一種結核分枝桿菌複合群的螢光定量rt-pcr檢測方法

2023-05-03 08:43:06 1

專利名稱：一種結核分枝桿菌複合群的螢光定量rt-pcr檢測方法
技術領域：
本發明屬於生物工程檢測技術領域，具體涉及臨床標本中結核分枝桿菌複合群的 螢光定量檢測方法。
背景技術：
結核分枝桿菌複合群包括結核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌、田鼠分枝杆 菌。結核分枝桿菌是引起人類結核病的主要病原菌，此外，牛分枝桿菌除引起牛結核病外， 少數人類結核病也由其引起。非洲分枝桿菌致病力較弱，是熱帶非洲人結核病病原體。田 鼠分枝桿菌對人類無致病性。結核病是嚴重危及全球的公共衛生問題之一，自20世紀90年代以來結核病在全 球「死灰復燃」，許多國家包括結核病疫情控制較好的國家，不同程度地出現了疫情下降緩 慢或嚴重反彈的局面，發病率以每年1.的速度增長，結核病再次成為威脅人類健康的主 要傳染病，成為嚴重的公共衛生問題和重大的經濟社會問題。據世界衛生組織估計，全球每 年新髮結核病患者880萬例，其中傳染性結核病患者390萬例，每年因結核病死亡的患者約 200萬人。我國是世界上22個結核病高負擔國家之一，患者人數僅次於印度居全球第二位。 每年因結核病死亡人數達13萬，大大超過其他傳染病死亡人數的總和。如果不採取有效措 施，在未來的10年中，可能有3000萬人發生結核病。臨床診斷肺結核的主要依據是檢測痰中結核分枝桿菌，其中，塗片法簡單易行，但 陽性率較低；羅氏培養法雖然是金標準，但檢測周期長，均難以滿足臨床需要。因此提供敏 感、特異、快速、可靠、簡便、適合臨床應用的實驗室檢查技術已成為國內外研究的重點。其 中實時螢光PCR因其技術成熟，具有較高的靈敏性和特異性，已逐步應用到臨床中。實時螢光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入一對引物的同時加入一個特 異性螢光探針(TaqMan探針)，探針只與模板特異性地結合，其結合位點在兩條引物之間，利 用螢光信號積累實時監測整個PCR過程。目前常用的TaqMan探針為寡核苷酸，其5'端標 記有報告基團(Importer，R)，如FAM、VIC等，3 『端標記有螢光淬滅基團(Quencher，Q)， 如TAMRA等。當探針完整的時候，報告基團所發射的螢光能量被淬滅基團吸收，儀器檢測不 到信號。隨著PCR的進行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結合的探針，其3' -5'外 切核酸酶活性就會將探針切斷，報告基團遠離淬滅基團，其能量不能被吸收，即產生螢光信 號。所以，每經過一個PCR循環，螢光信號也和目的片段一樣，有一個同步指數增長的過程， 每個循環結束後檢測一次螢光強度，整個反應結束後，便可得到一條擴增曲線，由已知濃度 標準樣品的擴增曲線可以得到一條標準曲線，根據該標準曲線以及未知模板的擴增曲線可 對未知模板進行定量分析。

發明內容
本發明的目的是克服現有技術中存在的缺陷，提供一種檢測靈敏度高、且操作簡 單的結核分枝桿菌複合群的螢光定量RT-PCR檢測方法。
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本發明提供的結核分枝桿菌複合群的螢光定量RT-PCR檢測方法，通過對RDP ( Ribosomal Database Project)中結核分枝桿菌複合群的16srRNA全序列進行生物信息學 比對分析，選取序列保守片段為靶目標，應用primer express軟體和primer premier 5.0 軟體，設計一條逆轉錄引物和一對PCR引物以及一條Taqman探針。本發明方法所用的結核 分枝桿菌複合群特異性定量檢測試劑包含一條逆轉錄引物和一對特異性PCR引物以及一 條特異性螢光探針，擴增目的擴增片段長度為100 bp。本發明方法包括如下步驟
1.通過生物信息學分析，選擇結核分支桿菌複合群的16srRNA基因的保守片段為靶目 標，其基因片段的擴增目標核苷酸序列為
GGGATGCATGTCTTGTGGTGGAAAGCGCTTTAGCGGTGTGGGATGAGCCCGCGGCCT ATCAGCTTGTTGGTG GGGTGACGGCCTACCAAGGCGACGACGG (SEQ ID NO. 5)
2.應用primerexpress軟體禾口 primer premier 5. O軟體，設計一條結核分支桿菌復 合群的逆轉錄引物和一對PCR引物以及一條Taqman探針。探針5』端的螢光報告基團是 FAM, 3'端標記的是螢光淬滅基團為TAMRA。逆轉錄引物CCGTATCTCAGTCCCAGTGT(SEQ ID NO. 1) 上遊引物MTBC-F GGGATGCATGTCTTGTGGTG (SEQ ID NO. 2) 下遊引物MTBC-R CCGTCGTCGCCTTGGTAG (SEQ ID NO. 3)
Taqman 探針序列5' -FAM-CGGGCTCATCCCACACCGCTA-TAMRA-3，。(SEQ ID N0. 4)
3.構建和製備質粒定量標準品
根據確定的PCR產物，利用DNA重組技術將包含目的擴增片段的基因克隆到質粒載體 PGEM-T Easy Vector中，構建的重組質粒作為檢測結核桿菌複合群的定量標準品。4.樣本中結核分枝桿菌複合群的分離及其核酸的提取，使提取的樣本中同時含有 DNA與RNA成分；
5.對提取的同一樣本同時進行RT-PCR和PCR，計算出起始樣本RT-PCR/PCR的拷貝數 比值，從而區分樣本中死菌與活菌。6.結核分支桿菌複合群特異性定量檢測方法的優化和建立
經過大量的反應條件優化、對比試驗和驗證試驗，並經過臨床樣本的檢測應用評估。對 建立的方法進行靈敏度、穩定性、特異性以及對臨床樣本的有效性進行綜合評價
(1)靈敏度用TE分別將質粒定量標準品PGEM-T Easy-16srRNA稀釋至101(1、ΙΟ9、108、 IO7,IO6,IO5,10\IO3,IO2,10\ 0°οορ β8/π1,採用經優化後的體系進行檢測，驗證所建立的 方法的靈敏度。本檢測方法在IOltl-IO2 copies/reaction數量級範圍內具有良好的線性關 系，相關係數R=O. 9937，其檢測範圍可達9個數量級。(2)穩定性我們從批間重複和批內重複兩個方面進行評價。批內重複性選取 同一份樣本設5個平行反應管同時進行反應，檢測其CT值及比值的變異係數。批間重複性 選取同一份樣本，一周內重複檢測5次，檢測其CT值及比值的變異係數。(3)特異性本研究選取了 5個人的基因組DNA樣本進行檢測，結果只有結核分支 桿菌複合群樣本呈陽性結果，5份人的基因組DNA均為陰性結果。本發明採用的螢光定量PCR技術巧妙的利用了 PCR技術的高效擴增、探針技術的 高特異性和光譜技術的敏感性及實時定量的優點，克服了常規PCR定性檢測的一些不足，極大地提高了檢測的敏感性和特異性，檢測靈敏度可達IO2數量級；並且縮短了實驗時間， 簡化了實驗操作，而且螢光檢測的結果由電腦軟體分析，避免了產物後處理過程所致的汙 染，較常規PCR更為客觀、靈敏、準確。同時，本發明中採用的陽性對照是根據結核分支桿菌 複合群的保守序列設計構建的標準質粒分子，使得陽性標準品德來源可靠，避免了陽性毒 株在每次實驗中的使用。本發明方法可進行大批量的樣本分析，並對結核分枝桿菌複合群 進行定量，從而為結核分支桿菌複合群的檢測和監控提供有效方法。


圖1為螢光定量PCR敏感度檢測的螢光信號圖(從左到右的標準品濃度分別為 IO10-IO0 copies/ul)。圖2 為結核分支桿菌複合群的絕對定量的標準曲線， Y=-3. 3592*log(conc)+38. 4939
(注conC表示反應體系中的標準質粒拷貝數)。
具體實施例方式下面結合具體實施例詳細說明本發明，但不以任何形式限制本發明要求保護的範圍。實施例1 設計引物和Taqman探針 實驗步驟
在RDP ( Ribosomal Database Project)核糖體序列分析資料庫中檢索結核分枝杆 菌複合群的16srRNA全序列，通過生物信息學比對分析，選取序列保守片段，應用primer express軟體和primer premier 5. O軟體，設計一條逆轉錄引物和一對PCR引物以及一條 Taqman探針，探針5』端的螢光報告基團是FAM，3』端標記的是螢光淬滅基團為TAMRA，引物 和探針位於結核分枝桿菌複合群16srRNA區域，目的擴增片段為100 bp。引物和探針序列為
逆轉錄引物CCGTATCTCAGTCCCAGTGT
上遊引物MTBC-F: GGGATGCATGTCTTGTGGTG
下遊引物MTBC-R CCGTCGTCGCCTTGGTAG
Taqman 探針序列5' -FAM-CGGGCTCATCCCACACCGCTA-TAMRA-3'。實施例2:定量標準品的構建與製備 實施步驟
1.定量標準品的構建
利用RT-PCR方法克隆得到含有靶序列的結核分支桿菌複合群(MTBC)基因片段，重組 到質粒載體PGEM-T Easy中，並進行DNA序列測定。構建的重組質粒作為檢測結核分枝杆 菌複合群的定量標準品，命名為pGEM-T Easy-16srRNA。2.定量標準品的製備
質粒pGEM-T Easy-16srRNA經過提取純化後，根據紫外分光光度計測定的0D260、 0D280和0D230值計算質粒濃度，檢測質粒的純度，並根據阿伏伽德羅常數換算成拷貝數。計算公式如下
5質粒濃度(ug/ul)= 0D260 X稀釋倍數X50/1000
質粒拷貝數=A*N/1000M
Α:代表質粒濃度(ug/ul)；
M:代表質粒分子量；
N:代表阿伏伽德羅常數(6. 02xl023/mol)
實施例3 痰液樣本中細菌的分離與提取
1.痰液樣本的預處理
(1)取晨痰置於無菌密封瓶，採用NaOH處理法。(2)加入等體積10%Na0H溶液，渦旋震蕩混勻後，置37°C水浴消化30 min以上，直 至痰液被完全消化為止；
(3)混勻痰消化液，取1ml液化痰標本於潔淨的1. 5mlEP管中12000 rpm離心5min後 去上清；
(4)再用Iml清洗液(IOmMEDTA或生理鹽水)洗滌上一步的沉澱，渦旋震蕩混勻後， 12000 rpm離心5min後去上清留沉澱待檢。2.運用一種新的抽提方法同時提取細菌中的RNA與DNA
(1)細菌裂解將上一步痰液樣本預處理後所得沉澱物重新懸浮於Iml裂解液中，該裂 解液由IX混合液和酚氯仿異戊醇(25:24:1)等體積組成。(2)運用MiniBeadbeater-I研磨珠均質器進一步裂解結核桿菌細胞壁， MiniBeadbeater-I研磨珠均質器的條件是4800rpm，30s，放液氮或冰上5_10s後，再重複一次。(3)核酸抽提先稍微離心上一步的菌體裂解液，吸取上清液到1. 5mlEP管中(勿 吸到下層的陶瓷微珠)。(4)沉澱先加入4uL微量核酸助沉劑，充分混勻，再加入等體積的異丙醇，混勻， 冰上放置 30min。12000rpm，IOmin 離心。(5)洗滌沉澱用75%的乙醇洗滌，晾乾後，溶於適量的Rnase-freeMilli-Q水中。(注1X混合液由2X TE Buffer與2X異硫氰酸胍等體積混合而成； 2XTE Buffer 的配方組成濃度20mM Tris-HCl 2mM EDTA PH=8. 0
2X異硫氰酸胍的配方組成濃度2mM硫氰酸胍2mM硫氰酸銨) 實施例4 用上述新的核酸抽提方法提取1-5號臨床樣本的總RNA及DNA，然後先從5 管樣本中各取出5ul核酸模板進行下面的逆轉錄反應。實驗步驟
1.反應體系配置使用反轉錄反應試劑對樣本進行反轉錄反應，反轉錄反應體系 為 10μ1,其中 5 X First-Strand Buffer 2 μ 1, M-MLV RT Enzyme 0· 1 μ 1、IOmMdNTP 皿士乂0.25111特異反轉錄引物0.5 4 1、核酸模板5 4 1，補8妝86 Free dH20至總體積為10 μ 1。2.反應程序的設置
(1)先加dNTPMix、特異反轉錄引物、核酸模板、RNase Free dH20
(2)65°C 5分鐘，然後放冰上冷卻片刻
(3)再加5 X First-Strand Buffer ,37 °C 2 分鐘
(4)最後加酶，37°C50分鐘一70°C 15分鐘。
實施例5 結核分枝桿菌複合群特異性定量PCR方法的優化和建立 實驗步驟
1.絕對定量標準曲線的建立 (1)質粒標準品製備
質粒pGEM-T Easy-16srRNA經過提取純化後，根據紫外分光光度計測定的0D260、 0D280和0D230值計算質粒濃度，檢測質粒的純度，並根據阿伏伽德羅常數換算成拷貝數。(2)定量PCR反應條件的優化
通過對反應體系中不同濃度的定量PCR引物、Taqman探針、以及退火溫度等實驗結果 進行比較，選擇反應靈敏度高、本底螢光信號低、具有典型S型擴增螢光信號曲線、反應效 率接近於1的反應體系。本發明使用的螢光定量PCR儀為ABI7900。螢光檢測的程序設置 在每個循環第二步結束時檢測螢光信號。引物濃度的優化在反應體系中其他條件相同的情況下，將MTBC的PCR引物濃度 從0. lumol/L至0. 5 umol/L以0. 05 umol/L遞增，通過試驗結果分析比較，確定最佳的引 物終濃度為0. 3 umol/L。探針濃度優化在反應體系中其他條件相同的情況下，將MTBC的探針濃度分別從 0. lumol/L至0.8 umol/L做倍比連續稀釋後進行檢測，通過試驗結果分析比較，確定最佳 的引物終濃度為0.4 umol/L。退火溫度優化通過比較退火溫度的優化試驗結果後，選定60°C為最佳退火溫度。經優化後的定量PCR反應體系PCR擴增反應體系為10ul，其中包括2xmaSter mix 5ul、Taqman probe (4umol/L) lul、PCR 上遊引物(5umol/L) 0. 6ul、PCR 下遊引物 (5umol/L) 0. 6ul、原始樣本的逆轉錄產物1 μ 1、未經逆轉錄反應的原始樣本0. 5 μ 1 (保證 原始樣本的逆轉錄產物和未經逆轉錄反應的原始樣本中的起始DNA量一致)，補ddH20至終 體積為10 μ 1 ；
PCR反應程序95°C 10分鐘(1個循環)一950C 15秒，60°C 1分鐘(40個循環)
(3)絕對定量的擴增曲線建立
用TE 10倍梯度稀釋質粒定量標準品pGEM-T Easy-iesrRNA，稀釋後質粒濃度分別為 IO10、ΙΟ9、ΙΟ8、ΙΟ7、ΙΟ6、ΙΟ5、ΙΟ4、ΙΟ3、102,10\ 0°οορ β8/π1。採用經優化後的體系進行反應， 反應條件為95°C 10分鐘(1個循環)一95°C 15秒，60°C 1分鐘(40個循環)。檢測結束 後利用螢光PCR自帶的軟體，根據噪聲情況設定和調整基線和閾值，繪製標準曲線(圖1)。2.靈敏度分析
本檢測方法在IOltl-IO2 copies/reaction數量級範圍內具有良好的線性關係，相關係 數R=O. 9937，其檢測範圍可達9個數量級(圖2)。檢測反應管中起始模板的拷貝數的計算公式M :conc=10(38-4939-CT)/3·3592
若樣本1經過RT-PCR後的CT值為X，則通過代入上式M可以得到樣本1中起始總RNA 與 DNA 的拷貝數為 10(38·4939- /3·3592
若樣本1未經過RT反應，直接進行PCR反應後的CT值為Y，則通過代入上式M可以得 到樣本1中起始DNA的拷貝數為10 -γ)/3_·
因此可以推算出樣本1中RT-PCR/PCR的拷貝數比值為10(38 4939_ /33592 /
權利要求
一種結核分枝桿菌複合群的螢光定量RT PCR檢測方法，其特徵在於具體步驟如下(1)結核分枝桿菌複合群特異性定量RT PCR引物和探針設計在RDP核糖體序列分析資料庫中檢索結核分枝桿菌複合群的16srRNA全序列，通過生物信息學比對分析,選取序列保守片段，設計一條逆轉錄引物和一對PCR引物以及一條Taqman探針，探針5'端的螢光報告基團是FAM，3'端標記的是螢光淬滅基團為TAMRA，引物和探針位於結核分枝桿菌複合群16srRNA區域，目的擴增片段為100 bp，擴增序列為GGGATGCATGTCTTGTGGTGGAAAGCGCTTTAGCGGTGTGGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTGACGGCCTACCAAGGCGACGACGG引物和探針序列為逆轉錄引物CCGTATCTCAGTCCCAGTGT上遊引物MTBC F: GGGATGCATGTCTTGTGGTG下遊引物MTBC R: CCGTCGTCGCCTTGGTAGTaqman探針序列5' FAM CGGGCTCATCCCACACCGCTA TAMRA 3'；(2)定量標準品的構建根據確定的PCR產物，利用DNA重組技術將包含目的擴增片段的基因克隆到質粒載體pGEM T Easy 中，構建的重組質粒作為檢測結核桿菌複合群的定量標準品；(3)樣本中結核分枝桿菌複合群的分離及其核酸的提取，使提取的樣本中同時含有DNA與RNA成分；(4)對提取的同一例樣本分別進行RT PCR和PCR，計算出起始樣本中RT PCR/PCR的拷貝數比值，從而區分樣本中死菌與活菌。
2.一種結核分枝桿菌複合群特異性定量RT-PCR引物和探針，擴增序列為 GGGATGCATGTCTTGTGGTGGAAAGCGCTTTAGCGGTGTGGGATGAGCCCGCGGCCT ATCAGCTTGTTGGTGGGGTGACGGCCTACCAAGGCGACGACGG其特徵在於逆轉錄引物為CCGTATCTCAGTCCCAGTGT上遊引物為MTBC-F: GGGATGCATGTCTTGTGGTG下遊引物為MTBC-R: CCGTCGTCGCCTTGGTAGTaqman 探針序列為5，-FAM-CGGGCTCATCCCACACCGCTA-TAMRA-3，。
全文摘要
本發明屬於生物工程檢測技術領域，具體為一種結核分枝桿菌複合群的螢光定量RT-PCR檢測方法。本發明包括如下步驟結核分枝桿菌複合群特異性定量RT-PCR引物和探針設計；標準分子的構建；細菌樣本RNA與DNA的共同提取；對同一份樣本分別進行RT-PCR和PCR；螢光定量PCR檢測方法的建立和優化。用本發明的方法檢測結核分支桿菌複合群具有快速簡單、靈敏度高、特異性強、且能區分死菌與活菌的優點，解決了現有檢測方法中檢測周期長、陽性率低、不能區分死活菌的不足，具有重要的的實際應用價值。
文檔編號G01N21/64GK101974630SQ201010522800
公開日2011年2月16日 申請日期2010年10月28日 優先權日2010年10月28日
發明者吳偉, 姜麗娟, 李瑤 申請人:復旦大學