmacia)純化。藉由在4℃對50mM Tris-HCl，pH7.8，1mM CuSO4以及1mM ZnSO4的透析，而將純化的重組蛋白復性，其中透析液更換數次。將純化的蛋白質儲存於添加20％甘油的透析液中。溶解於不含細胞之提取液中的重組蛋白，則是使用相同的柱在天然條件下而純化(也就是，以不含CuSO4的透析液)。
在IPTG誘導時，大部分過度表達的蛋白質存在於不可溶的包涵體內。將這些在包涵體之中的蛋白質變性，以尿素溶解，並純化以接近均質，如同以考馬斯(Coomassie)亮藍R-250染色之SDS-PAGE所顯示的。小部份的這些蛋白質也以溶解的形式而從細胞溶胞物純化。此SDS-PAGE還顯示L-sodC表現大約28-32kDa的分子量，M-sodC表現大約26kDa的分子量，而S-sodC表現大約24-25kDa的分子量。
藉由把在考馬斯亮藍R-250染色之SDS-PAGE上的親和性純化的M-sodC分級分離，而製備用於抗體製備的M-sodC。將含有此M-sodC的凝膠切片與完全弗氏(Freund’s)佐劑混合，並用此混合物免疫三月齡紐西蘭白兔。在起初的免疫之後，接著以混合於不完全Freund’s佐劑的蛋白質加強免疫三次。在最後一次加強後以十天之間隔，收集抗血清。
將欲分析的蛋白質樣品在SDS-PAGE中分級分離，電轉移至Immobilon TM-P膜上(Millipore)，以兔抗血清，接著以辣根過氧化物酶綴合的驢抗兔IgG抗體(Amersion)檢測。以增強的化學發光試劑盒(ECL，Amersion)檢測目標條帶，並以Hyperfilm-MP底片記錄。
抗此純化之重組M-sodC蛋白質的兔多克隆抗血清識別所有三種形式的SOD蛋白質，並且不與大腸桿菌之sodC基因產物交叉反應。更重要的是，此抗血清在結核分枝桿菌溶胞物中識別一個大小約26kDa的單一多肽，證明此sodC序列表達蛋白質。這個發現亦暗示結核分枝桿菌SOD是加工變為成熟的形式並分泌，如同以上所預測。
為了評估此重組白質之SOD酶活性，將此細菌表達的蛋白質重新懸浮於50mM磷酸鹽緩衝液(pH7.8)及0.1mM EDTA之中，經由超聲處理並且離心以得到細菌提取物。藉由非變性聚丙烯醯胺凝膠分離此提取物，以NBT染色，並如Beauchamp所述(文獻同上)曝露於光線下，從而評估SOD的活性。已知1mM KCN會選擇性地抑制Cu，ZnSOD活性，因此將之加入對照組樣品中以確認SOD活性是來自於Cu，ZnSOD酶。
大部分在大腸桿菌表達的結核分枝桿菌Cu，ZnSOD發現於不溶的包涵體之中，並且不具有任何酶活性。為了重建此酶活性，將來自包涵體所製備之純化的重組蛋白質以尿素變性，並藉由在Gu2+及Zn2+之溶液中透析而復性。從包涵體純化出來之還原的重組M-sodC蛋白質在藍色NBT-染色的凝膠上形成多重白色條帶。這些條帶可能代表活性的重組蛋白質之多樣構象。
從可溶的細胞質部份純化出來的重組Cu，ZnSOD(S-sodC)，在藍色NBT-染色的凝膠上表達出單一的白色條帶。當凝膠在1mM KCN的存在下染色時，代表結核分枝桿菌Cu，ZnSOD(S-sodC)、酵母菌Cu，ZnSOD以及結核分枝桿菌Cu，ZnSOD(M-sodC)之還原形式的白色條帶都消失。這個結果證明由結核分枝桿菌sodC基因所編碼的蛋白質，是編碼一種以Cu，Zn為輔因子的真實超氧化物歧化酶。
為了測定Cu，ZnSOD在細胞區室中的定位，將L-sodC酶在大腸桿菌中表達，然後依下面方法將此細菌進行免疫金標記電子顯微鏡分析。製備15nm的膠態金-IgG複合物並如同Lin等人，J.Ultrastruct.Res.8416-23，1983；以及Chang等人，J.Gen.Virol.781175-1179，1997所說明的方法執行免疫金標記。簡言之，將一些結核分枝桿菌的菌落從瓊脂斜面上刮下，並以4℃在1％的福馬林及0.1M的磷酸鹽-檸檬酸鹽緩衝液(pH7.2)中，固定過夜。將此固定的樣品於0℃，在0.1M的氯化銨及0.1M的磷酸鹽-檸檬酸鹽緩衝液(pH7.2)中，中和30分鐘。中和之後，接著透過一系列的甲醇清洗而脫水，第一次是在0℃用50％甲醇清洗15分鐘，接著以75％及90％的甲醇重複，接著以100％的甲醇在-20℃清洗兩次，每次1小時。以等級系列包埋劑LR Gold滲透此脫水的樣品。首先藉由浸在25％的LR Gold、10％PVP-6000中，-20℃，1小時而滲透此樣品。接著將此樣品浸在50％的LR Gold、10％PVP-6000中，-20℃，2小時，然後是75％LR Gold，-20℃，4小時。最後，以100％的LR Gold，-20℃，2小時，將此樣品完全滲透。在-20℃，以長波紫外光輻射達24小時而激活包埋劑的聚合作用，並且此樣品在室溫中24小時而變硬。將LR Gold包埋的樣品之超薄切片(100nm)固定在200目鎳網(其以碳支撐的膠棉薄膜覆蓋)。將網上的切片以3％正常山羊血清(溶於PBS)封阻10分鐘，與抗Cu，ZnSOD的兔抗血清(參見上述)保溫15分鐘，以1％正常山羊血清(溶於PBS)清洗，並且與膠態金-IgG複合物保溫10分鐘。在以醋酸鈾和檸檬酸鉛對照之前，以三重玻璃蒸餾水廣泛地清洗網。此切片以Zeiss EM109電子顯微鏡(Zeiss，德國)檢驗。
因為格蘭氏陽性的結核分枝桿菌中不存在周質空間，因此可檢驗出Cu，ZnSOD分泌至細菌的周圍。使用免疫金標記以及電子顯微鏡，顯示Cu，ZnSOD主要位於結核分枝桿菌的周圍。這個發現與上述的發現一致，即(1)Cu，ZnSOD具有一推定的信號肽序列，以及(2)成熟之天然發生的Cu，ZnSOD表現出類似於SDS-PAGE凝膠上之截短S-sodC蛋白質的大小。這些信息暗示結核分枝桿菌Cu，ZnSOD或者分泌或者附著在細菌的外表面上。
在另一實驗中，在大腸桿菌表達結核分枝桿菌Cu，ZnSOD。接著使用上述之免疫金標記電子顯微鏡測定所表達之蛋白質的位置。染色的結果顯示Cu，ZnSOD主要位於細菌的周質空間。因此，這個蛋白質可在適合大量產生此蛋白質的細胞中重組地產生並分泌。
實施例2用於檢測結核分枝桿菌的酶聯免疫吸附分析(ELISA)因為結核分枝桿菌Cu，ZnSOD曝露於細胞的外面，所以藉由使用特異於Cu，ZnSOD的抗體而發展ELISA的檢測分析。以1.22、4.88、19.5、78.1、312或1250ng/ml的S-sodC溶液，藉由在4℃保溫過夜而包被孔。接著移除蛋白質，並以10％的胎牛血清(溶於PBST)在37℃封阻孔2小時。以PBST清洗孔三次，並加入稀釋1∶4000的兔抗血清(在上述實施例1所得到的)。將兔抗血清在孔中於4℃過夜保溫。之後，以PBST清洗孔三次，並加入稀釋1∶1000的辣根過氧化物酶綴合的驢抗兔IgG抗體(Amersion，目錄編號NA943)。將驢抗體在37℃下，於孔中保溫6小時。再以PBST清洗孔三次，然後藉由加入TMB(KPL公司)並在室溫下保溫不超過30分鐘而顯色。加入1M H3PO4而終止反應。
450nm的吸收值讀數表明在10ng及1000ng之間有一動態的或可計量的檢測範圍。含有超過1000ng的樣品，讀數不再是動力學的。這個結果顯示藉由使用特異於Cu，ZnSOD的抗體可發展用於檢測結核分枝桿菌之有用的ELISA方法。
實施例3檢測結核分枝桿菌的感染因為結核分枝桿菌Cu，ZnSOD曝露於細胞外的環境，所以可檢驗結核病人產生抗Cu，ZnSOD之抗體的能力。使用病人血清，以Western印跡法檢測上述的結核分枝桿菌Cu，ZnSOD。結果顯示110個病人有12個產生抗Cu，ZnSOD的抗體，證實在個體中抗這個蛋白質的抗體之存在可用作結核病替代標記。
其它實施方案應了解的是，雖然本發明已連同其詳述而說明，但前面的說明是用以舉例而非限制本發明的範圍，本發明的範圍是藉由後附的權利要求書而定義。其它方面、優點、以及修飾是在本
權利要求
1.一種測試化合物是否抑制多肽之超氧化物歧化酶活性的方法，該方法包括將此化合物與一多肽接觸，此多肽是銅/鋅超氧化物歧化酶，並具有與SEQ ID NO2至少50％相同性的胺基酸序列；測量該多肽所表現之超氧化物歧化酶活性水平；以及比較該化合物存在時與不存在時之超氧化物歧化酶活性水平；其中，當該化合物存在時的超氧化物歧化酶活性水平比該化合物不存在時的超氧化物歧化酶活性水平低的時候，該化合物抑制該多肽的超氧化物歧化酶活性。
2.如權利要求1所述之方法，其中該多肽結合至固體支持物。
3.如權利要求2所述之方法，其中該固體支持物是塑料。
4.如權利要求2所述之方法，其中該固體支持物是一陣列，而且該多肽結合至該陣列的每個組件上。
5.如權利要求1所述之方法，其中該多肽是在細胞內。
6.如權利要求5所述之方法，其中該細胞是細菌細胞。
7.如權利要求1所述之方法，其中該胺基酸序列與SEQID NO2至少有70％的相同性。
8.如權利要求7所述之方法，其中該胺基酸序列與SEQID NO2至少有90％的相同性。
9.如權利要求8所述之方法，其中該胺基酸序列是SEQID NO2。
全文摘要
本發明涉及結核分枝桿菌超氧化物歧化酶的抗體，使用它們以用於檢測結核分枝桿菌的方法，測試結核分枝桿菌超氧化物歧化酶之抑制劑的方法，以及檢測結核感染的方法。
文檔編號C07K16/12GK1644708SQ20041008839
公開日2005年7月27日 申請日期1999年11月9日 優先權日1998年11月13日
發明者李芳仁, 吳忠勳 申請人:永信藥品工業股份有限公司