血根鹼的新用途的製作方法
2023-05-03 04:15:51 2
專利名稱：血根鹼的新用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及血根鹼的新用途。
背景技術：
端粒DNA是位於染色體末端並對染色體具有保護作用的富含鳥嘌呤(G)的 DNA序列，它由一段雙鏈重複區域和一段單鏈重複區域構成，人類和哺乳動物的 重複序列單元為TTAGGG。富含G的DNA單鏈在陽離子的誘導下可以通過G鹼 基間Hoogsteen氫鍵形成四鏈體(G4)。研究表明，85~90%惡性腫瘤的發病都與 端粒酶的活性有關，而DNAG4結構的形成可以有效抑制端粒酶的活性，進而達到 抑制腫瘤細胞生長的目的。因此，能夠誘導DNA G4形成並使之穩定的化合物有望 成為抗腫瘤的先導化合物，成為目前研究的熱點。
大量研究表明，單鏈DNA (序列為TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG， 簡稱為Hum24)在Na+溶液中形成反平行結構G4，在K+溶液中形成平行和反平行 共存的G4混合結構。
發明內容
本發明的目的是提供血根鹼的一種新用途。
本發明所提供的血根鹼的用途是血根鹼或其藥學上可接受得鹽在製備預防和/
或治療腫瘤藥物中的應用，所述血根鹼的結構式如下
式(I )。
所述血根鹼藥學上可接受的鹽具體可為氯鹽。
所述血根鹼或其藥學上可接受的鹽，適合於製備預防和/或治療人肝癌和皮膚癌 藥物，優選為製備預防和/或治療人肝癌藥物。
所述預防和/或治療腫瘤藥物可通過注射、噴射、滴鼻、滴眼、滲透、吸收、物 理或化學介導的方法導入機體如肌肉、皮內、皮下、靜脈、黏膜組織；或是被其他物質混合或包裹後導入機體。
以血根鹼或其藥學上可接受的鹽為活性成分的抗腫瘤藥物，需要的時候，在上 述藥物中還可以加入一種或多種藥學上可接受的載體。所述載體包括藥學領域常規 的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、溼潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、 吸附載體、潤滑劑等。
用血根鹼或其藥學上可接受的鹽製備的預防和/或治療腫瘤藥物可以製成注射 液、片劑、粉劑、顆粒劑、膠囊、口服液、膏劑、霜劑等多種形式。上述各種劑型 的藥物均可以按照藥學領域的常規方法製備。
血根鹼體外抗癌活性實驗結果表明血根鹼對癌細胞有很好的抑制作用。5|ig/ml 血根鹼對人肝癌細胞HEPG-2的抑制率為98%。
血根鹼抑瘤機理實驗結果表明，血根鹼是通過誘導人和哺乳動物端粒DNA形 成反平行G4結構來抑制腫瘤細胞生長。
圖1為人體端粒DNAHum24在未加入血根鹼和加入血根鹼的條件下構象變化 的圓二色譜圖(a)Hum24; (b)加入血根鹼，使Hum24與血根鹼的摩爾比為1 : 6; 每個譜圖的摩爾橢圓度為-4_10 (mdeg)。
圖2 (a)為血根鹼誘導單鏈Hum24形成反平行G4結構的熔點曲線圖；(b) 為Na+誘導單鏈Hum24形成反平行G4結構。
具體實施例方式
實施例l、 MTT還原法檢測血根鹼體外抗腫瘤活性實驗
MTT法的基本原理為四甲基偶氮唑鹽[MTT, 3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl) -2，5-diphenyl-tetrazoliumbromide](購自北京化學試劑公司)是一種能接受氫原子的 染料。活細胞線粒體中與NADP相關的脫氫酶在細胞內可將黃色的MTT轉化成不 溶性的藍紫色的formazon，而死細胞則無此功能。用DMSO溶解formazon後，在 一定波長下用酶標儀測定光密度值，即可定量測出細胞的存活率。按照公式可計算 腫瘤細胞生長抑制率(％) = (OD對照-OD實驗)/OD艦x 100%。
具體操作步驟如下
1)選用對數生長期的貼壁人肝癌細胞HEPG-2，用0.25 %胰酶消化後，用含IO % 小牛血清的RPMI 1640培養液配製成5000個/ml的細胞懸液，分別接種在96孔培養板 中，每孔接種lOOitil， 37°C， 5。/。C02培養24h。
42) 每孔加入血根鹼(成都思科華有限公司，純度為98%)溶液10pl，用RPMI 1640 培養液補充至每孔終體積為20(^1，使每孔中血根鹼終濃度為5pg/ml。設對照組， 加入200^1 RPMI 1640培養液。設空白組，每孔未接種細胞，只加入200 ul RPMI 1640 培養液。37°C， 5。/oC02培養3d。實驗設三次重複。
3) 棄上清液，每孔加入100^1新鮮配製的0.5 mg/mlMTT的無血清培養液，37 。C 繼續培養4h。小心棄上清，並加入200^1 DMSO溶解MTTformazon沉澱，用微型 超聲振蕩器混勻，在酶標儀上測定波長544nm處的光密度值。按照下述公式計算 腫瘤細胞生長抑制率，腫瘤細胞生長抑制率(％) = (OD對照-OD實驗)/OD對照 xl00% (其中OD對照、OD實驗為已經扣除OD空白的實驗數值)。實驗結果表 明血根鹼對人肝癌細胞HEPG-2的抑制率為98%。
實施例2、血根鹼抑瘤機理
在無金屬離子存在的條件下，溶液中Hum24呈單鏈構型存在，這種構型在圓 二色譜(CD)中有明顯的特徵在256nm附近出現一個正峰，在240nm附近出 現一個負峰。當單鏈Hum24溶液中加入一定濃度血根鹼時，Hum24由單鏈轉化為 一種反平行的G4結構，在CD譜中有明顯的特徵為在290nm附近出現一個正峰， 在260 nm附近出現一個負峰。
具體的實驗方法如下緩衝溶液為由如下終濃度的物質組成的水溶液10 mM Tris-HCl， lmM EDTA; pH 7.4。將30 OD單鏈Hum24 (上海英俊生物技術有限公 司)(其序列如序列表中序列1所示)溶解在所述緩衝溶液中得到濃度為250 ^M的 Hum24母液。將0.5mg血根鹼溶解在所述緩衝溶液中得到濃度為180 血根鹼 母液。將血根鹼母液用所述緩衝溶液稀釋成濃度分別為0.2pM、 0.6pM、 lpM、 2pM、 4pM、 8pM、 12pM、 14pM、 16pM、 18pM、 20|iM、 22(iM的血根鹼溶液。取250 pM的單鏈Hum24溶液分別加入上述濃度的血根鹼溶液，使混合溶液中單鏈Hum24
與血根鹼的摩爾比分別為i : o.i， i : 0.3， i : 0.5， i : i， i : 2， i : 4， i : 6， i : 7， l:8， l:9， i : io， i : 12。將上述混合溶液，均在25 。c孵育12h，採用圓二色
譜儀測定其構象的變化情況。實驗結果表明，單鏈Hum24與血根鹼的摩爾比大於 等於1 : 1時都可以明顯看到G4反平行結構的特徵峰，當單鏈Hum24與血根鹼的 摩爾比為1 : 6時已經能夠完全形成反平行G4結構。其中，單鏈Hum24與血根鹼 摩爾比為1 : 6時形成的反平行G4結構的圓二色譜圖如圖1中b所示。
通過變溫CD表徵由血根鹼誘導形成的反平行G4結構的熱穩定性。DNA的熔點(Tm)反映了它的熱穩定性。熔點越高說明該DNA越穩定，反之，熔點越低該 結構越不穩定。Hum24G4的熔點是指G4結構分解50y。時的溫度。通過檢測此反 平行G4結構在2卯nm的CD信號隨著溫度升高的降低來得到它的熔點。
具體的實驗方法如下將以單鏈Hum24與血根鹼摩爾比為1 : 6時形成的反平 行G4結構通過圓二色譜變溫測定實驗進行熔點的測定。採用的儀器為Jasco815圓 二色譜儀，CD實驗中採用的CD吸收池光程為lcm。在進行CD實驗前用高純N2 除氧5分鐘，而且實驗中也一直用高純N2作為保護氣以保證沒有臭氧出現，CD實 驗數據採集前，用緩衝溶液進行基線校對。在近紫外區220nm-320nm採集CD光 譜，掃描速度為500 nm/min，採集次數為4次。在變溫實驗中採用JascoPTC-423S 控溫儀，升溫速度為2°C/min，通過監控2卯nm CD信號來進行G4熔點的測定， 結果如圖2所示。變溫CD結果表明，此反平行G4結構的熔點為43'C (熔點圖如 圖2a所示)，比Na+誘導形成的反平行結構穩定(熔點圖如圖2b所示)，說明血 根鹼誘導形成的反平行G4結構是比較穩定的。
說明血根鹼是通過誘導人和哺乳動物端粒DNA形成反平行G4結構來抑制腫 瘤細胞的生長。序列表
1
1 24 DNA 人工序列
1
ttagggttag ggttagggtt aggg
權利要求
1、血根鹼或其藥學上可接受的鹽在製備預防和/或治療腫瘤藥物中的應用，所述血根鹼的結構式如式(I)所示式(I)。
2、 根據權利要求l所述的應用，其特徵在於所述血根鹼藥學上可接受的鹽 為氯鹽。
3、 根據權利要求1或2所述的應用，其特徵在於所述腫瘤為人肝癌。
4、 一種預防和/或治療腫瘤的藥物，它的有效成分為下述式(I)所示的血根鹼 或其藥學上可接受的鹽formula see original document page 2式(I)。
5、 根據權利要求4所述的藥物，其特徵在於所述血根鹼藥學上可接受的鹽 為氯鹽。
6、 根據權利要求4或5所述的藥物，其特徵在於所述腫瘤為人肝癌。
全文摘要
本發明公開了血根鹼的一種新用途。該用途是血根鹼或其藥學上可接受的鹽在製備預防和/或治療腫瘤藥物中的應用，特別是在製備預防和/或治療人肝癌藥物中的應用；所述的血根鹼，其結構如式(I)所示。抗癌活性實驗結果表明血根鹼對癌細胞有較好的抑制作用。5μg/ml的血根鹼對人肝癌細胞HEPG-2的抑制率為98％。
文檔編號A61K31/4741GK101564392SQ20081010501
公開日2009年10月28日 申請日期2008年4月25日 優先權日2008年4月25日
發明者向俊鋒, 唐亞林, 徐廣智, 舒 楊 申請人:中國科學院化學研究所