具有牛tlr4免疫應答功能的細胞模型及其構建方法
2023-05-03 07:25:11 1
專利名稱：具有牛tlr4免疫應答功能的細胞模型及其構建方法
技術領域：
本發明屬於分子生物學領域，具體地，本發明涉及一種具有TLR4免疫應答功能的細胞模型及其構建方法。
背景技術：
真核生物的天然免疫是抵抗外界病原體入侵的第一道防線，主要通過模式識別受體來識別外來的病原體，隨即引發一系列信號傳導、細胞因子活化、激活免疫系統，在機體抗感染免疫中發揮著重要作用。Toll樣受體(Toll Like Receptors, TLRs)是近年來研究和發現的識別入侵機體病原體的模式受體之一。TLRs能夠最先接觸入侵的病原體，通過識別位於病原體表面的病原相關分子模式(Pathogen-associated molecular pattern, PAMP)，TLRs可激活、引發一系列趨化因子和促炎性細胞因子的轉錄和分泌，如提高白介素-8(IL_8)、腫瘤壞死因子a (TNFa)和白介素10 (IL_1 P )等細胞因子的表達水平，調動炎症反應所需的多種炎性細胞和炎性分子，對入侵的病原體進行清除，發揮機體天然免疫的重要防禦作用。有關人、鼠、牛等不同物種的TLRs研究已證實，TLRs基因的遺傳變異和修飾會影響機體對感染性疾病的易感性，並影響疾病的發生和發展。所以，TLRs —經發現，就以其重要而獨特的生物學功能和潛在的應用前景迅速成為免疫學、遺傳學等研究的熱點。不同的TLRs家族成員能特異地識別不同類型的病原體，Toll樣受體4(TLR4)可以特異性地識別革蘭氏陰性菌獨特的結構成分-脂多糖(LPS)。革蘭氏陰性菌，特別是大腸桿菌是引起奶牛乳房炎發病的主要病原菌之一。只有當入侵的病原微生物被及時有效地清除，才能使病原微生物所引起的炎症反應對乳腺組織結構和功能的損害降到最低。其中任何一個環節的功能障礙都會干擾乳房正常的炎症反應，造成不同程度的乳房炎症。在這一過程中，奶牛乳腺組織中的乳腺上皮細胞和巨噬細胞的TLR4負責識別革蘭氏陰性菌並激活機體相應的免疫應答反應。事實上，TLR4對革蘭氏陰性菌識別的敏感程度及誘發機體免疫反應的快慢決定了奶牛乳房炎的發病程度。研究也表明，TLR4基因的突變會影響奶牛乳房炎的發病率。因此TLR4被認為是抵禦奶牛乳房感染的重要候選功能基因之一而備受關注。在體外細胞水平對TLR4基因功能及其在奶牛乳房抗感染免疫的作用展開研究，不僅可以排除奶牛個體作為模型時的複雜性、減少許多環境的幹擾因素，而且保證了基因功能的研究儘可能地在相同的遺傳背景下進行，從而獲得比較準確客觀的體外研究結果。這樣既有助於理解TLR4基因的作用機理，又能為在個體水平進行基因功能的深入研究提供可借鑑的實驗依據和參考。與人、小鼠相比，用於研究牛TLR4基因功能相應的商品化細胞模型缺乏，一定程度上制約了這一領域的研究。到現在為止，尚沒有商品化的牛乳腺上皮細胞系，加之原代乳腺上皮細胞培養條件苛刻，經傳代後，細胞極易老化而喪失其乳腺細胞的特性。獲得可用來研究TLR4基因功能的細胞模型，能夠克服由於缺乏合適的抗體、基因敲除模型和現成的細胞模型造成的牛TLR4功能研究手段十分有限的技術難題。HEK293細胞是人胚胎腎細胞，常常用來研究基因功能的商品化細胞系，而HEK293細胞本身不表達TLR4、⑶12和MD2，不能被LPS激活產生相應的細胞因子。因此，HEK293不能直接用來進行TLR4功能研究。
發明內容
本發明的目的是提供一種具有TLR4免疫應答功能的細胞模型及其構建方法。為了實現本發明的目的，擬採用如下技術方案本發明一方面涉及具有TLR4免疫應答功能的細胞模型，其特徵在於將牛源MD2、⑶14、TLR4不同的三個基因用2A序列連接、組裝到載體上，將載體導入商品化細胞系中，構建的細胞模型具有LPS介導的免疫應答功能。在本發明的一個優選實施方式中，所述的商品化細胞系是HEK293。在本發明的一個優選實施方式中，所述的載體是pLEX-MCS載體。
本發明另一方面還涉及上述細胞模型的構建方法，其特徵在於包括擴增MD2、CD14、TLR4序列，然後將所擴增的序列組裝到載體上，並將載體導入到商品化細胞系中，選擇同時表達MD2、⑶14、TLR4三個蛋白的陽性細胞系。在本發明的一個優選實施方式中，其特徵在於克隆MD2、⑶14、TLR4基因編碼序列的3』末端引物，均增加了 HA基因序列，HA標籤的編碼序列為AgCgTAgTCTgggACgTCgTATgggTA ;在擴增CD14和MD2的下遊引物中增加能自行裂解其序列前後的兩個表達蛋白、使之等摩爾獨立表達的2A序列，其中2A序列為gag ggc aga gga agtctg cta aca tgc ggt gac gtc gaggag aat cct ggc cca ;同時，在2A前後力口入Linker序列tccactgcc利於表達蛋白正確摺疊。為方便重組載體的組裝，在MD2基因的上遊引物中增加了 SpeI內切酶序列，在MD2基因的下遊引物中增加了 Xho I內切酶序列；在0014基因的上遊引物中增加了 Xho I內切酶序列，在CD14基因的下遊引物中增加了 Mlu I內切酶序列；在11^4基因的上遊引物中增加了 Mlu I內切酶序列，在TLR4基因的下遊引物中增加了Age I內切酶序列。在本發明的一個優選實施方式中，設計擴增MD2基因CDS序列的引物，上遊引物為 'ccgact 8gttga ate atg ttt cca ttt gtg ctt ttt tcc,下遊引物為gtt<^<7 盡2犮tRR Rcc aRR att ctc ctc Rac Rtc acc Rca tRttaR caR act tcc tct rcc ctc tcc actgcc age gta gtc tgg gac gtc gtatgg gta gta att g ;設計擴增⑶ 14基因 CDS序列的引物，上遊引物為cca ctc gag ctg act atR gtg tgc gtg ccc tac ctg ctg,下遊引物為gtt acg cgt tRR Rcc aRR att ctc ctc Rac Rtc acc Rca tRt tag caR acttcc tct rccctc tcc act gcc age gta gtct ggg acg tcg tat ggg tac gcgaag ;設計擴增 TLR4 基因CDS序列的引物，上遊引物為'ctt acg cgt gccagg atg atg gcg cgt gcc cgc ctg getgcg get ctg ate cc，下遊引物為ctt aat acc ggt tea age gta gtc tgg gac gtc gtatgg gta ggt ggaggt tgt cgc ttc ttg egg gttgo本發明構建的細胞模型為研究牛TLR4基因的功能，闡明牛TLR4基因的作用機制提供技術支持，是一個有價值的牛TLR4基因功能的研究工具。
圖I牛源MD2、CD14、TLR4在HEK293中同時、獨立表達的Western-Blot檢測(圖例說明1-2分別為兩株轉染pLEX-MD2-⑶14-TLR4的HEK293細胞，3為蛋白質標準分子量，4為轉染pLEX-MCS空載體的HEK293細胞。所用一抗為鼠抗HA標籤蛋白抗體，二抗則為抗鼠的螢光標記抗體。)圖2LPS刺激過表達BPI和未過表達BPI的mHEK293細胞前後TNF a基因的相對表達水平的變化圖3LPS刺激過表達BPI和未過表達BPI的mHEK293細胞前後IL-8基因的相對表達水平的變化圖4LPS刺激過表達TLR4不同基因型的HEK293細胞前後TNFa基因的相對表達水平的變化圖5LPS刺激過表達TLR4不同基因型的HEK293細胞前後IL-8基因的相對表達水平的變化
具體實施例方式以下通過具體實施例詳細說明本發明的技術及特點，但這些實施例僅僅是舉例性說明，並非用以限定本發明的保護範圍。(I)引物設計根據GenBank中牛MD2基因的mRNA序列(DQ319076)，設計擴增MD2基因CDS序列的引物，上遊引物為ccg act agt tga ate atg ttt cca tttgtg ctt ttt tcc,下遊引物為,gtt CtC gag tRR Rcc aRR att ctc ctc RacRtc acc Rca tRt tag caR act tcc tctRcc ctc tcc act gcc age gta gtctgg gac gtc gta tgg gta gta att g。根據 GenBank中牛⑶14基因的mRNA序列(AF141313. I)，設計擴增⑶14基因⑶S序列的引物，上遊引物為ccactc gag ctg act atR gtg tgc gtg ccc tac ctg ctg,下遊引物為gtt acgcgt tggRcc aRR att ctc ctc Rac Rtc acc Rca tRt taR caR act tcc tctRcc ctc tcc act gccage gta gtct ggg acg tcg tat ggg tac gcg aag。根據 GenBank 中牛 TLR4 基因的 mRNA序列(DQ839567. 1)，設計擴增TLR4基因CDS序列的引物，上遊引物為'Ctt acg Cgt gccagg atg atg gcg cgtgcc cgc ctg get gcg get ctg ate cc,下遊引物為ctt aat accggt tcaagc gta gtc tgg gac gtc gta tgg gta ggt gga ggt tgt cgc ttc ttg egggttg。為了重組蛋白的wes tern blotting檢測，在每個重組蛋白基因編碼序列的3』末端，增加了 HA基因序列，HA標籤的編碼序列為AgCgTAgTCTgggACgTCgTATgggTA。同時，為了保證三個基因能單獨表達，在CD14和MD2的下遊引物中增加了兩種蛋白表達後能自行裂解成兩個相互獨立的蛋白，自行行使其功能的2A序列，在2A前後加入Linker序列tccactgcc,以確保表達的重組蛋白構象正確摺疊。其中2A序列為gag ggcaga gga agt ctgcta aca tgc ggt gac gtc gag gag aat cct ggc cca。此外，為了保證三個基因能首尾相連的組裝到pLEX-MCS載體中，在MD2基因的上遊引物中增加了 Spe I內切酶序列，在MD2基因的下遊引物中增加了 Xho I內切酶序列；在0014基因的上遊引物中增加了 Xho I內切酶序列，在CD14基因的下遊引物中增加了 Mlu I內切酶序列；在11^4基因的上遊引物中增加了 Mlu I內切酶序列，在TLR4基因的下遊引物中增加了 Age I內切酶序列，斜體的序列為內切酶識別序列。(2)實驗樣品採集與總RNA提取
採集奶牛的新鮮血液組織2ml，經過紅細胞裂解液處理後，按照杭州博日RNA提取試劑盒說明書進行提取。(3) RT-PCR對牛血液組織RNA進行反轉錄，反轉錄方法參照說明書；以反轉錄的cDNA為模板，利用基因的特異性上下遊引物進行PCR反應，其反應體系為2uL cDNA模板，2uL 10XPCRbuffer, 2uL dNTP (各 2. 5mM)，上下遊引物(IOmM)各 luL，IuL DMSO，IUTaq 酶(寶生物，Pfu)，用ddH20調整至20uL。TLR4基因PCR反應條件95°C預變性5min ;95°C變性30s，65°C (-2°C /2循環)退火40s以及72°C延伸180s共16個循環；然後95°C變性30s，51°C退火40s以及72°C延伸180s共19個循環；最後72°C延伸5min。CD14基因PCR反應條件中延伸時間為60s，MD2基因中延伸時間為90s，其它的條件同TLR4基因PCR反應條件。反應結束，取反應液5uL進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，確認其產物。⑷克隆和測序 將牛MD2的擴增產物及pLEX-MCS載體分別根據各自引物上的內切酶設計同時進行雙酶切，分別回收純化酶切後的PCR產物和pLEX-MCS載體，利用T4 DNA連接酶連接酶切後的PCR產物和pLEX-MCS載體，轉化E. coli DH5 a ;利用AMP+進行平板篩選，並以PCR法和限制性酶切法鑑定，陽性克隆質粒正確的質粒命名為PLEX-MD2。將牛CD14的擴增產物及pLEX-MD2載體分別根據CD14引物上的內切酶設計同時進行雙酶切，分別回收純化酶切後的PCR產物和pLEX-MD2載體，利用T4DNA連接酶連接酶切後的PCR產物和pLEX_MD2載體，轉化E. coli DH5 a ;利用AMP+進行平板篩選，並以PCR法和限制性酶切法鑑定，陽性克隆質粒正確的質粒命名為PLEX-MD2-⑶14。最後將牛TLR4的擴增產物及pLEX_MD2_⑶14載體分別根據TLR4引物上的內切酶設計同時進行雙酶切，分別回收純化酶切後的PCR產物和PLEX-MD2-⑶14載體，利用T4 DNA連接酶連接酶切後的PCR產物和pLEX_MD2_⑶14載體，轉化E. coli DH5 a ;利用AMP+進行平板篩選，並以PCR法和限制性酶切法鑑定，陽性克隆質粒正確的質粒命名為PLEX-MD2-⑶14-TLR4。(5)在293T細胞中包裝重組慢病毒步驟第I日293T細胞培養和鋪板293T細胞培養條件，37°C，5%的CO2，培養基採用DMEM+10%的胎牛血清，每IOcm面積中鋪2-2. 5X IO6個293T細胞，保證第2天細胞在完全培養液中匯合度達到70-80% ；第2 日Lipectamine 2000 脂質體轉染在聚丙烯管裡準備脂質體和DNA複合物；加入I. 5ml預熱的Opti-MEM培養基後，按下列比例加入目的載體及病毒包裝載
體。輕輕混勻。室溫放置；轉染載體(pLEX-MD2-CD14-TLR4)12ug包裝質粒(pSPAX2)9ug包膜質粒(pMD2G)3. 5ug在使用Lipectamine 2000之前先輕輕混勻脂質體。而後，在另一個管中加入I. 5ml室溫的Opti-MEM培養基，再加入50ul Lipectamine 2000，輕輕混勻後室溫放置，室溫放置5min後；將上述稀釋好的DNA與脂質體混合，混合物置於室溫孵育20分鐘；在此期間，用Opti-MEM培養基清洗待轉染細胞一次，將脂質體和DNA複合物加入細胞；將細胞培養板放回37°C培養箱中孵育，2-4小時後，移去脂質體和DNA複合物，在每個培養皿中加入IOml新鮮的培養液，重新將細胞培養板放回37°C培養箱中培養。第4日收集病毒收集含病 毒的細胞培養上清液。將細胞上清用0. 45um過濾器過濾，收集過濾液；將包含病毒顆粒的過濾液分裝至I. 5ml的印pendorf中，置於液氮或者_70°C保存備用；(6)利用慢病毒感染HEK293細胞，製作細胞模型。先對HEK293細胞培養和鋪板，293細胞培養條件，37 °C，5 %的CO2，培養基採用DMEM+10%的胎牛血清，每個6孔板中鋪3 X IO5的HEK293細胞。當細胞匯合度達到70 %時，將0. 5mL重組慢病毒和0. 5mLDMEM培養基混合液，加入聚凝胺(Polybrene) 10 u g後加入6孔板，在感染pLEX-MD2-CD14_TLR4重組病毒時，為保證試驗結果的可重複性，都設置平行樣品。同時設置感染pLEX-MCS病毒的樣品作為感染對照，設置不感染病毒的樣品作為陰性對照。16h後換新鮮培養液,繼續培養48h,加入I ii g/mL的puromycin篩選細胞,每2d更換新鮮培養基。未感染重組慢病毒的對照組細胞在6d後全部死亡。繼續用添加puromycin的培養基培養至轉染PLEX-MD2-CD14-TLR4基因的HEK293細胞，通過Western blotting鑑定後獲得穩定表達PLEX-MD2-CD14-TLR4的HEK293細胞系(見圖I)，命名為mHEK293。(7)驗證製作細胞模型mHEK293細胞的免疫功能。在6孔板中培養相同數目的mHEK293細胞，分別在培養基中添加終濃度為IOOng/ml的LPS，不同時間點收細胞後，提取細胞的RNA。設計TNFa、IL_8細胞因子的引物，通過Real-Time PCR檢測LPS刺激前後不同時間點的相對表達量，結果顯示細胞因子在LPS刺激後表達水平迅速增加(參見圖2和圖3中未表達BPI的BPI-實驗組))，說明構建的細胞模型具有LPS介導的免疫應答功能。BPI基因能夠抑制LPS介導的免疫反應，本研究通過實施例步驟2、步驟3和步驟4的方法，擴增牛BPI基因，把BPI基因克隆到pLEX-MCS載體中，構建pLEX-BPI的重組載體，通過實施例步驟5製作pLEX-BPI的慢病毒重組顆粒，然後把重組慢病毒顆粒pLEX-BPI感染mHKE293細胞模型。在6孔板中培養相同數目感染pLEX-BPI慢病毒的mHEK293細胞，分別在培養基中添加終濃度為100ng/ml的LPS，不同時間點收細胞後，提取細胞的RNA。利用設計的IL_8、TNFa細胞因子引物，通過Real-Time PCR檢測LPS刺激前後不同時間點的相對表達量，結果顯示在LPS刺激後感染pLEX-BPI慢病毒的mHEK 293細胞的細胞因子表達水平和對照相比沒有顯著變化(參見圖2和圖3中過表達BPI的BPI/BPI714+實驗組)。也就是說，構建的mHEK293細胞模型感染pLEX-BPI慢病毒後，BPI抑制了 LPS介導的免疫反應。本實驗通過上述實驗證明了構建的mHEK293細胞模型能夠用於研究牛TLR4基因功能。(8)在細胞模型上對不同基因型TLR4功能差異的評估TLR4基因序列E+2021位點發生突變，根據遺傳學分析發現該位點不同基因型個體間奶牛乳房炎的發病率存在顯著差異，本實施例對TLR4E+2021不同基因型的功能在改造的HEK293細胞模型進行評估。根據實施步驟I設計的引物，分別擴增MD2、⑶14和TLR4不同基因型的序列，然後進行步驟2-6的細胞模型構建，分別對包含不同基因型的細胞進行不同濃度的LPS侵染，然後收細胞，提取細胞的總RNA，對RNA進行反轉錄。利用實施步驟7中細胞因子的設計引物，採用Real-Time PCR檢測兩種TLR4兩種基因型細胞在受到LPS刺激後，以上細胞因子表達量的差異。發現不同濃度LPS刺激不同基因型的細胞模型後，IL-8的相對表達量差異不顯著，而TNF a的相對表達量差異顯著(參見圖4和圖5)，說明TLR4E+2021位點突變確實對TLR4基因的功能造成影響。當理解的是，上述具體實施方式
僅僅是舉例性說明，對本領域普通技術人員來說， 可以根據上述說明加以改進或變換，而所有這些改進和變換都應屬於本發明所附權利要求的保護範圍。
權利要求
1.具有TLR4免疫應答功能的細胞模型，其特徵在於將牛源MD2、⑶14、TLR4不同的三個基因用2A序列連接、組裝到載體上，將重組載體導入商品化細胞系中。
2.根據權利要求I所述的細胞模型，所述的商品化細胞系是HEK293。
3.根據權利要求I所述的細胞模型，所述的載體是PLEX-MCS載體。
4.權利要求I所述的細胞模型的構建方法，其特徵在於包括擴增牛源MD2、CD14、TLR4序列，然後將所擴增的序列組裝到載體上，並將載體導入到商品化細胞系中，選擇同時表達MD2、CD14、TLR4的陽性細胞系。
5.根據權利要求4所述的構建方法，其特徵在於將牛源MD2、CD14、TLR4三個不同的基因用2A序列連接，使三個基因在細胞中同時獨立表達。而且，MD2、⑶14、TLR4基因編碼序列的3』末端，均增加了 HA基因序列標籤，HA標籤的編碼序列為AgCgTAgTCTgggACgTCgTATgggTA ;在擴增CD14和MD2的下遊引物中增加能自行裂解的2A序列，在 2A 前後加入 Linker 序列 tccactgcc,其中 2A 序列為 gag ggc aga gga agt ctg ctaaca tgc ggtgac gtc gag gag aat cct ggc cca,優選的，在所述引物中還包括限制性內切酶序列。
6.根據權利要求4所述的構建方法，其特徵在於，包括如下步驟設計擴增MD2基因CDS序列的引物,上遊引物為-.CCgact agttga ate atgttt cca ttt gtg ctt ttt tcc,下遊引物為gagtEg_ gcc agg attctc ctc gac gtc acc gca tgt tag cag act tcctct gcc ctc tcc act gccagc gta gtc tgg gac gtc gta tgg gta gta att g;設計擴增CD14 基因⑶S 序列的引物，上遊引物為cca ctc gag ctR act atR gtg tgc gtg ccctacctg ctg，下遊弓 I物為gtt acg CRt tRR Rcc aRR att ctc ctc Rac Rtcacc Rca tRt tagcaR act tcc tct rcc ctc tcc act gcc age gta gtct gggacg tcg tat ggg tac gcg aag ；設計擴增TLR4基因CDS序列的引物，上遊引物為'Ctt acg Cgtgcc agg atg atg gcg Cgtgcc cgc ctg get gcggct ctg ate cc,下遊引物為ctt aat acc ggt tea age gta gtctgg gacgtc gta tgg gta ggt gga ggt tgt cgc ttc ttg egg gttg。
全文摘要
本發明公開了具有TLR4免疫應答功能的細胞模型及其構建方法，其特徵在於將牛源MD2、CD14、TLR4不同的三個基因用2A序列連接、組裝到載體上，將載體導入商品化細胞系中，構建的細胞模型具有LPS介導的免疫應答功能。本發明構建的細胞模型及其構建方法為研究牛TLR4基因的功能、闡明牛TLR4基因的作用機制提供技術支持，是一個有價值的牛TLR4基因功能的研究工具。
文檔編號C12N5/10GK102796706SQ20121027582
公開日2012年11月28日 申請日期2012年8月3日 優先權日2012年8月3日
發明者李文蓉, 白傑, 劉明軍, 賀三剛, 張雪梅, 姚楠, 張寧, 瑪依拉 申請人:新疆維吾爾自治區畜牧科學院中國-澳大利亞綿羊育種研究中心