一種草分枝桿菌Sq-1及複合微生態製劑的製備方法

2023-05-03 08:37:21

專利名稱：一種草分枝桿菌Sq-1及複合微生態製劑的製備方法
技術領域：
本發明涉及醫學生物工程和發酵工程及微生物分子生態領域，更具體涉及一種滅活的草分枝桿菌Sq-I，還涉及一種枯草芽孢桿菌AS-1. 892活菌培養物，同時還涉及一種滅活的草分枝桿菌Sq-I與活的枯草芽孢桿菌ASl. 892複合製劑的製備方法。通過不同的菌株多種活性因子的協同作用調節腸道微生態平衡，強化機體的免疫調節和抗氧化、抗輻射能力，用於人和動物長期保健和一些慢性疾病的治療。
背景技術：
草分枝桿菌是一類非致病的桿菌，其製劑是一種免疫增強劑，20世紀末期，人們發現了分枝桿菌多糖(MPS)，胞壁醯二肽(MDP)，具有很強的免疫調節作用，同時促進造血系統、抑制病毒複製、修復受損細胞等等。近年來人們對它的去甲基化胞嘧啶，以及鳥嘌呤為核心的寡聚脫氧核苷酸序列(CPG)強佐劑作用引起了廣泛的關注，以生物調節劑治療由生理性病變引起的多種疑難雜症，取得了很好的效果。成為21世紀初免疫治療極為關注的熱點。國內外代表產品是德國sanum-kahlbeck公司在中國成都生產的烏體林斯，對它的臨床應用作了大量的報導。它是以滅活的菌體作為非特異性免疫製劑(針劑)。中國專利「草分枝桿菌免疫液，ZL03118887. 7」以菌體及其培養物包括了 MPS、MDP、CPG等組分，優以含胡蘿蔔素、黃酮和多種維生素酶多種微量元素，更經濟、更有效地發揮了免疫調節、抗氧化、抗輻射等功能。枯草芽孢桿菌作為活菌微生態製劑，早在上世紀晚期以口服液形式進入市場，在免疫調節、消化道感染和氣管炎的治療上發揮了重要作用。地衣芽孢桿菌也以膠囊形式 (商品名整腸生)用於調節微生態平衡。這類芽孢桿菌通常產生蛋白酶澱粉酶和纖維素酶幫助消化。增加機體對食物吸收利用率。近年來，kimio suetsima發現經蛋白酶消化的對蝦多肽和寡肽，具有很強的清除自由基的活性。任偉等人對於卵蛋白肽、骨原肽、大豆肽、玉米肽等食源性低聚肽，進行了抗氧化研究，結果表明，在清除DPPH自由基中大豆肽、卵蛋白肽活性最高，在抑制亞油酸自氧化體系中，大豆肽和海洋膠原肽，對於亞油酸自氧化抑制率分別為75%和58. 69%。因此生物活性肽(bioactive peptide)是一類具有分子量小， 生理活性強的特殊營養物質，成為營養學界和醫學界研究的熱點領域，2008年李勇等人對海洋生物蛋白肽與靈芝多糖配伍作了防輻射的研究，結果表明，不僅增強了經Cor照射的小鼠的存活時間，還大大的促進了外周血白細胞和DNA的修復，提高了 SOD酶活性，大大提高了小鼠細胞和體液的免疫功能。

發明內容
本發明的目的是在於提供了一種滅活的草分枝桿菌Sq-I，該菌在蔗糖無機鹽培養液內首先產生MDP、MPS、CGP等構形物；其次是黃酮、胡蘿蔔素、維生素酶多種微量元素。後者以微量和超微量形式存在大大加強了各自生理活性，而且無任何毒副作用。本發明的另一個目的是在於提供了一種複合微生態製劑，活著的枯草芽孢桿菌ASl. 892在腸道中迅速繁殖，造成厭氧環境，抑制了處於劣勢的腸道其它好氧細菌的增殖， 同時有利於腸壁厭氧的乳酸菌雙歧桿菌的生長，調節了腸道微生態平衡。枯草菌所產生的澱粉酶、蛋白酶，幫助消化，提高食物利用率，同時也提高了機體免疫水平，而兩株複合製劑強強聯合，強化了各自的生理活性功能。本發明的再一個目的是在於提供了一種複合微生態製劑的製備方法，方法易行， 操作簡便，成本低，無汙染。尤其提供了一種新型的植物油和泡敵乳化的消泡劑，效果好。為了達到上述目的，本發明採用以下技術措施一種草分枝桿菌Sq-I複合微生態製劑的製備方法，其步驟是首先是對草分枝桿菌Sq-I (Mycobacterium plei Sq-I)保藏號CGMCC N00916 和枯草芽孢桿菌AS1.892(l3acilluS subtilis ASl. 892)，此株菌在中國高等學校菌種目錄中編號為CCTCC AB93177，分級培養，製作複合微生態製劑。生物材料樣品的保藏信息為分類命名草分枝桿菌MyccAacterium phlei，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址中國市海澱區中關村北一條13號中國科學院微生物研究所，保藏日期 2003年4月1日，保藏編號CGMCC NO. 0916。A、培養基配製由下述原料按重量份製做培養基(1■量份)g/L
原料斜面種子g/L種子罐種子g/L發Sm菌體g/L
蔗糖10.0-15. 013. 0-15. 015. 0-20.0
葡萄糖2. 0-5. 05. 0-8. 0B. 0-10.0
K2HPO40. 15-0. 51. 0-1. 5 10-2.0
MgSO4 ·7H200. 1-0. 150. 15-0. 200. 15-0. 20
(NH4) Cl0. 5-1. 00. 5-1. 51. 0-2. 0
蛋白腖0. 5-1. 01. 0-1. 51. 0-1. 5
瓊脂17. 0-20.0
水餘量餘量餘量
PH7. 2-7. 5，115°C 滅菌 35-45 分鐘。
B、將Sq-I種子無菌接入茄子瓶斜面在條件下培養2-4天，無菌操作轉入C、將接種瓶的種子接入種子罐，培養溫度為^_32°C，通氣量1 0. 8，自動流加消泡劑(任何一種食用植物油泡敵水按6-8 2-3 30-50混合乳化)。培養36-40小時種子抽樣鏡檢；菌體生長均勻，停止發酵；所述的消泡劑為食用植物油(任何一種)、泡敵、水。食用植物油、泡敵、水的比例為6-8 2-3 30-50。D、將種子罐的種子轉入發酵罐，溫度為28_32°C，通氣量1 0. 8，自動流加消泡劑，培養50-60小時，抽樣鏡檢，菌體老化成球桿狀，停止培養；E、發酵液離心收集菌體，在108_112°C烘乾，收幹菌體。得到了-Sq-I的菌體。一種複合微生態製劑的製備方法，其步驟是A、一種ASl. 892枯草芽孢桿菌菌劑優化的培養基(重量份)原料斜面種子g/L種子罐種子g/L發酵罐菌體g/L
-種草分枝桿菌
牛肉膏2. 0-3. 0
蛋白腖4. 0-5. 0
NaCl4. 5-5. 0
瓊脂17. 0-20.0
大豆粕8. 0-10. 010.0-15
玉米粉15. 0-20. 020.0-25
玉米漿粉0. 5-1. 01. 5-2. 0
K2HPO41. 0-1. 51. 5-2. 0
KH2PO40. 5-1. 00. 5-1. 0
水餘量餘量餘量
PH7. 2-7. ^l，121°C 滅菌35-45分鐘。B、將ASl. 892種子接種到茄子瓶斜面，在33_37°C條件下培養34_38小時，用無菌水將菌體洗下，轉入接種瓶；C、種子罐接入種子後，通氣量1 1，自動流加消泡劑，35_37°C培養18-22小時後鏡檢菌體，生長健壯均勻，停止發酵；發酵罐接入種子罐種子，35_37°C通氣量1 1自動流加消泡劑，培養38_42小時， 鏡檢時，菌體變短，菌數達到IO9個/ml時停止發酵；所述的消泡劑為食用植物油(任何一種)、泡敵、水。食用植物油、泡敵、水的比例為為6-8 2-3 30-50。D、將發酵液離心，收集菌體，真空減壓63-67°C烘乾，收集幹菌體。得到了一種 ASl. 892枯草芽孢桿菌菌體。Sq-I幹菌體與ASl. 892幹菌體按1 3比例混均勻，得到了一種複合微生態製劑(膠囊)。綜上所述，為了保持菌株的優良遺傳特性，在生產過程中，對原種大量增殖後用甘油-70°C和牛奶凍幹保藏，開啟後其子代選典型生長快的菌落，並在生產中傳代不超過三次。該製劑很好地調節腸胃的微生態平衡，提高機體免疫力，具有較強的抗氧化、抗輻射的功能。可以用於人和動物的長期保健和一些慢性病的治療。發明的優點和效果一、本發明是由滅活的草分枝桿菌的菌體和活著的枯草芽孢桿菌組配的新型微生態製品，二者混合後，滅活的菌體及代謝產物作為益生元增加腸道中有益菌的生長繁殖以及定植能力，活的菌體增加了新的益生菌群，大大增強了腸道益生菌的種群和數量。維持腸道良好的微生態平衡。二、兩種菌作為免疫增強劑，混合使用的多因子協同作用效應遠遠大於單獨使用的效果。例如；枯草芽孢桿菌利用大豆蛋白作為氮源經過它自身產生的蛋白酶消化以後， 產生多種2-4個胺基酸組成的短肽，具有很強的抗氧化活性，而彌補了草分枝桿菌蛋白酶活性不高的缺點。三、這種微生態製劑的使用將大大減少環境汙染和抗生素的大量使用對人和動物造成的嚴重危害，是營養學向預防醫學轉變的重要裡程碑。
四、微生態製劑經過配伍，延長了製劑的活菌保質期。五、本發明採用消泡劑是泡敵植物油和水乳化成的，效果好，發酵成本大大減小。六、此製劑工藝簡單，操作方便，成本低。總之該菌劑具有明顯的抗氧化抗輻射和提高機體免疫力等功能。附表說明使用效果。表1三種不同製劑體外抗氧化比較
權利要求
1.一種草分枝桿菌，其特徵在於草分枝桿菌Mycobacterium phci Sq-I CGMCC N00916。
2.權利要求1所述的一種滅活的草分枝桿菌Sq-I的製備方法，其步驟是A、培養基配製原料斜面種子g/L種子罐種子g/L發酵罐菌體g/L蔗糖10. 0-15. 013. 0-15. 015. 0-20. 0葡萄糖2. 0-5. 05. 0-8. 08. 0-10. 0K2HPO40. 15-0. 51. 0-1. 51.0-2. 0MgSO4 ·7Η200. 1-0. 150. 15-0. 200.15-0. 20(NH4)Cl0. 5-1. 00. 5-1. 51.0-2. 0蛋白腖0. 5-1. 01. 0-1. 51. 0-1. 5瓊脂17. 0-20. 0水餘量餘量餘量ΡΗ7. 2-7. 5，115°C滅菌 35-45分鐘；B、將Sq-I種子無菌接入茄子瓶斜面在條件下培養2-4天，無菌操作轉入接種瓶，鏡檢種子無雜菌生長均勻；C、將接種瓶的種子接入種子罐，培養溫度為^_32°C，通氣量1:0. 8，自動流加消泡劑， 培養36-40小時種子抽樣鏡檢；菌體生長均勻，停止發酵；D、將種子罐的種子轉入發酵罐，溫度為28-32°C，通氣量1:0.8，自動流加消泡劑， 50-60小時，抽樣鏡檢，菌體老化成球桿狀，菌數達IO9個/ml，停止培養；E、發酵液離心收集菌體，在108_112°C烘乾，收幹菌體，得到了一種草分枝桿菌Sq-I菌體。
3.權利要求1所述的一種複合微生態製劑的製備方法，其步驟是 A、一種ASl. 892枯草芽孢桿菌菌劑的培養基原料斜面種子g/L種子罐種子g/L 發酵罐菌體g/L牛肉膏2. 0-3. 0蛋白腖4. 0-5. 0NaCl4. 5-5. 0瓊脂17. 0-20. 0大豆粕8. 0-10. 010. 0-15. 0玉米粉15. 0-20. 020. 0-25. 0玉米漿粉0. 5-1. 01. 5-2. 0K2HPO41. 0-1. 51. 5-2. 0KH2PO40. 5-1. 00. 5-1. 0水餘量餘量餘量PH7. 2-7. ^1，121 °C 滅菌 35-45 分鐘；B JfASl. 892種子接種到茄子瓶斜面，在35-37°C條件下培養34-38小時，用無菌水將菌體洗下，轉入接種瓶；種子罐接入種子後，35-37°C培養，通氣量1 :1，自動流加消泡劑，18-22小時後鏡檢菌體，生長健壯均勻，停止發酵；發酵罐接入種子，35-37°C培養，通氣量1 :1，自動流加消泡劑，38-42小時，鏡檢時，菌體變短，菌數達到IO9個/ml時停止發酵；將發酵液離心，收集菌體，真空減壓63-67°C烘乾，收集幹菌體，得到了一種ASl. 892枯草芽孢桿菌菌體；將Sq-I幹菌體與ASl. 892幹菌體按1 :3比例混均勻，得到了一種複合微生態製劑。
4.按權利要求2或3所述的一種複合微生態製劑的製備方法，其特徵在於所述的消泡劑為食用植物油、泡敵、水，食用植物油、泡敵、水的比例為6-8 2-3 :30-50。
全文摘要
本發明公開了一種草分枝桿菌Sq-1及複合微生態製劑的製備方法，步驟是A、培養基配製；B、將Sq-1種子無菌接入茄子瓶斜面下培養；C、將接種瓶的種子接入種子罐；D、將種子罐的種子轉入發酵罐；E、發酵液離心乾燥，收集菌體，得到草分枝桿菌Sq-1。製備一種複合微生態製劑的方法，步驟是A、配製枯草芽孢桿菌的培養基B、將AS1.892種子接種到茄子瓶斜面培養；c、種子罐培養；d、發酵罐培養；e、將發酵液離心乾燥，得到枯草芽孢桿菌菌體。F、將Sq-1幹菌體與AS1.892幹菌體按比例混均，製成膠囊。方法易行，操作簡便，成本低，無汙染。該製劑很好地調節腸胃的微生態平衡，提高機體免疫力，具有較強的抗氧化、抗輻射的功能。用於人和動物的長期保健和慢性病治療。
文檔編號C12N1/20GK102206590SQ201010572928
公開日2011年10月5日 申請日期2010年12月3日 優先權日2010年12月3日
發明者張世敏, 張素琴 申請人:張素琴