一株作物青枯病生防枯草芽孢桿菌菌株的製作方法

2023-05-02 15:30:56 7

專利名稱：一株作物青枯病生防枯草芽孢桿菌菌株的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域。進一步，本發明涉及一株作物青枯病生防枯草芽孢桿菌菌株。更進一步，本發明涉及應用枯草芽孢桿菌菌株SH7防治菸草青枯病。
背景技術：
菸草細菌性青枯病是由青枯雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的一種典型的維管束病害，最顯著的症狀是枯萎，且枯萎的速度很快，一旦發病即可造成全株死亡，是菸草上一大毀滅性病害。目前在我國長江流域及其以南煙區普遍發生；在多發病區旱地煙田的發病率為30％-50％，特別是旱地重茬連作煙田的發病率為50％以上；尤以華南煙區為害嚴重，個別年份暴發流行。近幾年來，該病的發病和為害範圍有向北方煙區擴展的趨勢，在山東、河南、陝西及遼寧等省都有發生，局部地區為害較重。目前該病造成的損失已居各類病害的第四位，必須重視該病的防治工作。尤其近年以來由根結線蟲造成的傷口引起的青枯病、黑脛病複合侵染的危害呈上升趨勢，造成煙田嚴重減產。鑑於化學防治對環境的汙染和生態平衡的破壞，因此菸草青枯病的生物防治越來越被重視。
菸草是我國重要的經濟作物，中國烤菸的主要產區分布在雲南、貴州、四川、湖北、湖南、陝西、河南、安徽、山東、遼寧、吉林、黑龍江等20多個省區的近900個縣市。其中，雲南省是我國菸草種植面積最大的省。中國菸葉的質量在不斷提高，全國良種化面積達到90％以上，是世界上最大的菸草生產國。
在菸草生產上病害是嚴重影響產量和質量的重要因素。菸草細菌性青枯病又稱「煙瘟」，是由Ralstonia solanacearum引起的一種維管束病害，主要侵染菸草根部和莖，也可侵染葉片；在苗床和大田均能發生，常造成煙株大片枯萎死亡，是一種毀滅性的土傳病害。1864年印度尼西亞首先報導在菸草上引起毀滅性的損失；在美國，1880年首次發現此病，1910年大面積流行，隨後美國一些農場被迫停止種煙。此病廣泛分布於世界熱帶、亞熱帶及溫帶等溼熱地區；我國菸草青枯病菌的地理分布長江以南發生居多，依發病高低可劃分為4個區，多發病區包括廣東、江西、福建、湖南、四川、浙江、安徽等省區；次發病區包括貴卅、湖北；偶發病區包括雲南、河南、山東、陝西、遼寧；其餘為無病區，各區的劃分是相對的，區間存在過渡帶；呈現由西向東、由北向南逐漸增加的趨勢。
菸草細菌性青枯病菌的寄主範圍很廣，可侵染50多個科200餘種植物，是番茄、馬鈴薯、菸草、花生、甘薯、茄子、生薑香蕉以及一些貴重藥品和花卉等植物生產的重要限制因素。大多數禾本科植物及棉花、甘薯和麻類作物不受侵染。病菌主要在土壤和堆肥中越冬，也可以潛伏在種子、根際或生長著的寄主體內越冬；一般條件下，是從根部傷口侵入，不能從氣孔侵入。青枯病的主要初次侵染來源是土壤、病殘組織和肥料中的病菌，這些病原菌靠雨水、排灌水、病土、帶菌苗、疫苗、人畜、生產工具及昆蟲進行擴散遠距離傳播。
菸草青枯病在苗床和大田均能發生。主要侵染煙株根、莖，也可侵染葉片，染病葉片初期仍為綠色懸掛在莖上，故稱「青枯病」； 天氣炎熱時，病株的葉片呈不規則的灼傷，葉片變幹，邊緣脫落。病株的莖呈直立狀，莖上垂著死亡的葉片。土壤溼度大時，根軟腐發粘，致使全株枯死。
利用有益微生物防治植物病害，已成為一個十分活躍並開始顯示良好應用前景的領域。許多論著報導(Cook，K.J.and Baker K.F.The nature and practice of biological controlof plant pathogens.1984，APS press USA)認為生物防治在未來農業中具有重要地位。大量的研究表明，生防細菌在其生長發育中產生多種拮抗性或競爭性的代謝產物，通過直接或間接作用，達到阻礙或殺死病原菌的效果。無論是自然發生的生物防治現象還是人們用於生物防治的生物類型中，細菌的作用是非常明顯的。其主要優勢在於1)細菌的種類和數量眾多，在植物根際和地上部大量存在；2)細菌對病原菌的作用方式較廣，可以通過競爭、拮抗和誘導植物產生抗性等方式對病原菌產生影響；3)具有驚人的繁殖速度；4)許多細菌存在於植物根際和地上部，對植物的生態比較適宜；5)細菌大多可以人工培養，便於控制，在實踐中易於操作；6)有些細菌不僅能防治病害而且可以增加作物產量(程亮等，拮抗細菌的研究進展[J].江西農業大學學報，2003，25(5)732～736)。表現出或被認為有生防潛力的有益細菌種類眾多(Dviad M.Biological Control of Soilbrone Plant Pathogens in the Rizhospherewith Bacteria.Ann.Rev.Phytopathol.1988，26379～407)；包括了許多屬的細菌，目前成功應用的植物病害生防細菌有Agrobacterium、Bacillus、Pseudomonas、Erwinia、Xanthomonas等屬的一些菌株。
生防細菌防治植物病害發生發展的一個重要機制是產生拮抗物質，大致包括以下幾類細菌素(bacteriocins)、螢光素(fluorescein)、土壤桿菌素(agrocin)、酚類物質、多肽類抗生素(polypeptides)、蛋白質類抗真菌素及揮發性抑制物質等，在植物病害生物防治中起著關鍵的作用。由生防細菌產生的拮抗物質種類多，作用範圍廣譜，同一種拮抗物質可以由多種細菌菌株產生，而同一種細菌菌株也可以產生多種不同結構的拮抗物質。
了解拮抗菌的抑菌機理是增強拮抗菌生防效力和確定拮抗菌篩選標準的重要前提，拮抗菌主要有3種作用機制即拮抗作用、競爭作用(包括營養、物理位點、生態位點及氧氣等的競爭)、誘導抗性和超寄生，生防細菌的作用機制主要為前三者。由於寄主-致病菌-拮抗菌三者的交互作用，每一種拮抗菌拮抗效果的產生往往是多重機理共同作用的結果。也有研究報導，有的拮抗菌株以一種機制為主，有的同時依賴多種機制。
因此本試驗將從生物防治方面進行探索，篩選防效促生效果好的拮抗細菌菌株，並對其抑菌機理進行研究，為將來通過常規和分子生物學途徑，利用這些拮抗細菌及其抗菌物質防治菸草青枯病提供研究基礎和實驗材料。
在植物的根圍、葉圍及其它微生態區系中，拮抗細菌廣泛存在，且由於培養方便、生長周期短、作為新拮抗菌來源具有很大的開發潛力。菸草青枯病是菸草生產中最嚴重的病害之一，每年都造成菸葉產量的嚴重損失和品質下降，是菸草生產中一個很重要的制約因素。如何有效地防治和減輕菸草青枯病的危害一直是許多科研工作者的目標。至今人們沒有找到理想的防治藥劑，選育抗病品種很難，且抗性容易喪失。因此不斷尋找新的菸草青枯病防治方法是一項長期的任務。
國內對菸草青枯病生物防治已有報導，但多數僅限於對生防菌的篩選和盆栽試驗階段，而對其產生抗菌物質的提取、生理生化特性和生防菌的防病機制等諸多方面國內尚未深入研究，發明內容針對上述領域的缺陷，本發明提供一株作物青枯病生防枯草芽孢桿菌菌株，用於作物青枯病的生物防治，為青枯病的防治提供了新的微生物資源。
一株作物青枯病生防枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)菌株SH7，其生物保藏號為CGMCC1732。
所述的菌株SH7在防治作物青枯病中的應用。
所述作物為菸草。
所述的菌株SH7在抑制青枯雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)中的應用。
所述菌株分泌的抗菌蛋白物質混合物，其特徵在於從菌株SH7發酵液中提取，並含有一在鹼性條件下穩定的35kDa的蛋白。
所述抗菌蛋白混合物在防治作物青枯病中的應用。
本發明針對菸草青枯病菌(Ralstonia solanacearum以下簡稱R.S)，通過室內抑菌圈法和活體溫室防效測定，篩選出在溫室條件下對R.S具有良好防病作用的拮抗菌株SH7，測定其16s rDNA全序列如附錄中SEQ ID NO1，應用其中的BLAST軟體和DNAMAN軟體進行分析，SH7菌株的序列與枯草芽孢桿菌16s rDNA部分序列相同，同源性100％)(如圖7)，因此鑑定SH7菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。該菌株的培養條件為30℃，普通牛肉汁培養基，pH7.0。該菌株為芽孢桿菌屬(Bacillus)、枯草芽孢桿菌種，並已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏日期為2006年6月7日，保減編號為CGMCC1732。經鑑定，關於該菌株的信息包括能形成芽孢；分泌的蛋白混合物對熱穩定(見附圖10)，對蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶不敏感(見附圖14、15)，對氯仿部分敏感(見附圖16)；SDS-PAGE電泳表明其作用蛋白之一約為35kDa(見附圖18)；生物學測定表明，在牛肉汁平板上能夠抑制青枯雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)的生長(見附圖1)，盆栽防治實驗表明防效為65.99％(見表3)。
本發明通過室內平板擴散抑菌法，獲得了平板拮抗能力強的SH7菌株(抑菌帶寬12.2mm)，SH7除菌發酵液對菸草青枯病的防治效果(溫室盆栽)表明，經單獨除菌發酵液處理和除菌發酵液與青枯病菌作用30min後處理與NB培養基對照相比，兩種處理方式均能推遲菸草青枯病的發病時間；在接種後第29d時，與NB培養液對照相比，防效達到65.99％和53.2％，說明SH7菌株分泌的抗菌物質是其防病作用的主要機制。接種SH7除菌發酵液後的煙苗葉色濃綠且肥厚，長勢好。
SH7菌株分泌的拮抗物質可用70％飽和度硫酸銨提取。粗提的拮抗物質對熱穩定，經100℃和121℃高壓處理20min後樣品的抑菌率分別為90％和70％(假設未處理樣品的抑菌率為100％)；它對蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶不敏感，對氯仿部分敏感。作用活性在pH7.0-9.0最好。經紫外掃描和SDS-PAGE電泳，拮抗物質在274.00nm處有典型的蛋白吸收峰，SH7分泌多種的蛋白質，組分之一的分子量大小為35KD左右。
本發明獲得的拮抗青枯病菌的生防枯草芽孢桿菌菌株SH7可應用於對作物青枯病的防治，生物學測定表明，在牛肉汁平板上能夠抑制青枯雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)的生長(見附圖1)，盆栽防治實驗表明防效為65.99％(見表3)。具有實際的應用價值。
本發明通過菌株SH7的發酵液提取得到了拮抗蛋白，並證實SH7產生的主要抑菌性物質為該拮抗蛋白。該拮抗蛋白熱穩定性好，對蛋白酶不敏感，是優質的生物農藥。
菌種保藏信息菌種名稱芽孢桿菌屬、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)保藏機構中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏日期2006年6月7日保藏編號CGMCC 173

圖1為SH7菌株對菸草青枯病菌的抑菌活性。
圖2為SH7菌株發酵液上清對菸草青枯病菌抑菌活性。
圖3為除菌發酵液處理煙苗14d的防效。
其中，1為SH7除菌發酵液處理煙苗；CK為對照。
圖4為除菌發酵液與青枯病菌作用30min後處理煙苗14d的防效。
其中，2為除菌發酵液與青枯病菌作用30min後處理煙苗；CK為對照。
圖5為除菌發酵液處理煙苗20d的防效。
其中，1為SH7除菌發酵液處理煙苗；CK為對照。
圖6為除菌發酵液與青枯病菌作用30min後處理煙苗20d的防效。
其中，2為除菌發酵液與青枯病菌作用30min後處理煙苗；CK為對照。
圖7為SH7 PCR產物序列在Genbank資料庫中搜索比對的結果。
圖8為70％(NH4)2SO4飽和度沉澱對青枯菌菌株抑菌活性。
其中，左側為pH值7.6的PBS緩衝液處理；右側為透析後粗提液。
圖9為去除70％(NH4)2SO4飽和度所得沉澱的上清抑菌活性。
圖10為不同溫度處理後的SH7粗提蛋白液對菸草青枯病菌的抑菌活性。
其中，1為未處理樣品；2為100℃處理20min；3為121℃處理20min；4為PBS緩衝液(pH7.6)。
圖11為不同pH值處理後SH7粗提蛋白對菸草青枯病的抑菌活性。
圖12為酸性條件和鹼性條件下SH7粗提蛋白活性的穩定性。
其中，1為原樣品；2為pH5.0沉澱；3為pH5.0上清；4為pH3.0沉澱；5為pH3.0上清圖13為酸性條件和鹼性條件下SH7粗提蛋白活性的穩定性。
其中，1為原樣品(pH7.0)；2為pH9.0處理；3為pH8.0處理；4為pH10.0處理；5為pH11.0處理。
圖14為蛋白酶K處理後抑菌蛋白的穩定性。
其中，左側為蛋白酶K處理；右側為原樣品。
圖15為胃蛋白酶和胰蛋白酶處理後的穩定性。
其中，1為未處理樣品；2為胃蛋白酶處理；3為胰蛋白酶處理。
圖16為經氯仿處理後蛋白粗提液對菸草青枯病菌的抑菌活性其中，1為氯仿處理；2為未處理樣品；3為水相部分；4為PBS緩衝液。
圖17為不同有機溶劑萃取粗提蛋白液後對菸草青枯病菌的抑菌活性。
其中，1為乙醚萃取SH7粗提蛋白的有機相；2為乙醚萃取SH7粗提蛋白的水相；3為二甲苯萃取SH7粗提蛋白的有機相；4為二甲苯萃取SH7粗提蛋白的水相；5為乙酸乙酯萃取SH7粗提蛋白的有機相；6為乙酸乙酯萃取SH7粗提蛋白的水相；7為未處理粗提蛋白。
圖18為SH7粗提拮抗蛋白SDS-PAGE電泳圖。
其中，1為氯仿處理的粗提蛋白；2為未處理粗提蛋白；3為Marker。
圖19為粗提蛋白的吸光值。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明作進一步的詳細說明。
實施例1、1、1防治菸草青枯病拮抗細菌SH7的篩選、溫室盆栽控病實驗及促生作用在滅菌培養皿中均勻加入100μl濃度為1×107cfu/ml青枯菌(Ralstonia solanacearum)菌懸液，倒入冷卻到50℃左右的熔化NA培養基20ml充分混勻。待培養基完全凝固後，用接種環點接種供試的拮抗菌，每皿點8-10個待測細菌菌株，30℃溫箱中培養48小時後，檢測抑菌圈的有無及大小。經初次測試有拮抗作用的菌株劃線純化後進行重複測試，基本方法同上，每平板點接3個菌株，各三次重複。從平板抑菌效果看，SH7菌株的室內平板抑菌效果好，抑菌帶寬度達12.2mm，拮抗作用顯著，生防細菌在生長代謝過程中產生了具有抑菌活性的抗生物質。(見表1和圖1)表1 不同菌株對菸草青枯病的抑制作用

注抑菌帶寬為拮抗菌生長邊緣到致病菌的邊緣，各數據為室內平板擴散初測和複測的平均值。
SH7菌株發酵液的抑菌活性測定是將活化的SH7菌株接種於NB培養基中，30℃恆溫，150rpm振蕩培養48小時，4℃離心10min去菌體，用孔徑為0.22μm微孔濾膜過濾除菌，取100μl在平板上檢測其抑菌活性。(如圖2)從圖2可知，SH7菌株發酵液對菸草青枯病菌的平板抑菌活性很強，抑菌圈透明而清晰。
用平板測定獲得的拮抗細菌進行盆栽測試。每次試驗設空白對照CK1(僅接清水)和發病對照CK2(僅接青枯病菌)每處理，設三次重複，每重複5株苗。具體實驗過程如下(1)幼苗浸根取5-6片真葉煙苗於盆缽中拔出，浸根於預先配製好的供試生防菌菌懸液(濃度為1×108cfu/ml)中，30-40min後取出並移栽於裝有滅菌土的花盆中。對照浸根於清水中。其它按照溫室常規管理。
(2)再次灌菌緩苗後，每隔5d於根際接種拮抗菌菌懸液，具體方法如下利用槍頭在煙株根際土壤呈正方形鑽穴，(深約5cm)，每株共4個。將菌懸液注入穴中，1ml/穴，另取1ml淋於莖基部，充分保護煙株根際。如上述方法重複接種兩次。對照接入等量清水。
(3)接種發病1d後，將提前大量繁殖的青枯菌配製成5×107cfu/ml的菌懸液，接種方法同上，接種部位相同，接種量為5ml/株；CK1接等量清水。完成後，將煙株用適量清水保溼，以利發病。
(4)觀察記錄見病株後，每日觀察記錄發病株數。植株可見明顯青枯病症狀，即為發病株。以接種病原菌日為起點日，共觀察25-30d。(見表2)防效計算公式

病情分級0級為無症狀；1級為1-2片葉萎蔫；2級為1/3-1/2葉片萎蔫或莖杆基部變黑；3級為2/3-3/4葉片萎蔫、壞死且莖杆變黑壞死；4級為整株死亡。
表2 SH7盆栽測試結果(20d)


注病情指數為三次重複的平均值。
經盆栽防效檢測，SH7進行測定，結果較對照CK2發病嚴重，SH7除菌發酵液對菸草青枯病的防效測定選用於無菌土種植的煙苗，除對照外設二個處理，處理一用經熱處理殺死菌體後的SH7發酵液灌根，50ml/株，隔3d處理一次，連續2次後，接種青枯病菌R.S；處理二用熱處理殺死菌體後的SH7發酵液與Ralstonia solanacearum菌懸液(濃度為105cfu/ml)作用30min後的混合液灌根(不再接種R.S)；50ml/株，隔3d處理一次，連續2次。對照用NB培養基灌根，處理方式同前。處理一和對照接種Ralstoniasolanacearum(R.S)，菌懸液濃度調整為106cfu/ml，50ml/株。每處理8株煙苗，3次重複，28℃-32℃保溼培養，見病株後，每日觀察記錄發病株數。植株可見明顯青枯病症狀，即為發病株。以接種病原菌日為起點日，共觀察20-29d。防效計算公式和病情分級同上。(見表3和圖3、4、5、6)。
表3 SH7菌株除菌發酵液對菸草青枯病的防效測定結果

*同欄的相同字母表示新復極差檢測差異不顯著(P＝0.05)。
從上述表3及圖中可以看出，經單獨除菌發酵液處理和除菌發酵液與青枯病菌作用30min後處理與NB培養基對照相比，前兩個處理方式均能推遲菸草青枯病的發病時間，分別推遲9d和7d，在接種後第17d，兩個處理的防效分別是84.6％和82.2％，至第29d時，與NB培養液對照相比，防效達到65.99％和53.2％。同時，預先用SH7除菌發酵液保護煙株根部比除菌發酵液與青枯病菌作用30min後處理的防效好。因此，本發明針對菸草青枯病菌(Ralstoniasolanacearum以下簡稱R.S)，通過室內抑菌圈法和活體溫室防效測定，篩選出在溫室條件下對R.S具有良好防病作用的拮抗菌株SH7。
SH7的促生作用，將大田壤土∶農家肥∶蛭石按照7∶2∶1比例配製基質，滅菌後填裝於育苗缽中。小心挖出5-6片真葉的煙苗，小心抖落附著於根部的土壤，並將其浸泡於預選配製好的SH7生防菌菌懸液(濃度約為108cfu/ml)中，30-40min後取出，分別移栽於裝有滅菌土的苗缽中。每處理20株，三次重複，隨機排列，溫室保溼培養。待煙苗長至30d後，隨機選取10株煙苗，小心將苗整株挖出，洗去根部泥土，測量其株高、整株鮮重、根鮮重及乾重和葉色等指標。然後180℃烘乾至恆重，測整株乾重。(見表4)
表4 SH7菌株對滅菌土中菸草的促生作用測定結果

實驗結果表明，接種生防菌於滅菌土種植的菸草時，SH7菌株能促進菸草生長，整株鮮、乾重，根鮮、乾重，根長和株高顯著高於清水對照，增長率為26.9％、35.5％、49.3％、132.3％、37.3％和53.7％，促生作用佳。同時，也說明SH7對菸草是安全的。
1、2 SH7的分類地位分子鑑定參照文獻(林萬明主編細菌分子遺傳學分類鑑定方法[M].上海，上海科學技術出版社1990)方法提取總體DNA，PCR擴增參照(C.W.迪芬巴赫，G.S.德維克斯勒著，黃培堂等譯.PCR實驗技術實驗指南[M]，北京科學技術出版社，2000)方法進行。以SH7菌體基因組DNA為模板，經PCR反應擴增，經0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到一條1.0kb以上的特異性片段，測定該片段序列(PCR產物由北京華大中生生物科技有限公司測序)，結果表明，測得SH7菌株為1409bp。將測得的16s rDNA全序列(見附錄SEQ ID NO1)提交Genbank(www.ncbi.nlm.nlh.gov)，應用其中的BLAST軟體和DNAMAN軟體進行分析，發現，SH7菌株測得的序列與枯草芽孢桿菌16srDNA部分序列相同(圖7)。因此鑑定SH7菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。
實施例2 SH7拮抗蛋白及其特性粗提蛋白的提取及其活性檢測將活化的SH7菌株接種於NB培養基中，30℃恆溫，150rpm振蕩培養48小時，4℃離心10min，去菌體，製成胞外代謝物的發酵上清液。在發酵液中慢慢加入一定量的(NH4)2SO4達到70％的飽和度，攪拌均勻，置4℃條件靜止過夜。
將鹽析液於低溫條件離心20min(12000r/min)，倒去上清液，沉澱物質用1/15體積的PBS緩衝液(pH7.6)懸浮，將上述懸浮液裝入已預處理透析袋(截流分子量為5kD)，透析袋的兩頭用透析夾夾好，置於100倍體積PBS緩衝液(pH7.6)中，於磁力攪拌器上4℃透析24小時，更換透析液後再透析24小時。經透析處理後粗提物質冷凍抽乾後溶解於PBS緩衝液中，用孔徑為0.22μm微孔濾膜過濾除菌，在平板上檢測其抑菌活性。(如圖8、圖9)從圖中可以看出，SH7菌株在NB培養液中振蕩培養48h後，經70％(NH4)2SO4飽和度沉澱並透析後得到的粗蛋白液經平板抑菌活性檢測，有很強的抑菌活性(如圖8)，而去除70％(NH4)2SO4飽和度所得沉澱的上清抑菌活性很微弱(如圖9)；其中一定濃度的鹽也有殺菌作用。因此可以初步認定SH7產生的主要抑菌活性物質是蛋白類物質。
拮抗物質熱穩定性將得到的SH7粗提拮抗物於40℃、60℃、80℃、100℃及121℃(高壓溼熱滅菌)各處理20min，取100μl檢測其以青枯病菌為指示菌的抑菌活性，以未經任何處理的無菌體濾液和PBS緩衝液為對照；觀察拮抗物質對溫度的敏感程度。(見表5及圖10)
表5 不同溫度處理後的SH7粗提蛋白液對菸草青枯病菌的抑菌活性

按照70％硫酸銨飽和度沉澱法獲得的粗提蛋白液分別在設定的不同溫度下處理20min後，粗提液經40℃、60℃、80℃處理後活性保持不變；而將溫度提高為100℃和121℃高壓處理20min後，仍保持大部分對菸草青枯病菌的抑菌活性(如圖10)，與未處理樣品相比，抑菌圈直徑分別減少了3mm和9mm。假設未處理樣品的抑菌率為100％，則經100℃和121℃高壓處理20min後樣品的抑菌率分別為90％和70％。由此可推斷此粗提蛋白為耐熱蛋白，見表5。
拮抗物質pH值穩定性取適量粗提拮抗物質，並分別將其調成3、5、9、11、13不同的pH值，靜置10min後，再將體系調回pH7.0的條件，各取100μl測試其對菸草青枯病菌的抑菌活性。如圖11、12、13)結果表明，pH值為7.0-9.0時該抗菌蛋白的抑菌活性最強，抑菌圈直徑為20mm，pH值為10.0和11.0時的抑菌圈直徑為18mm，且在鹼性條件下的抑菌活性比酸性條件下的活性強；在酸性條件下該拮抗蛋白會產生沉澱，在pH值為3.0左右時全部沉澱，離心後的上清無抑菌活性。由此可得出，拮抗蛋白在中性或偏鹼性條件下都穩定。
拮抗物質對蛋白酶的穩定性取適量粗提物質分別用蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶在最適酶促條件下反應40min(酶反應的終濃度為1mg/ml)，以不用酶處理為對照，取100μl測其對青枯病菌的抑菌活性。經不同蛋白酶處理後的粗提蛋白對菸草青枯病菌的抑菌活性與對照未處理樣品活性一致(如圖14、15)，結果說明該抗菌蛋白對蛋白酶不敏感。
拮抗物質對氯仿的穩定性按照1∶1比例取粗提液與氯仿等量混合，反覆顛倒幾次，靜置10-15min後離心，待殘留氯仿揮發後，分別取100μl有機相部分和水相部分做活性檢測，對照為等量氯仿和原樣品。結果表明，經氯仿處理過的粗提液對菸草青枯病菌的抑菌活性弱於未處理粗提液(如圖16)，水相部分無活性；說明氯仿能萃取出此蛋白粗提液中的抑菌物質，且對抑菌物質有一定影響。
拮抗物質不同有機溶劑萃取取適量無菌粗提液並在其中加入等體積的有機溶劑(二甲苯、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、異丙醇和甲醇，極性依次增強)進行萃取，萃取液分層後，將有機相與水相分開，並將在室溫條件下任有機溶劑揮發後的殘液和水相過濾(過濾器孔徑為0.22μm)除菌，各取100μl測定其抑菌活性，設原樣品和有機溶劑為對照。(見表6、圖17)結果表明，SH7拮抗蛋白粗提液溶於強極性有機溶劑丙酮、異丙醇和甲醇中；應用相對弱極性有機溶劑二甲苯、乙醚和乙酸乙酯從粗提液中萃取到的物質對菸草青枯病菌有不同程度的抑菌活性，水相部分保留微弱的抑菌活性。該結果表明，由SH7產生的抑菌物質極性小的抑菌物質成分可以被弱極性有機溶劑萃取出來。對照各萃取溶劑均無抑菌活性。
表6 SH7粗提蛋白液中不同萃取物的抑菌活性

粗提抑菌物質SDS-PAGE電泳電泳參照汪家政等的方法進行(汪家政 範明主編，蛋白質技術手冊.2000.科學出版社.ISBN7-03-008329-6)，採用12％分離膠，5％濃縮膠。考馬司亮藍R-250染色。70％硫酸銨鹽析的SH7粗提蛋白液和經氯仿處理後的粗提蛋白12％SDS-PAGE電泳結果(如圖18)表明，SH7分泌的粗提蛋白有多條電泳帶，而經氯仿處理後的粗提蛋白與未處理蛋白樣品相比，在35KD處的電泳帶消失，說明此處的蛋白是SH7分泌抑菌蛋白的組分之一。
粗提蛋白吸光值測定將粗提蛋白液稀釋為適當的濃度即可比色，做樣品的同時，做空白，比色時以空白調零。在日立UV-3010紫外分光光度計上，以全波段掃描並記錄其吸收度。粗提蛋白在波長為220-340nm的吸光值測定結果顯示(如圖19)SH7分泌的抗菌物質在274.00nm處有明顯蛋白吸收峰，為典型的蛋白質吸收光譜。
總之，本發明獲得的枯草芽孢桿菌菌株SH7的拮抗物質具有下列特性(1)拮抗細菌SH7菌株產生的拮抗物質可以被硫酸銨沉澱，不能通過5kD(截流分子量大於5kD)的透析袋，對蛋白酶類不敏感，氯仿處理後抑菌活性減弱，可以認為是蛋白類抗菌物質。(2)有機溶劑萃取結果表明，SH7菌株分泌抑菌物質能被弱極性有機溶劑萃取而不能被強極性有機溶劑萃取。(3)拮抗細菌SH7菌株產生的抑菌物質在鹼性條件下穩定，在酸性條件下抑菌物質沉澱析出；當pH值為3.0時，抑菌物質全部沉澱，離心後上清無抑菌活性。(4)通過紫外吸收和SDS-PAGE電泳檢測試驗結果表明，進一步證明SH7分泌的拮抗物質為蛋白或多肽類物質，且是多組分的複合物，在35KD處有一抑菌蛋白組分。
附本發明所涉及的核苷酸序列SEQ ID NO1(SH7菌株16SrDNA全序列)ctggctccataaaggttacctcaccgacttcgggtgttacaaactctcgtggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccagcttcacgcagtcgagttgcagactgcgatccgaactgagaacagatttgtgggattggcttaacctcgcggtttcgctgccctttgttctgtccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcaccttagagtgcccaactgaatgctggcaactaagatcaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcactctgcccccgaaggggacgtcctatctctaggattgtcagaggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcagtcttgcgaccgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagctgcagcactaaggggcggaaaccccctaacacttagcactcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgttcgctccccacgctttcgctcctcagcgtcagttacagaccagagagtcgccttcgccactggtgttcctccacatctctacgcatttcaccgctacacgtggaattccactctcctcttctgcactcaagttccccagtttccaatgaccctccccggttgagccgggggctttcacatcagacttaagaaaccgcctgcgagccctttacgcccaataattccggacaacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggttaggtaccgtcaaggtgccgccctatttgaacggcacttgttcttccctaacaacagagctttacgatccgaaaaccttcatcactcacgcggcgttgctccgtcagactttcgtccattgcggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccgatcaccctctcaggtcggctacgcatcgtcgccttggtgagccgttacctcaccaactagctaatgcgccgcgggtccatctgtaagtggtagccgaagccaccttttatgtctgaaccatgcggttcagacaaccatccggtattagccccggtttcccggagttatcccagtcttacaggcaggttacccacgtgttactcacccgtccgccgctaacatcagggagcaagctcccatctgtccgctcgac
權利要求
1.一株作物青枯病生防枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)菌株SH7，其生物保藏號為CGMCC1732。
2.權利要求1所述的菌株SH7在防治作物青枯病中的應用。
3.根據權利要求2所述的應用，所述作物為菸草。
4.權利要求1所述的菌株SH7在抑制青枯雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)中的應用。
5.權利要求1所述菌株SH7分泌的抗菌蛋白物質混合物，其特徵在於從菌株SH7發酵液中提取，並含有一在鹼性條件下穩定的35kDa的蛋白。
6.權利要求5所述抗菌蛋白混合物在防治作物青枯病中的應用。
全文摘要
本發明為「一株作物青枯病生防枯草芽孢桿菌菌株」，屬生物技術領域。本發明涉及一株作物青枯病生防枯草芽孢桿菌菌株，其生物保藏號為CGMCC1732。該菌株能夠抑制青枯雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)的生長，生防實驗表明能夠防治菸草青枯病。同時本發明還提供了一種從該菌株中得到的拮抗蛋白混合物，在作物青枯病防治方面，具有很高的應用價值。
文檔編號C07K14/32GK1884481SQ200610012179
公開日2006年12月27日 申請日期2006年6月9日 優先權日2006年6月9日
發明者趙廷昌, 王靜, 孔凡玉 申請人:中國農業科學院植物保護研究所