從枇杷葉中分離純化熊果酸的方法
2023-05-02 22:35:36
專利名稱：從枇杷葉中分離純化熊果酸的方法
技術領域：
本發明涉及一種從植物中提取藥用活性成分的綠色化學生產方法，更具體涉及從枇杷葉中分離純化熊果酸的方法。
背景技術：
中國是世界上最主要的枇杷生產國，枇杷栽培面積和產量約佔全球的2/3以上，其主產區為福建莆田、浙江塘栖和江蘇洞庭山。福建莆田現有枇杷種植面積16萬畝，約佔全球的1/6、全國的1/4和福建省的1/2。
枇杷全身皆寶，枇杷葉、花、果、核等部位富含三萜酸(可高達1.5％)、揮髮油、苦杏仁苷、皂苷、黃酮、水溶性多糖和有機酸等活性成分。目前，枇杷是以鮮果供應為主，尚未進行其它部位的深度開發和綜合利用。
枇杷葉系薔薇科植物枇杷[Eriobotrya japonica(Thunb.)Lindl.]的葉子，富含熊果酸(Ursolic acid，UA)和齊墩果酸(Oleanolic acid，OA)等三萜酸，性微寒，味苦辛，止咳平喘，清肺和胃，降氣化痰，收載於歷版中國藥典。傳統中醫臨床常以蜜炙枇杷葉或枇杷葉與其它中藥配伍成複方藥入藥，取得了一定的化痰止咳、消炎平喘等臨床療效。
熊果酸和齊墩果酸為兩個同分異構體，為五環三萜類化合物，分子式為C30H48O3，性質極為相似，在植物中常常共存，給分離測定帶來一定難度。紅外光譜根據區域A(1355～1392cm-1)和區域B(1245～1330cm-1)的碳氫吸收來區別骨架類型，齊墩果酸在A區有兩個峰，B區有三個峰，熊果酸在A區和B區各有三個峰，以此可區分兩者。
由於熊果酸和齊墩果酸的結構複雜，人工合成困難，國內外均自中草藥或植物中提取。熊果酸和齊墩果酸均為白色結晶性粉末，熔點310℃，無臭，無味，易溶於二氧六環吡啶，可溶於甲醇、乙醇等極性有機溶劑，微溶於氯仿、乙醚等脂溶性溶劑，不溶於石油醚和水。
熊果酸以游離形式或糖苷形式廣泛分布於約27個科62種植物，如山楂、熊果、烏梅、陸英、白花蛇舌草、枇杷葉、車前草、女貞子等植物中；齊墩果酸以游離形式或糖苷形式廣泛存在於約60個科190種植物，如遼東惚木、青葉膽、女貞子、枇杷葉、雪膽等植物中。現代藥學研究表明，熊果酸和齊墩果酸均具有消炎、增強免疫、抑制血小板凝集、降糖、抗癌等臨床藥理作用，是治療急性黃膽型肝炎和慢性病毒性肝炎的理想藥物，且毒性低副作用少。
在枇杷產區，枇杷葉、花、核這些具有較高附加值的部分基本上被浪費掉，沒有得到應有的應用。通常在不影響枇杷果生產的前提下，全國可年採收枇杷葉幹品5萬噸。因此，對枇杷葉進行深度開發利用，有利於促進枇杷產業的可持續健康發展，對綜合利用枇杷資源，提高枇杷的經濟價值，開發新產品，具有十分重要的社會效益和經濟價值。
發明內容
本發明的目的在於提供從枇杷葉中分離純化熊果酸的方法。該製備方法採用親水性有機溶劑提取、除雜、活性炭脫色、沉澱分離，大孔吸附樹脂富集、純化，親水性有機溶劑萃取、結晶和重結晶處理等一系列分離純化集成技術，從枇杷葉中製備高純度熊果酸晶體，不僅製備工藝簡單、分離純化效率高、容易工業化生產，而且製備的熊果酸純度高、生產成本低。
本發明的從枇杷葉中分離純化熊果酸的方法步驟為(1)枇杷葉總三萜酸的溶劑提取以枇杷葉為原料，採用5～20倍枇杷葉乾重(W/W)的含水量不超過30％(W/W)的親水性有機溶劑水溶液，於50～80℃條件下提取1～3次，每次1～3小時，合併提取液，過濾，濾液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃條件下，經減壓回收溶劑、真空濃縮成枇杷葉總三萜酸提取物；(2)枇杷葉總三萜酸的除雜處理50～80℃條件下，枇杷葉總三萜酸提取物用不低於3倍量(W/W)的含水量不超過20％(W/W)的親水性有機溶劑，水溶液充分萃取枇杷葉總三萜酸，靜置陳化、過濾去除不溶物，濾液趁熱進行活性炭脫色；(3)枇杷葉總三萜酸的沉澱分離脫色後的濾液趁熱加入三萜酸溶解度調節劑，控制體系中親水性有機溶劑終濃度為20～40％和pH值1.5～5.5，緩慢冷卻至開始析出枇杷葉總三萜酸沉澱、4～10℃冷藏、放置陳化、過濾，得枇杷葉總三萜酸粗品；(4)熊果酸的樹脂富集枇杷葉總三萜酸粗品用不低於3倍量(W/W)的20～40％(W/W)的親水性有機溶劑水溶液溶解充分，過濾去除不溶物，調整濾液體系中熊果酸終濃度達到0.5～5g/L；濾液經大孔吸附樹脂吸附熊果酸至飽和，先用不少於3倍樹脂量(W/W)的水洗去未被吸附的殘留液和吸附力較弱的水溶性雜質，再用不少於3倍樹脂量(W/W)的20～40％的親水性有機溶劑水溶液洗去中等極性雜質，最後用不低於3倍量(W/W)的含水量不超過20％(W/W)的親水性有機溶劑水溶液洗脫熊果酸；(5)熊果酸的沉澱分離熊果酸洗脫液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃條件下，經減壓回收部分溶劑後，加入熊果酸溶解度調節劑，控制洗脫液體系中親水性有機溶劑終濃度為20～40％和pH值1.5～5.5，緩慢冷卻至開始析出熊果酸結晶、4～10℃冷藏、靜置養晶、過濾，得熊果酸粗品；(6)熊果酸的結晶純化50～80℃條件下，熊果酸粗品用不低於3倍量(W/W)的親水性有機溶劑充分萃取熊果酸，過濾，濾液緩慢冷卻至開始析出熊果酸、4～10℃冷藏、靜置養晶、過濾、室溫條件下水洗，得熊果酸結晶。
本發明的顯著優點是
一本發明採用甲醇、乙醇、丙酮、丙醇或異丙醇中的一種或幾種混合溶劑作為親水性有機溶劑從枇杷葉中提取熊果酸，優點1甲醇、乙醇等親水性有機溶劑的溶解性能好，對枇杷葉細胞的穿透能力強，更容易滲透到枇杷葉內部組織結構中，大大提高了枇杷葉中熊果酸的溶出速率和提取效率；優點2熱的甲醇、乙醇等親水性有機溶劑對枇杷葉中熊果酸的溶解度很大，而對蛋白質、多糖、精油、無機鹽等雜質的溶解度較小，更利於後續進一步的分離純化獲得高純度熊果酸。
二本發明優先選用甲醇或丙酮作為親水性溶劑的優點為雖然甲醇、乙醇、丙酮、丙醇或異丙醇等親水性有機溶劑的分離效果相當，但相對於其它親水性有機溶劑而言，甲醇或丙酮的沸點更低、溶劑回收時能耗更小、回收率更高，能顯著降低產品的製備成本。
三本發明充分利用大孔吸附樹脂對熊果酸的吸附力與對蛋白質、多糖、無機鹽等雜質的吸附力的不同，以及在親水性有機溶劑水溶液中，以熊果酸為主要成分的枇杷葉總三萜酸與蛋白質、無機鹽等雜質的溶解度差異，真正達到熊果酸與雜質的高效分離。
四與已有的文獻相比，本發明充分利用熊果酸可溶於甲醇和乙醇等極性有機溶劑、微溶於氯仿和乙醚等脂溶性溶劑、不溶於石油醚和水的特點，不採用矽膠柱層析技術，而直接採用親水性有機溶劑萃取、結晶和重結晶處理等方式去除雜質，獲得高純度熊果酸，具有較大的推廣性。
五本發明組合採用採用親水性有機溶劑提取、除雜、活性炭脫色、沉澱分離，大孔吸附樹脂富集、純化，親水性有機溶劑萃取、結晶和重結晶處理等一系列分離純化集成技術，從枇杷葉中製備高純度熊果酸晶體，具有理論新穎、技術合理、操作安全、工藝簡便、經濟可行、環境友好等優點。
具體實施例方式
按照本發明內容所述的方法步驟實施從枇杷葉中分離純化熊果酸。
其中，步驟(6)中的熊果酸結晶還可以進一步在室溫條件下，用親水性有機溶劑重結晶，分別用氯仿、水和石油醚洗晶除雜，得高純度熊果酸晶體。
所用的親水性有機溶劑可以是甲醇、乙醇、丙酮、丙醇或異丙醇中的一種或幾種混合溶劑，優先選用甲醇或丙酮。
所用的大孔吸附樹脂的骨架的化學組成可以是聚苯乙烯和聚丙烯酸中的一種或兩種。
所用的三萜酸溶解度調節劑為無機酸水溶液、有機酸水溶液或酸性鹽水溶液中的一種或幾種，優先選用鹽酸水溶液或硫酸水溶液；熊果酸溶解度調節劑為無機酸水溶液、有機酸水溶液或酸性鹽水溶液中的一種或幾種，優先選用鹽酸水溶液或硫酸水溶液。
上述枇杷葉總三萜酸是熊果酸類化合物或齊墩果酸類化合物中的一種或幾種化合物。
經測定，枇杷葉總三萜酸粗品中熊果酸的純度≥25％；熊果酸粗品的純度≥80％；熊果酸結晶的純度≥95％；最終分離純化獲得的高純度熊果酸晶體的純度≥99％。
本發明理化參數測定方法如下枇杷葉總三萜酸、熊果酸和齊墩果酸的含量採用高效液相色譜儀測定。測定條件Agilent1100型高效液相色譜儀(DAD二極體陣列檢測器)，Waters Nova-Pak C18色譜柱(Φ3.9×150mm，5μm)，流動相為甲醇-0.2％磷酸水溶液(92∶8)(V/V)，流速1.0mL/min，柱溫34℃，進樣量20μL，檢測波長分別為220nm。熊果酸和齊墩果酸標準品購於中國藥品生物製品檢定所。
經測定，實驗所用福建省莆田市出產的枇杷葉(含水量4.2％)中枇杷葉熊果酸含量為7.8～11.3g/kg。
本發明製備方法的實施例陳述如下實施例1以福建莆田產枇杷葉為原料，將鮮枇杷葉水洗、乾燥(風乾、烘乾或曬乾均可)、粉碎、過20～30目篩得枇杷葉粉末，將2.6kg枇杷葉粉末放入提取罐中，用12倍枇杷葉粉末乾重(W/W)的85％的甲醇-丙酮(1∶1)水溶液，於72℃條件下回流提取2小時，過濾，濾液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃條件下，經減壓回收溶劑、真空濃縮成枇杷葉總三萜酸提取物；72℃條件下，枇杷葉總三萜酸提取物用3倍量(W/W)的pH值為10.9的90％甲醇-丙酮(1∶1)水溶液(W/W)充分萃取枇杷葉總三萜酸，靜置陳化、過濾去除不溶物，濾液趁熱添加1.3％(W/V)活性炭進行脫色；脫色後的濾液趁熱加入35％鹽酸水溶液，控制體系中甲醇-丙酮(1∶1)水溶液終濃度達40％(W/W)和pH值為1.5，緩慢冷卻至開始析出枇杷葉總三萜酸沉澱、4～10℃冷藏、放置陳化、過濾，得枇杷葉總三萜酸粗品。經測定，枇杷葉總三萜酸粗品中熊果酸的純度25.8％。
枇杷葉總三萜酸粗品用3倍量(W/W)的pH值為12.0的20％甲醇水溶液(W/W)溶解充分，過濾去除不溶物，調整濾液體系中熊果酸終濃度達到0.5g/L；濾液採用HZ816大孔吸附樹脂，以0.96倍樹脂量/小時的上柱流速(V/V)，動態吸附熊果酸至飽和，先用不少於3倍樹脂量的蒸餾水(V/V)洗去未被吸附的殘留液和吸附力較弱的水溶性雜質，再用8倍樹脂量的30％乙醇水溶液(V/V)分成2次，在76r/min的攪拌轉速條件下洗去中等極性雜質，最後用3倍樹脂量的無水甲醇，以0.56倍樹脂量/小時的流速(V/V)洗脫熊果酸，洗脫液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃條件下，經減壓回收部分溶劑後，加入30％硫酸水溶液，控制洗脫液體系中甲醇終濃度達20％(W/W)和pH值為1.5，緩慢冷卻至開始析出熊果酸結晶、4～10℃冷藏、靜置養晶、過濾，得米黃色熊果酸粗品。經測定，熊果酸粗品的純度80.2％。
50℃條件下，米黃色熊果酸粗品用6倍量(W/W)的甲醇-丙酮(1∶1)溶劑充分萃取熊果酸，過濾，濾液緩慢冷卻至開始析出熊果酸、4～10℃冷藏、靜置養晶、過濾、12℃條件下水洗，得白色熊果酸結晶。經測定，熊果酸結晶的純度95.6％。熊果酸結晶還可以進一步在室溫條件下，用甲醇重結晶，分別用氯仿、水和石油醚洗晶除雜，得高純度熊果酸晶體。經測定，高純度熊果酸晶體純度99.2％，枇杷葉中熊果酸回收率50.2％。
實施例2將20～30目經過石油醚脫脂的枇杷葉粉末2.8kg放入提取罐中，用20倍枇杷葉粉末乾重(W/W)的pH值為3.2的70％甲醇水溶液，於50℃條件下提取2次，每次3小時，合併提取液，過濾，濾液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃條件下，經減壓回收溶劑、真空濃縮成枇杷葉總三萜酸提取物；50℃條件下，枇杷葉總三萜酸提取物用15倍量(W/W)pH值為8.0的92％甲醇水溶液(W/W)充分萃取枇杷葉總三萜酸，靜置陳化、過濾去除不溶物，濾液趁熱添加0.5％(W/V)活性炭進行脫色；脫色後的濾液趁熱加入50％硫酸水溶液，控制體系中甲醇終濃度達20％(W/W)和pH值為4.5，緩慢冷卻至開始析出枇杷葉總三萜酸沉澱、4～10℃冷藏、放置陳化、過濾，得枇杷葉總三萜酸粗品。經測定，枇杷葉總三萜酸粗品中熊果酸的純度27.9％。
枇杷葉總三萜酸粗品用8倍量(W/W)的pH值為8.0的40％甲醇水溶液(W/W)溶解充分，過濾去除不溶物，調整濾液體系中熊果酸終濃度達到5g/L；濾液在68r/min的攪拌轉速條件下，直接採用HZ801大孔吸附樹脂對浸膏進行富集吸附熊果酸至飽和，先用不少於3倍樹脂量的蒸餾水(V/V)洗去未被吸附的殘留液和吸附力較弱的水溶性雜質，再用6倍樹脂量的35％的甲醇水溶液(V/V)以1.0倍樹脂量/小時的流速(V/V)洗去中等極性雜質，最後用6倍樹脂量的80％甲醇水溶液(V/V)分成2次，在100r/min的攪拌轉速條件下，洗脫熊果酸；洗脫液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃條件下，經減壓回收部分溶劑後，加入40％鹽酸水溶液，控制洗脫液體系中甲醇終濃度達40％(W/W)和pH值為4.5，緩慢冷卻至開始析出熊果酸結晶、4～10℃冷藏、靜置養晶、過濾，得米黃色熊果酸粗品。經測定，熊果酸粗品的純度82.5％。
80℃條件下，米黃色熊果酸粗品用3倍量(W/W)的甲醇充分萃取熊果酸，過濾，濾液緩慢冷卻至開始析出熊果酸、4～10℃冷藏、靜置養晶、過濾、31℃條件下水洗，得白色熊果酸結晶；經測定，熊果酸結晶的純度95.8％。熊果酸結晶還可以進一步在室溫條件下，用甲醇重結晶，分別用氯仿、水和石油醚洗晶除雜，得高純度熊果酸晶體。經測定，高純度熊果酸晶體純度99.1％，枇杷葉中熊果酸回收率52.3％。
實施例3將20～30目經過二氧化碳超臨界萃取脫油處理的枇杷葉粉末2.9kg放入提取罐中，用5倍枇杷葉粉末乾重(W/W)的無水甲醇，於80℃條件下回流提取2小時，過濾，濾液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃條件下，經減壓回收溶劑、真空濃縮成枇杷葉總三萜酸提取物；80℃條件下，枇杷葉總三萜酸提取物用10倍量(W/W)的pH值為8.9的80％甲醇水溶液(W/W)充分萃取枇杷葉總三萜酸，靜置陳化、過濾去除不溶物，濾液趁熱添加2.5％(W/V)活性炭進行脫色；脫色後的濾液趁熱加入飽和檸檬酸水溶液，控制體系中甲醇終濃度達25％(W/W)和pH值為5.5，緩慢冷卻至開始析出枇杷葉總三萜酸沉澱、4～10℃冷藏、放置陳化、過濾，得枇杷葉總三萜酸粗品。經測定，枇杷葉總三萜酸粗品中熊果酸的純度29.6％。
枇杷葉總三萜酸粗品用10倍量(W/W)的pH值為9.3的20％甲醇-丙酮(1∶1)水溶液(W/W)溶解充分，過濾去除不溶物，調整濾液體系中熊果酸終濃度達到0.5g/L；濾液採用HZ802大孔吸附樹脂，以0.59倍樹脂量/小時的上柱流速(V/V)，動態吸附熊果酸至飽和，先用不少於3倍樹脂量的蒸餾水(V/V)洗去未被吸附的殘留液和吸附力較弱的水溶性雜質，再用3倍樹脂量的40％的甲醇-丙酮(1∶1)水溶液(V/V)以0.5倍樹脂量/小時的流速(V/V)洗去中等極性雜質，最後用9倍樹脂量的90％甲醇-丙酮(1∶1)水溶液(V/V)以1.05倍樹脂量/小時的流速(V/V)洗脫熊果酸；洗脫液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃條件下，經減壓回收部分溶劑後，加入飽和檸檬酸水溶液，控制洗脫液體系中甲醇-丙酮(1∶1)終濃度達20％(W/W)和pH值為5.5，緩慢冷卻至開始析出熊果酸結晶、4～10℃冷藏、靜置養晶、過濾，得米黃色熊果酸粗品。經測定，熊果酸粗品的純度84.2％。
72℃條件下，米黃色熊果酸粗品用8倍量(W/W)的甲醇充分萃取熊果酸，過濾，濾液緩慢冷卻至開始析出熊果酸、4～10℃冷藏、靜置養晶、過濾、25℃條件下水洗，得白色熊果酸結晶；經測定，熊果酸結晶的純度96.3％。熊果酸結晶還可以進一步在室溫條件下，用甲醇重結晶，分別用氯仿、水和石油醚洗晶除雜，得高純度熊果酸晶體。經測定，高純度熊果酸晶體純度99.0％，枇杷葉中熊果酸回收率52.6％。
實施例4將20～30目經過6#溶劑脫脂處理過的枇杷葉粉末2.9kg放入提取罐中，用5倍枇杷葉粉末乾重(W/W)的pH值為6.1的95％乙醇水溶液，於80℃條件下提取3次，每次1小時，合併提取液，過濾，濾液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃條件下，經減壓回收溶劑、真空濃縮成枇杷葉總三萜酸提取物；80℃條件下，枇杷葉總三萜酸提取物用7倍量(W/W)的pH值為10.5的95％乙醇水溶液(W/W)充分萃取枇杷葉總三萜酸，靜置陳化、過濾去除不溶物，濾液趁熱添加2.5％(W/V)活性炭進行脫色；脫色後的濾液趁熱加入20％酸性磷酸鹽緩衝溶液，控制體系中乙醇終濃度達20％(W/W)和pH值為3.8，緩慢冷卻至開始析出枇杷葉總三萜酸沉澱、4～10℃冷藏、放置陳化、過濾，得枇杷葉總三萜酸粗品。
枇杷葉總三萜酸粗品用15倍量(W/W)的pH值為10.0的20％乙醇水溶液(W/W)溶解充分，過濾去除不溶物，調整濾液體系中熊果酸終濃度達到4.3g/L；濾液採用D101大孔吸附樹脂，在75r/min的攪拌轉速條件下，吸附熊果酸至飽和，先用不少於3倍樹脂量的蒸餾水(V/V)洗去未以被吸附的殘留液和吸附力較弱的水溶性雜質，再用7倍樹脂量的40％的乙醇水溶液(V/V)以1.03倍樹脂量/小時的流速(V/V)洗去中等極性雜質，最後用9倍樹脂量的80％乙醇水溶液(V/V)分成3次，在89r/min的攪拌轉速條件下，洗脫熊果酸，洗脫液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃條件下，經減壓回收部分溶劑後，加入20％酸性磷酸鹽緩衝溶液，控制洗脫液體系中乙醇終濃度達20％(W/W)和pH值為3.8，緩慢冷卻至開始析出熊果酸結晶、4～10℃冷藏、靜置養晶、過濾，得米黃色熊果酸粗品。
65℃條件下，米黃色熊果酸粗品用4倍量(W/W)的乙醇充分萃取熊果酸，過濾，濾液緩慢冷卻至開始析出熊果酸、4～10℃冷藏、靜置養晶、過濾、20℃條件下水洗，得白色熊果酸結晶；熊果酸結晶還可以進一步在室溫條件下，用乙醇重結晶，分別用氯仿、水和石油醚洗晶除雜，得高純度熊果酸晶體。經測定，高純度熊果酸晶體純度99.3％，枇杷葉中熊果酸回收率50.1％。
實施例5將20～30目枇杷葉粉末2.7kg放入提取罐中，用18倍枇杷葉粉末乾重(W/W)的78％乙醇-異丙醇(2∶1)水溶液，於76℃條件下提取2次，每次2小時，合併提取液，過濾，濾液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃條件下，經減壓回收溶劑、真空濃縮成枇杷葉總三萜酸提取物；76℃條件下，枇杷葉總三萜酸提取物用9倍量(W/W)的pH值為11.8的80％乙醇-異丙醇(2∶1)水溶液(W/W)充分萃取枇杷葉總三萜酸，靜置陳化、過濾去除不溶物，濾液趁熱添加0.9％(W/V)活性炭進行脫色；脫色後的濾液趁熱加入28％鹽酸水溶液，控制體系中乙醇-異丙醇(2∶1)終濃度達32％(W/W)和pH值為3.3，緩慢冷卻至開始析出枇杷葉總三萜酸沉澱、4～10℃冷藏、放置陳化、過濾，得枇杷葉總三萜酸粗品。
枇杷葉總三萜酸粗品用6倍量(W/W)的pH值為10.8的28％乙醇-異丙醇(2∶1)水溶液溶(W/W)解充分，過濾去除不溶物，調整濾液體系中熊果酸終濃度達到1.8g/L；濾液採用DK110大孔吸附樹脂，以1.5倍樹脂量/小時的流速(V/V)，動態吸附熊果酸至飽和，先用不少於3倍樹脂量的蒸餾水(V/V)洗去未被吸附的殘留液和吸附力較弱的水溶性雜質，再用12倍樹脂量的20％的乙醇水溶液(V/V)分成4次，在68r/min的攪拌轉速條件下洗去中等極性雜質，最後用15倍樹脂量的84％乙醇-異丙醇(1∶1)水溶液(V/V)分成3次，在90r/min的攪拌轉速條件下，洗脫熊果酸；洗脫液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃條件下，經減壓回收部分溶劑後，加入28％鹽酸水溶液，控制洗脫液體系中乙醇-異丙醇(1∶1)終濃度達28％(W/W)和pH值為3.3，緩慢冷卻至開始析出熊果酸結晶、4～10℃冷藏、靜置養晶、過濾，得米黃色熊果酸粗品。
78℃條件下，米黃色熊果酸粗品用9倍量(W/W)的乙醇-丙酮(1∶2)充分萃取熊果酸，過濾，濾液緩慢冷卻至開始析出熊果酸、4～10℃冷藏、靜置養晶、過濾、28℃條件下水洗，得白色熊果酸結晶；熊果酸結晶還可以進一步在室溫條件下，用乙醇-丙酮(1∶1)重結晶，分別用氯仿、水和石油醚洗晶除雜，得高純度熊果酸晶體。經測定，高純度熊果酸晶體純度99.4％，枇杷葉中熊果酸回收率52.0％。
實施例6將20～30目枇杷葉粉末2.7kg放入提取罐中，用20倍枇杷葉粉末乾重(W/W)的pH值為11.2的70％乙醇水溶液，於50℃條件下提取3次，每次1小時，合併提取液，過濾，濾液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃條件下，經減壓回收溶劑、真空濃縮成枇杷葉總三萜酸提取物；50℃條件下，枇杷葉總三萜酸提取物用3倍量(W/W)的無水乙醇充分萃取枇杷葉總三萜酸，靜置陳化、過濾去除不溶物，濾液趁熱添加0.5％(W/V)活性炭進行脫色；脫色後的濾液趁熱加入32％鹽酸水溶液，控制體系中乙醇終濃度達40％(W/W)和pH值為2.6，緩慢冷卻至開始析出枇杷葉總三萜酸沉澱、4～10℃冷藏、放置陳化、過濾，得枇杷葉總三萜酸粗品。
枇杷葉總三萜酸粗品用3倍量(W/W)的pH值為11.5的40％乙醇水溶液(W/W)溶解充分，過濾去除不溶物，調整濾液體系中熊果酸終濃度達到5.0g/L；濾液在50r/min的攪拌轉速條件下，直接採用大孔吸附樹脂HZ801∶HZ802(2∶1)對浸膏進行富集吸附熊果酸至飽和，吸附熊果酸至飽和，先用不少於3倍樹脂量的蒸餾水(V/V)洗去未被吸附的殘留液和吸附力較弱的水溶性雜質，再用5倍樹脂量的28％的乙醇水溶液(V/V)以0.65倍樹脂量/小時的流速(V/V)洗去中等極性雜質，最後用3倍樹脂量的無水乙醇以1.0倍樹脂量/小時的流速(V/V)洗脫熊果酸；洗脫液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃條件下，經減壓回收部分溶劑後，加入32％鹽酸水溶液，控制洗脫液體系中乙醇終濃度達40％(W/W)和pH值為2.6，緩慢冷卻至開始析出熊果酸結晶、4～10℃冷藏、靜置養晶、過濾，得米黃色熊果酸粗品。
50℃條件下，米黃色熊果酸粗品用15倍量(W/W)的乙醇充分萃取熊果酸，過濾，濾液緩慢冷卻至開始析出熊果酸、4～10℃冷藏、靜置養晶、過濾、14℃條件下水洗，得白色熊果酸結晶；熊果酸結晶還可以進一步在室溫條件下，用乙醇重結晶，分別用氯仿、水和石油醚洗晶除雜，得高純度熊果酸晶體。經測定，高純度熊果酸晶體純度99.3％，枇杷葉中熊果酸回收率51.8％。
實施例7以福建莆田產枇杷葉為原料，將鮮枇杷葉水洗、粉碎、過10～16目篩得枇杷葉漿料，將2.6kg(以乾重計)枇杷葉漿料放入提取罐中，用20倍枇杷葉乾重(W/W)的pH值為6.5的70％丙酮水溶液，於50℃條件下提取3次，每次1小時，合併提取液，過濾，濾液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃條件下，經減壓回收溶劑、真空濃縮成枇杷葉總三萜酸提取物；50℃條件下，枇杷葉總三萜酸提取物用15倍量(W/W)的pH值為9.3的85％丙酮水溶液(W/W)充分萃取枇杷葉總三萜酸，靜置陳化、過濾去除不溶物，濾液趁熱添加2.5％(W/V)活性炭進行脫色；脫色後的濾液趁熱加入40％硫酸水溶液，控制體系中丙酮終濃度達25％(W/W)和pH值為4.2，緩慢冷卻至開始析出枇杷葉總三萜酸沉澱、4～10℃冷藏、放置陳化、過濾，得枇杷葉總三萜酸粗品。
枇杷葉總三萜酸粗品用12倍量(W/W)的pH值為9.0的35％丙酮水溶液(W/W)溶解充分，過濾去除不溶物，調整濾液體系中熊果酸終濃度達到3.2g/L；濾液採用Amberlite XAD-4大孔吸附樹脂，以0.98倍樹脂量/小時的流速(V/V)，動態吸附熊果酸至飽和，先用不少於3倍樹脂量的蒸餾水(V/V)洗去未被吸附的殘留液和吸附力較弱的水溶性雜質，再用12倍樹脂量的20％的丙酮水溶液(V/V)分成3次，在82r/min的攪拌轉速條件下洗去中等極性雜質，最後用6倍樹脂量的85％丙酮水溶液(V/V)分成3次，在85r/min的攪拌轉速條件下，洗脫熊果酸；洗脫液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃條件下，經減壓回收部分溶劑後，加入40％硫酸水溶液，控制洗脫液體系中丙酮終濃度達35％(W/W)和pH值為4.2，緩慢冷卻至開始析出熊果酸結晶、4～10℃冷藏、靜置養晶、過濾，得米黃色熊果酸粗品。
70℃條件下，米黃色熊果酸粗品用5倍量(W/W)的丙酮充分萃取熊果酸，過濾，濾液緩慢冷卻至開始析出熊果酸、4～10℃冷藏、靜置養晶、過濾、20℃條件下水洗，得白色熊果酸結晶；熊果酸結晶還可以進一步在室溫條件下，用丙酮重結晶，分別用氯仿、水和石油醚洗晶除雜，得高純度熊果酸晶體。經測定，熊果酸白色晶體純度99.5％，枇杷葉中熊果酸回收率53.6％。
實施例8將20～30目枇杷葉粉末2.8kg放入提取罐中，用5倍枇杷葉粉乾重(W/W)的無水丙酮，於80℃條件下回流提取2小時，過濾，濾液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃條件下，經減壓回收溶劑、真空濃縮成枇杷葉總三萜酸提取物；80℃條件下，枇杷葉總三萜酸提取物用6倍量(W/W)的無水丙酮充分萃取枇杷葉總三萜酸，靜置陳化、過濾去除不溶物，濾液趁熱添加1.1％(W/V)活性炭進行脫色；脫色後的濾液趁熱加入50％硫酸水溶液，控制體系中親丙酮終濃度達38％(W/W)和pH值為2.5，緩慢冷卻至開始析出枇杷葉總三萜酸沉澱、4～10℃冷藏、放置陳化、過濾，得枇杷葉總三萜酸粗品。
枇杷葉總三萜酸粗品用7倍量(W/W)的pH值為9.8的40％丙酮水溶液(W/W)溶解充分，過濾去除不溶物，調整濾液體系中熊果酸終濃度達到4.9g/L；濾液在100r/min的攪拌轉速條件下，直接採用HZ806大孔吸附樹脂對浸膏進行富集吸附熊果酸至飽和，先用不少於3倍樹脂量的蒸餾水(V/V)洗去未被吸附的殘留液和吸附力較弱的水溶性雜質，再用6倍樹脂量的40％的丙酮水溶液(V/V)分成2次，在75r/min的攪拌轉速條件下洗去中等極性雜質，最後用12倍樹脂量的80％丙酮水溶液(V/V)分成3次，在90r/min的攪拌轉速條件下，洗脫熊果酸；洗脫液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃條件下，經減壓回收部分溶劑後，加入50％硫酸水溶液，控制洗脫液體系中丙酮終濃度達40％(W/W)和pH值為2.5，緩慢冷卻至開始析出熊果酸結晶、4～10℃冷藏、靜置養晶、過濾，得米黃色熊果酸粗品。
80℃條件下，米黃色熊果酸粗品用3倍量(W/W)的丙酮充分萃取熊果酸，過濾，濾液緩慢冷卻至開始析出熊果酸、4～10℃冷藏、靜置養晶、過濾、26℃條件下水洗，得白色熊果酸結晶；熊果酸結晶還可以進一步在室溫條件下，用丙酮重結晶，分別用氯仿、水和石油醚洗晶除雜，得高純度熊果酸晶體。經測定，高純度熊果酸晶體純度99.4％，枇杷葉中熊果酸回收率52.9％。
實施例9將20～30目已脫脂處理的枇杷葉粉末2.6kg放入提取罐中，用15倍枇杷葉粉末乾重(W/W)的84％甲醇-乙醇(5∶3)水溶液，於80℃條件下回流提取2小時，過濾，濾液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃條件下，經減壓回收溶劑、真空濃縮成枇杷葉總三萜酸提取物；80℃條件下，枇杷葉總三萜酸提取物用8倍量(W/W)的pH值為10.5的82％甲醇-乙醇(5∶3)水溶液(W/W)充分萃取枇杷葉總三萜酸，靜置陳化、過濾去除不溶物，濾液趁熱添加1.8％(W/V)活性炭進行脫色；脫色後的濾液趁熱加入50％硫酸水溶液，控制體系中甲醇-乙醇(5∶3)終濃度達40％(W/W)和pH值為3.1，緩慢冷卻至開始析出枇杷葉總三萜酸沉澱、4～10℃冷藏、放置陳化、過濾，得枇杷葉總三萜酸粗品。
枇杷葉總三萜酸粗品用9倍量(W/W)的pH值為10.5的32％甲醇-乙醇(2∶5)水溶液(W/W)溶解充分，過濾去除不溶物，調整濾液體系中熊果酸終濃度達到2.1g/L；濾液採用HZ803大孔吸附樹脂，以1.0倍樹脂量/小時的流速(V/V)，動態吸附熊果酸至飽和，先用不少於3倍樹脂量的蒸餾水(V/V)洗去未被吸附的殘留液和吸附力較弱的水溶性雜質，再用4倍樹脂量的26％的甲醇-乙醇(2∶5)水溶液(V/V)以0.75倍樹脂量/小時的流速(V/V)洗去中等極性雜質，最後用5倍樹脂量的95％甲醇-乙醇(2∶5)水溶液(V/V)以0.75倍樹脂量/小時的流速(V/V)，動態洗脫熊果酸；洗脫液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃條件下，經減壓回收部分溶劑後，加入50％硫酸水溶液，控制洗脫液體系中甲醇-乙醇(2∶5)終濃度達32％(W/W)和pH值為3.1，緩慢冷卻至開始析出熊果酸結晶、4～10℃冷藏、靜置養晶、過濾，得米黃色熊果酸粗品。
50℃條件下，米黃色熊果酸粗品用12倍量(W/W)的甲醇-乙醇(5∶3)充分萃取熊果酸，過濾，濾液緩慢冷卻至開始析出熊果酸、4～10℃冷藏、靜置養晶、過濾、15℃條件下水洗，得白色熊果酸結晶；熊果酸結晶還可以進一步在室溫條件下，用甲醇-乙醇(1∶1)重結晶，分別用氯仿、水和石油醚洗晶除雜，得高純度熊果酸晶體。經測定，高純度熊果酸晶體純度99.8％，枇杷葉中熊果酸回收率53.8％。
以上實施例旨在進一步舉例描述本發明，而不是以任何方式限制本發明。
本發明的一種從枇杷葉中分離純化高純度熊果酸的方法，工藝簡單、分離純化效果好、產品收率高、生產成本低，對我國枇杷植物資源的合理利用和傳統中藥產業鏈的延伸，解決「三農」問題，均具有重要的社會價值和現實意義。
權利要求
1.一種從枇杷葉中分離純化熊果酸的方法，其特徵在於所述方法的步驟為(1)枇杷葉總三萜酸的溶劑提取以枇杷葉為原料，採用5～20倍枇杷葉乾重(W/W)的含水量不超過30％(W/W)的親水性有機溶劑水溶液，於50～80℃條件下提取1～3次，每次1～3小時，合併提取液，過濾，濾液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃條件下，經減壓回收溶劑、真空濃縮成枇杷葉總三萜酸提取物；(2)枇杷葉總三萜酸的除雜處理50～80℃條件下，枇杷葉總三萜酸提取物用不低於3倍量(W/W)的含水量不超過20％(W/W)的親水性有機溶劑，水溶液充分萃取枇杷葉總三萜酸，靜置陳化、過濾去除不溶物，濾液趁熱進行活性炭脫色；(3)枇杷葉總三萜酸的沉澱分離脫色後的濾液趁熱加入三萜酸溶解度調節劑，控制體系中親水性有機溶劑終濃度為20～40％和pH值1.5～5.5，緩慢冷卻至開始析出枇杷葉總三萜酸沉澱、4～10℃冷藏、放置陳化、過濾，得枇杷葉總三萜酸粗品；(4)熊果酸的樹脂富集枇杷葉總三萜酸粗品用不低於3倍量(W/W)的20～40％(W/W)的親水性有機溶劑水溶液溶解充分，過濾去除不溶物，調整濾液體系中熊果酸終濃度達到0.5～5g/L；濾液經大孔吸附樹脂吸附熊果酸至飽和，先用不少於3倍樹脂量(W/W)的水洗去未被吸附的殘留液和吸附力較弱的水溶性雜質，再用不少於3倍樹脂量(W/W)的20～40％的親水性有機溶劑水溶液洗去中等極性雜質，最後用不低於3倍量(W/W)的含水量不超過20％(W/W)的親水性有機溶劑水溶液洗脫熊果酸；(5)熊果酸的沉澱分離熊果酸洗脫液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃條件下，經減壓回收部分溶劑後，加入熊果酸溶解度調節劑，控制洗脫液體系中親水性有機溶劑終濃度為20～40％和pH值1.5～5.5，緩慢冷卻至開始析出熊果酸結晶、4～10℃冷藏、靜置養晶、過濾，得熊果酸粗品；(6)熊果酸的結晶純化50～80℃條件下，熊果酸粗品用不低於3倍量(W/W)的親水性有機溶劑充分萃取熊果酸，過濾，濾液緩慢冷卻至開始析出熊果酸、4～10℃冷藏、靜置養晶、過濾、室溫條件下水洗，得熊果酸結晶。
2.根據權利要求1所述的從枇杷葉中分離純化熊果酸的方法，其特徵在於所述步驟(6)中的熊果酸結晶進一步在室溫條件下，用親水性有機溶劑重結晶，分別用氯仿、水和石油醚洗晶除雜，得高純度熊果酸晶體。
3.根據權利要求1或2所述的從枇杷葉中分離純化熊果酸的方法，其特徵在於所述親水性溶劑是甲醇、丙酮、乙醇、丙醇或異丙醇中的一種或幾種混合溶劑。
4.根據權利要求3所述的從枇杷葉中分離純化熊果酸的方法，其特徵在於所述親水性溶劑優先選用甲醇或丙酮。
5.根據權利要求1所述的從枇杷葉中分離純化熊果酸的方法，其特徵在於所述三萜酸溶解度調節劑為無機酸水溶液、有機酸水溶液或酸性鹽水溶液中的一種或幾種。
6.根據權利要求1或5所述的從枇杷葉中分離純化熊果酸的方法，其特徵在於所述三萜酸溶解度調節劑優先選用鹽酸水溶液或硫酸水溶液。
7.根據權利要求1所述的從枇杷葉中分離純化熊果酸的方法，其特徵在於所述熊果酸溶解度調節劑為無機酸水溶液、有機酸水溶液或酸性鹽水溶液中的一種或幾種。
8.根據權利要求1或7所述的從枇杷葉中分離純化熊果酸的方法，其特徵在於所述熊果酸溶解度調節劑優先選用鹽酸水溶液或硫酸水溶液。
9.根據權利要求1所述的從枇杷葉中分離純化熊果酸的方法，其特徵在於大孔吸附樹脂骨架的化學組成是聚苯乙烯或聚丙烯酸中的一種或兩種。
10.根據權利要求2所述的從枇杷葉中分離純化熊果酸的方法，其特徵在於所述高純度熊果酸晶體的純度≥99％。
全文摘要
本發明提供從枇杷葉中分離純化熊果酸的方法。該製備方法的特徵在於以枇杷葉為原料，採用親水性有機溶劑水溶液提取、減壓回收溶劑、真空濃縮成枇杷葉總三萜酸提取物；三萜酸提取物經過溶劑除雜、活性炭脫色、沉澱分離，製得熊果酸純度≥25％的枇杷葉總三萜酸粗品；三萜酸粗品經樹脂富集純化、沉澱分離，製得熊果酸純度≥80％的米黃色熊果酸粗品；熊果酸粗品經親水性有機溶劑萃取、結晶純化和重結晶處理，最後製得高純度熊果酸晶體。經測定，白色熊果酸晶體的純度≥99％。本發明製備工藝簡單、分離純化效率高、容易工業化生產、製備的熊果酸純度高、生產成本低，具有現代中成藥的「三高」、「三小」和「三便」等優點，具有較大推廣性。
文檔編號A61K36/185GK101037467SQ200710008809
公開日2007年9月19日 申請日期2007年4月10日 優先權日2007年4月10日
發明者陳劍鋒, 陳浩 申請人:福州大學