霍亂弧菌口服活菌苗的製作方法
2023-05-03 08:35:21
專利名稱：霍亂弧菌口服活菌苗的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種霍亂工程菌複合苗的製備和應用。
霍亂是由定居在小腸的非侵襲性霍亂弧菌引起的烈性腸道傳染病，傳播快、波及面廣、危害嚴重。自1883年Koch分離到霍亂病原菌——霍亂弧菌以來，人們就開始了霍亂免疫預防的研究，至今已百餘年，尚無理想的霍亂菌苗問世。全細胞死菌苗的保護率僅約為50％，保護持續時間短(約半年)且要多次口服，至今未被世界衛生組織認可。早期人們篩選的天然減毒株和化學方法誘變的減毒株，或因免疫效力低下，或因突變位點不明、理論上可發生回復突變以及由於毒素基因的缺失而無抗毒保護等缺陷未被接受。
隨著分子生物學技術的發展，近年來各國學者採用基因重組技術，相繼研製了多種菌苗候選株，歸納起來主要有兩大類。一類是加法苗，但遺憾的是此類菌苗由於尚無合適的腸道受體菌，從而不能產生有效的保護；第二類是減法苗，在這一類中最為突出的例子是美國菌苗發展中心(CVD)研製的CVD系列菌苗株；但到目前為止，所構建的此類菌苗仍有部分殘留毒性，使其應用受到一定限制。以抗生素抗性為選擇壓力的基因表達系統存在著(1)．質粒的穩定性依賴於抗生素選擇性壓力的持續存在；(2)．含抗生素抗性質粒的菌苗用於人或動物，有可能造成抗性的擴散，給臨床治療帶來困難等缺陷。另外，將外源基因整合到宿主菌染色體上，在體外可以穩定地保留並表達外源基因，雖然可解決和避免以抗生素抗性作為穩定因子的質粒穩定性問題，但該系統基因的表達水平明顯低於以質粒作為載體的克隆子，其刺激機體免疫應答的能力也明顯低於後者。至今，還無一種商品化的霍亂菌苗問世。
霍亂的免疫特徵為以抗菌免疫為主，抗菌與抗毒免疫協同作用，刺激腸道局部產生分泌性IgA抗體。早在六十年代，人們就認識到CT(霍亂腸毒素)是霍亂弧菌致瀉的主要毒力因素。CT是一種活性多聚體蛋白，由有腺苷酸轉移酶活性的A亞單位及5個相同的與腸上皮細胞上的神經節苷脂受體GM1結合的B亞單位非共價結合而成。CT的毒性作用與免疫原性在構建霍亂菌苗時是相互矛盾的兩個方面，義大利Biocine公司應用蛋白質工程技術，通過寡核苷酸介導的定位突變，將ctx基因的第63位絲氨酸突變成賴氨酸，使CT蛋白構象改變，而變為無毒的霍亂腸毒素(CT*)，但仍可表達並分泌完整的CT*毒素蛋白，並可與GM1受體及抗A和抗B亞單位的單抗結合。IEM101是本室篩選出的一株無毒的ctx(霍亂腸毒素基因)基因天然缺失的EVC(埃爾託霍亂弧菌)菌株，動物實驗有較好的保護力，人體志願者一次口服免疫，在人體可定居4-9天，並能刺激機體產生血清和腸道局部特異性保護抗體，無明顯毒副作用，為理想的菌苗候選株。但該菌株由於缺少ctx基因，免疫機體後只產生抗菌免疫，不產生抗毒免疫。
本發明的目的是首先選育出霍亂弧菌IEM101菌株的thyA(胸苷酸合成酶基因)基因缺陷受體菌株，進而應用以thyA基因為選擇壓力的染色體——質粒致死平衡系統，將無毒的CT*毒素基因ctx*(含有點突變的霍亂腸毒素基因)和ct-B(霍亂腸毒素B亞單位基因)基因分別引入，構建成能表達CT*或CT-B(霍亂腸毒素B亞單位)的霍亂弧菌抗菌抗毒口服活菌苗，並通過家兔主動保護試驗評價它們的免疫原性及主動保護力，為霍亂病的防治提供口服活菌苗候選株。本發明的菌株已於1998年12月16日保存於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC NO.0377.1和CGMCC NO.0377.2。
本發明的內容與要點本發明包括霍亂弧菌菌株、其生產方法及其使用方法。所說的霍亂弧菌菌株不僅可用作廉價表達系統，批量生產多肽、蛋白質、細胞因子等生物活性物質，還可用作口服活菌苗菌株。
一．thyA基因缺陷的霍亂弧菌IEM101菌株的選育。菌苗的起始材料是天然無毒的O1群霍亂弧菌IEM101菌株(中國預防醫學科學院流行病學微生物學研究所保存)。本發明在改良MM基本培養基的基礎上，選育出一株生長良好且生物學性狀穩定的霍亂弧菌IEM101菌株的thyA基因缺陷株PL102，作為下一步實驗的受體菌株。
二．霍亂弧菌以thyA基因為選擇壓力的染色體——質粒致死平衡系統的構建(圖4)。本發明用PCR(聚合酶鏈反應)擴增大腸桿菌的thyA基因，PCR產物經地高辛標記後作為探針與IEM101的染色體DNA進行同源性分析，進而將該PCR產物克隆到質粒載體pUC18上，再轉化到PL102菌株中，獲得含有pXXB106質粒的轉化子，並進行質粒穩定性試驗。
三．霍亂弧菌抗菌抗毒口服活菌苗的構建(圖8、10)。質粒CT-K63經限制性內切酶切後，回收攜帶有ctx*基因的目的片段，平端連入pUC18載體，再將大腸桿菌的thyA基因連入該重組質粒後，經限制性內切酶切去部分Ap(氨苄青黴素)基因片段，導入PL102中構建成含全ctx*基因的菌苗候選株。根據已報導的ctx基因序列設計一對引物擴增ct-B基因，將PCR產物克隆到pUC18載體上，再將大腸桿菌的thyA基因連入該重組質粒後，經限制性內切酶切去除部分Ap基因片段，導入PL102中，構建成僅含ct-B基因的菌苗候選株。
四．本發明中菌株的特徵1．IEM104和IEM105的生物學性狀(1)血清型霍亂弧菌EVC小川型。
(2)生化反應發酵葡萄糖、蔗糖、半乳糖、麥芽糖、左旋糖、甘露醇、甘露糖、糊精和可溶性澱粉，產酸不產氣；不發酵木膠糖、水楊素、肌醇、衛茅醇、阿拉伯糖；溶血試驗陽性。
(3)噬菌體-生物型1a.2．GM-ELISA檢測ctx*和ct-B基因的表達無論是培養上清液還是細胞裂解物，均以20倍濃縮後測定CT*或CT-B的表達和分泌。陽性對照為霍亂弧菌高產毒株569B的20倍濃縮液，陰性對照為大腸桿菌DH5α的20倍濃縮細胞裂解物。P/N≥2.0為陽性。
表1CT*和CT-B表達的GM1-ELISA檢測
注誘導為在培養物中加入IPTG誘導重組子中目的基因的表達。
569B為陽性對照，DH5α為陰性對照。
P/N≥2.0為陽性，P/N＜2.0為陰性。3．毒力測定家兔小腸結紮測毒將IEM104和IEM105菌分別接種於5ml產毒培養基中，37℃靜止培養48小時後，離心收集菌沉澱，用生理鹽水稀釋到108CFU，取1ml腸內注射，結果IEM104和IEM105的腸段積液量均為0ml/cm(大於1.0ml/cm為陽性)。4．IEM104和IEM105在家兔的免疫原性檢測IEM101、IEM104和IEM105分別免疫家兔後不同時期檢測PBL(外周血淋巴細胞)分泌抗CT-IgG、血清抗CT-IgG、血清殺弧菌抗體滴度和血清凝集抗體滴度，結果見表2、3、4、5。
表2免疫後不同時期PBL分泌抗CT-IgG ELISA檢測結果
注以上數值為各組P/N平均值，P/N≥2.0為陽性，P/N＜2.0為陰性。表3免疫後不同時期血清抗CT-IgG ELISA檢測結果
注以上數值為各組P/N平均值，P/N≥2.0為陽性，P/N＜2.0為陰性。表4免疫後不同時期血清殺弧菌抗體滴度
注表中數值為各組抗體滴度的平均值(1)實施例8
實施例9
實施例10
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IEM101、IEM104和IEM105經家兔腸道免疫28天後，用EVC吳江-2(稻葉)，濱-43(小川)和CVC(古典型霍亂弧菌)1119(稻葉)、395(小川)及不同劑量的純CT毒素攻擊。結果見表6。
本發明在構建霍亂菌苗候選株的過程中應用的以非抗生素抗性thyA基因為選擇壓力的染色體——質粒致死平衡系統，是以細菌的管家基因缺陷菌株作為受體菌，在質粒上克隆入完整的受體菌缺陷的基因，作為外源基因表達載體穩定的選擇性壓力。該系統較好地解決了質粒穩定性和以抗生素抗性作為選擇壓力的問題，並能高效表達外源基因。同時由於thyA基因缺失突變株本身是減毒的，帶有thyA基因的質粒的丟失並不會增加宿主的毒性，因而該系統是安全的。再者，由於霍亂弧菌本身具有良好的分泌性，在該菌中表達的基因產物可較好地分泌至胞外，利於表達產物的分離與純化。因此該系統在霍亂弧菌中的應用，提供了一種大量生產外源基因產物的良好體系。
本發明的霍亂弧菌菌株含有全ctx*或ct-B基因，除具有出發菌株IEM101的一切特性外，還具有它們各自攜帶的外源基因的特徵，均能刺激機體產生抗菌與抗毒免疫，且免疫後的家兔能抵抗至少2μg純CT毒素的攻擊，以及較出發菌株IEM101高劑量的野生霍亂弧菌毒株的攻擊。
實施例1．將生長於LB培養基上的霍亂弧菌IEM101菌株轉種、活化，塗於MM選擇培養基上(配方為MM改良培養基，TMP終濃度15μg/ml，胸腺嘧啶核苷終濃度50μg/ml),37℃靜止培養18-24小時，挑取生長良好的抗TMP單菌落若干，接種MM選擇培養基、含胸腺嘧啶核苷MM改良培養基及MM改良培養基(配方為MM培養基，0.5％酪蛋白水解物，0.3％無水亞硫酸鈉，1％檸檬酸鈉，1％蔗糖)，在前兩種培養基上thyA基因缺陷菌株生長良好，菌落形態與野生菌株一致，而在後一種培養基上霍亂弧菌thyA基因缺陷株不生長。我們把霍亂弧菌IEM101菌株的thyA基因缺陷株命名為PL102。
實施例2．PL102菌株分別在LB、MM改良培養基和含50μg/ml胸腺嘧啶核苷的MM改良液體培養基中連續傳代，每10代取各培養物適量塗於MM改良培養基上，觀察發生回復突變的情況。結果傳至100代，共集菌10次，均未發現有回覆突變株出現，故可認為PL102無論是在胸腺嘧啶核苷豐富還是貧乏的環境下，均能保持突變性狀穩定。
實施例3．根據已報導的大腸桿菌thyA基因序列設計了一對引物，它們的序列如下P1:5』-CCT GAG CTC CTG ATT GGT TAC GGC G-3』P2:5』-GCA GGT ACC CCA GTT TCT ATT TCT TCG-3』為便於克隆，在P1的5』端加有SacⅠ酶切位點。
按以下參數預變性94℃4分鐘；後續循環94℃1分鐘，57℃1分鐘，72℃1分鐘末輪循環72℃7分鐘擴增，得到1.13Kb的PCR產物(圖1)。
實施例4．大腸桿菌thyA基因PCR產物純化後按地高辛標記試劑盒說明書進行標記，並按文獻常規打點雜交，在68℃、53℃和42℃分別與霍亂弧菌IEM101的染色體DNA進行同源性分析(圖2)。在這三種溫度條件下均沒有特異的雜交出現，表明兩者基因的同源性很低，這樣它們在體內發生同源重組的機率大為降低，平衡系統也更為穩定。
實施例5．PCR擴增大腸桿菌thyA基因產物用Klenow酶補平後再用SacⅠ酶切，載體pUC18用SacⅠ-SmaⅠ雙酶切後，連接兩片段，重組質粒命名為pXXB106(圖3、4)。將pXXB106電擊轉化霍亂弧菌(電擊緩衝液為272mmol/L蔗糖，7mmol/L Hepes,pH7.3,1mmol/L氯化鎂，15％丙三醇，電擊參數為2.5KV,25μF,4.8mS，外接600Ω電阻)，得到PL103菌株。
實施例6．重組株質粒穩定性實驗在MM改良培養基、含50μg/ml胸腺嘧啶核苷的MM改良培養基和LB培養基中，傳代含pXXB106質粒的PL103菌株，各傳100代，每10代取各培養物適量，塗於含50μg/ml胸腺嘧啶核苷的MM改良培養基平板上，37℃過夜培養後，隨機挑取100株點種於MM改良培養基，計算每100株菌中質粒丟失率，並提取質粒證實。實驗表明，PL103在MM改良培養基和LB培養基中是較穩定的，最小穩定性也在95％以上，而在含50μg/ml胸腺嘧啶核苷的MM改良培養基中傳至50代時，僅有12％的菌株尚含有質粒，即在胸腺嘧啶核苷豐富(50μg/ml)的培養基中，PL103的穩定性僅為12％(圖5)。
實施例7．用HaeⅢ酶切質粒CT-K63，以ctxA標記的探針作Southern blot雜交分析，表明ctx*基因在2Kb片段中(圖6)，回收該片段平端連入經HincⅡ酶切的pUC18載體上，該重組質粒用PstⅠ酶切後補平，將大腸桿菌thyA基因平端連入，再用PvuⅠ酶切去除部分Ap基因後自連，電擊轉入PL102中，獲得含pXXB110質粒(圖7、8)的轉化子，即霍亂弧菌菌苗候選株IEM105。
實施例8．根據已報導的ctx基因序列設計了一對僅擴增ct-B基因的引物序列P3:5』-AAG GAT GAA TTC ATG ATT AAA-3』P4:5』-GCA GAT CTT TAA TTT GCC ATA C-3』PCR產物經EcoRⅠ酶切後連入EcoRⅠ-SmaⅠ酶切的pUC18載體上，再將大腸桿菌thyA基因平端連入該重組質粒的BglⅡ酶切後補平的位點上，用PvuⅠ酶切去除部分Ap基因後自連，獲得含質粒pXXB111(圖9、10)的轉化子，即霍亂弧菌菌苗候選株IEM104。
本發明中所使用的限制性內切酶、連接酶、地高辛試劑盒和化學試劑等均可在市場上購得。
圖1大腸桿菌thyA基因的PCR擴增1．Marker:λDNA/HindⅢ+EcoRⅠ 2．PCR產物(1.13Kb)3．空白對照 4．IEM101為模板的PCR擴增5．Marker:λDNA/HindⅢ圖2大腸桿菌thyA基因探針與IEM101染色體DNA在42℃、53℃和68℃雜交結果1．大腸桿菌染色體DNA(陽性對照)2．霍亂弧菌IEM101染色體DNA3．asd基因PCR產物(陰性對照)4．霍亂弧菌395染色體DNAA:42℃ B:53℃ C:68℃圖3重組質粒pXXB106酶切鑑定結果1．Marker:λDNA/HindⅢ 2．pXXB106質粒(3.8Kb)3．pUC18質粒圖4重組質粒pXXB106的構建1．氨苄青黴素抗性基因2．Lac啟動子3．複製起始區4．大腸桿菌thyA基因10．限制性內切酶位點SacⅠ11．限制性內切酶位點SmaⅠ12．限制性內切酶位點HindⅢ 13．限制性內切酶位點SphⅠ15．限制性內切酶位點XbaⅠ16．限制性內切酶位點BamHⅠ17．限制性內切酶位點EcoRⅠ 18．限制性內切酶位點HincⅡ圖5質粒的穩定性(平衡系統的穩定性)1．MM改良培養基 2．LB培養基3．含50μg/ml胸腺嘧啶核苷的MM改良培養基圖6質粒CT-K63HaeⅢ酶切後與ctxA探針Southern blot雜交結果1．CT-K63質粒 2．CT-K63/HaeⅢ 3．Marker:λDNA/HindⅢ圖7重組質粒pXXB110酶切鑑定結果1．Marker:λDNA/HindⅢ2．pXXB110質粒(4.9Kb)3．pXXB108質粒圖8重組質粒pXXB110的構建1．氨苄青黴素抗性基因 2．Lac啟動子3．複製起始區 4．大腸桿菌thyA基因5．ctx*基因 6．ace基因7．zot基因 9．RSl基因10．限制性內切酶位點SacⅠ 11．限制性內切酶位點SmaⅠ12．限制性內切酶位點HindⅢ 13．限制性內切酶位點SphⅠ16．限制性內切酶位點BamHⅠ 17．限制性內切酶位點EcoRⅠ18．限制性內切酶位點HincⅡ 19．限制性內切酶位點HaeⅢ21．限制性內切酶位點PvuⅠ圖9重組質粒pXXB111酶切鑑定結果1．pXXB109質粒 2．pXXB111質粒(3.3Kb)3．Marker:λDNA/HindⅢ圖10重組質粒pXXB111的構建1．氨苄青黴素抗性基因3．複製起始區4．大腸桿菌thyA基因 8．ct-B基因10．限制性內切酶位點SacⅠ12．限制性內切酶位點HindⅢ13．限制性內切酶位點SphⅠ16．限制性內切酶位點BamHⅠ17．限制性內切酶位點EcoRⅠ 18．限制性內切酶位點HincⅡ21．限制性內切酶位點PvuⅠ22．限制性內切酶位點BglⅡ
權利要求
1．霍亂弧菌口服活菌苗，其特徵在於首先選育出thyA基因缺陷的霍亂弧菌受體菌株，然後構建以thyA基因為選擇壓力的霍亂弧菌染色體——質粒致死平衡系統，再將無毒的CT*毒素基因ctx*和ct-B基因分別引入，構建成能表達CT*或CT-B的霍亂弧菌抗菌抗毒口服活菌苗。
2．按照權利要求1所述的霍亂弧菌口服活菌苗，其特徵是在含有胸腺嘧啶核苷和TMP的MM改良培養基上，選育出霍亂弧菌IEM101菌株的thyA基因缺陷株。
3．按照權利要求1所述的霍亂弧菌口服活菌苗，其特徵是用PCR方法獲得大腸桿菌的thyA基因。
4．按照權利要求3所述的霍亂弧菌口服活菌苗，其特徵是將上述PCR產物與質粒載體pUC18連接，然後轉化thyA基因缺陷的霍亂弧菌IEM101菌株，獲得含有pXXB106質粒的轉化子。
5．按照權利要求1所述的霍亂弧菌口服活菌苗，其特徵是用質粒CT-K63上的具有點突變的霍亂弧菌ctx*基因與質粒載體pUC18連接，再將大腸桿菌thyA基因的PCR產物連入，去除大部分Ap基因後，轉化thyA基因缺陷的霍亂弧菌IEM101菌株，獲得含有全ctx*基因的轉化子IEM105。
6．按照權利要求1所述的霍亂弧菌口服活菌苗，其特徵是用PCR方法獲得霍亂弧菌ct-B基因。
7．按照權利要求6所述的霍亂弧菌口服活菌苗，其特徵是將上述PCR產物與質粒載體pUC18連接，再將大腸桿菌thyA基因的PCR產物連入，去除大部分Ap基因後，轉化thyA基因缺陷的霍亂弧菌IEM101菌株，獲得含有霍亂弧菌ct-B基因的轉化子IEM104。
8．按照權利要求5、7所述的霍亂弧菌口服活菌苗，其特徵是用霍亂弧菌菌苗候選株IEM104和IEM105製備口服活菌苗。
全文摘要
本發明提供了兩株可用於人霍亂病防治的口服活菌苗候選株,其特徵在於首先選育出thyA基因缺陷的零亂弧菌IEM101受體菌株,進而構建以thyA基因為選擇壓力的霍亂弧菌染色體—質粒致死平衡系統,再應用該系統構建了霍亂弧菌抗菌抗毒口服活菌苗候選株,它們能表達霍亂弧菌菌體O抗原和毒素抗原,在兔腸段結紮模型上有較好的安全性、免疫原性和保護力。
文檔編號A61K39/106GK1235053SQ9910005
公開日1999年11月17日 申請日期1999年1月4日 優先權日1999年1月4日
發明者祁國明, 夏曉濱, 劉延清 申請人:中國預防醫學科學院流行病學微生物學研究所