一種重組質粒、構建方法和用於紅黴素產生菌的遺傳改造的製作方法

2023-05-02 15:39:51 1

專利名稱：一種重組質粒、構建方法和用於紅黴素產生菌的遺傳改造的製作方法
技術領域：
本發明屬於基因工程領域，更具體的，本發明涉及一種基因工程構建的重組質粒，以及該重組質粒的構建方法和該質粒在紅黴素產生菌遺傳改造上的應用。

背景技術：
紅黴素是一類在臨床上廣泛使用的、用於治療革蘭氏陽性菌感染的廣譜大環內酯類抗生素。自1952年Lily公司首次成功開發第一代紅黴素類抗生素--紅黴素A以來，以阿齊黴素、克拉黴素、羅紅黴素、氟紅黴素、地紅黴素和大威黴素為代表的第二代紅黴素類抗生素，和以泰利黴素、ABT-773為代表的第三代紅黴素類抗生素具有抗菌活性好、毒性低、不易誘導耐藥性的特點，同時療程短、用藥簡便，在抗感染藥物的使用中保持了較高的增長速度。目前，市場上廣泛使用的第二代和正在推向臨床的第三代紅黴素類抗生素，幾乎全部是通過微生物發酵合成紅黴素A，然後以紅黴素A為原料經半化學合成修飾而得到的紅黴素衍生物。
目前我國是世界最大的紅黴素原料生產國，但是紅黴素發酵生產還普遍存在著有效成分含量偏低的問題。發酵粗產物中紅黴素A的含量只有60～70％，為了達到優級產品標準(92～95％)需經多步純化，分離過程中其他紅黴素相關組分沒有被很好地利用，造成大量的環境汙染和浪費，提高了產品成本。因此，這是紅黴素發酵工業迫切需要解決的問題。
自從紅黴素作為一種廣譜抗生素藥物進入臨床以來，以提高其產生菌種發酵單位為目的的常規遺傳育種和菌種選育工作一直未曾停止。隨著分子生物學技術的發展，近年來，國際上在紅黴素生產菌種的基因工程改造方面進行了諸多嘗試。但這些研究主要集中在與紅黴素生產相關的底物供應或限制因素的改進方面，並未就紅黴素生物合成的次級代謝途徑做特異性的遺傳修飾，因此，在解決紅黴素生產中經常面臨的有效組分偏低等問題時缺乏有效的針對性。
紅黴素是迄今研究最多也最為詳盡的一個模式菌株。1991年Leadlay和Katz等人首次報導了紅黴素的生物合成基因簇。經過多個實驗室10餘年的努力，其生物合成途徑及酶催化反應機製得到了比較完善的闡述，這為代謝工程對其生物合成途徑進行合理化改造提供了必須的遺傳基礎及生化基礎。
人們期望運用代謝工程的手段對紅黴素產生菌進行遺傳改造，可以避免無效組分(如紅黴素B和C等)的產生或將其轉化為有效組分紅黴素A，改善紅黴素發酵產品的組分比例並間接提高紅黴素A的含量。然而菌種的遺傳改造需要合適的操作工具和操作方法。


發明內容
本發明的目的在於提供一種基因工程構建的重組質粒，由載體和在多克隆位點上加入一個含有紅黴素啟動子，大環骨架上碳12位羥基化酶，碳黴糖甲基化酶組合的片段組成，其中載體為大腸桿菌和鏈黴菌穿梭質粒，可以為pKC1139、pOJ260、pWHM3或pSET152等類似的載體；所述的組合，主要特徵是含有紅黴素啟動子(ErmE*)為m個，羥基化酶(EryK)為n個，甲基化酶(EryG)為k個，其中，m＝1～3，n＝1～5，k＝0～4，它們可以任意搭配組合。
本發明的目的還在於提供該重組質粒的構建方法。
本發明的另一目的還在於提供該重組質粒在紅黴素產生菌遺傳改造上的應用。
在本發明提供的一種重組質粒，由載體和在多克隆位點上加入一個含有紅黴素啟動子，大環骨架上碳12位羥基化酶，碳黴糖甲基化酶組合的片段組成，其中載體為大腸桿菌和鏈黴菌穿梭質粒，可以為pKC1139、pOJ260、pWHM3或pSET152等及其類似的載體；所述的組合，主要特徵是含有紅黴素啟動子(ErmE*)為m個，羥基化酶(EryK)為n個，甲基化酶(EryG)為k個，其中，m＝1～3，n＝1～5，k＝0～4，三者可以按所述的數目，任意搭配組合。優選地，m＝1～2，n＝1～3，k＝0～2。最優選地，m＝1，n＝2，k＝1。在本發明的優選例中所述的組合可以為ermE*-eryK、ermE*-eryK-eryG、ermE*-eryK-eryK-eryG或ermE*eryK-eryG-eryK。
在本發明中所述的羥基化酶，是具有如下所示的核苷酸序列 CACCGCGGAAGTCTCGACACCCCGTCCGGCGCGCGACTAAGCTCAAGATCGCGACGCGTGTTCGCCGACGTGGAAACGACCTGCTGCGCGAGGAGAACGTTGACCACCATCGACGAAGTTCCCGGCATGGCCGACGAAACCGCACTCCTCGACTGGCTGGGCACGATGCGCGAGAAGCAGCCGGTGTGGCAGGACCGGTACGGCGTGTGGCACGTCTTCCGCCACGCCGACGTCCAGACGGTGTTGCGCGACACCGCCACGTTCTCCTCCGACCCGACCCGCGTCATCGAGGGCGCGAGCCCGACGCCGGGCATGATCCACGAGATCGACCCGCCGGAGCACCGCGCCCTGCGCAAGGTCGTCAGCAGCGCCTTCACCCCGCGCACCATCTCCGACCTCGAACCCCGCATCCGCGACGTCACCCGCTCGCTGCTGGCCGATGCCGGCGAGAGCTTCGACCTCGTCGACGTGCTCGCGTTCCCGCTGCCGGTCACGATCGTCGCGGAGCTGCTGGGCCTGCCGCCGATGGACCACGAGCAGTTCGGCGACTGGTCGGGTGCCCTGGTCGACATCCAGATGGACGACCCGACCGACCCGGCGCTGGCCGAACGGATCGCGGATGTGCTCAACCCGCTCACCGCGTACCTGAAGGCCCGCTGCGCCGAGCGCCGCGCCGATCCCGGCGACGACCTGATCTCCCGCCTTGTCCTGGCCGAGGTCGACGGGCGCGCGCTCGACGACGAGGAGGCGGCCAACTTCTCCACCGCGCTGCTGCTGGCCGGCCACATCACCACGACCGTCCTGCTCGGCAACATCGTGCGCACCCTCGACGAGCACCCGGCCCACTGGGACGCCGCCGCCGAGGACCCCGGCCGGATCCCGGCGATCGTCGAGGAGGTCCTGCGCTACCGGCCGCCGTTCCCGCAGATGCAGCGCACGACGACCAAGGCCACCGAGGTCGCGGGCGTGCCCATCCCGGCCGACGTCATGGTCAACACCTGGGTGCTCTCGGCCAACCGCGACTCCGACGCCCACGACGACCCCGACCGGTTCGACCCGTCGCGCAAGTCCGGCGGCGCCGCGCAGCTCTCCTTCGGCCACGGCGTGCACTTCTGCCTCGGCGCGCCCCTGGCCCGGCTGGAGAACCGCGTGGCGCTGGAGGAGATCATCGCCCGGTTCGGGCGGCTCACCGTCGACCGCGACGACGAGCGCCTGCGCCACTTCGAACAGATCGTGCTCGGGACCCGTCACCTGCCGGTGCTGGCGGGCTCCTCGCCGAGGCAGTCGGCGTAGTCGGGCAGCATCCCTCGCCGCCTGGCGGTCTCCAGGTCCACGGCCACCGTGTCGCGGTCGGAGAGCACGACCTCCAGGTCCGCGGGCCACGGCAGACCCAGCGCGGGGTCGAACGGGTCGATCGCCTGCTCGTACTCGGCCACGTACGGCGTGCTGACCAGGTACGACATCAGGGTGTCGTCCTCAAGCGCGAGGAAGGCGTGCGCGGTGCCCCTGGGGAAGTAGACCGCCCGGAAGTGCTCGGTGTCCATCTCCACCGCGTCCCACTTCCCGAACGTCGGCGAGCCGACCCGGATGTCGACGATGACGTCGAGCGCCCGGCCGCGCGCGCAGTAGACGTACTTGCACTGCCCCGGCG 在本發明中所述的甲基化酶，是具有如下所示的核苷酸序列 GGTGCTGTTGCCGTCCCTGCGCCCGGCGATCGAGGCCTACGAGAAGTTCTGCCGCAACCTCGGCGAAGACCCGGCCGAGGTGGGGCTCGCATGGGTGCTGTCCCGGCCCGGCATCGCCGGCGCCGTCATCGGCCCGCGAACCCCCGAGCAGCTCGACTCCGCGCTGAAGGCGTCCGCGATGACCCTGGACGAGCAGGCGCTGTCCGAACTGGACGAGATCTTCCCCGCGGTGGCCTCCGGCGGCGCGGCGCCGGAAGCCTGGTTGCAGTGAGCACAAGAGGAACCGAGAAAGGATACGGCTGGTGAGCGTGAAGCAGAAGTCAGCGTTGCAGGACCTGGTCGACTTCGCCAAGTGGCACGTGTGGACCAGGGTGCGGCCGTCCAGCCGTGCGCGCCTGGCCTACGAGCTGTTCGCCGACGACCACGAGGCCACGACCGAGGGCGCCTACATCAACCTCGGCTACTGGAAGCCCGGGTGCGCCGGCCTGGAGGAGGCCAACCAGGAGCTGGCGAACCAGCTCGCCGAGGCCGCGGGGATCAGCGAGGGCGACGAGGTGCTCGACGTCGGGTTCGGGCTCGGCGCGCAGGACTTCTTCTGGCTCGAGACGCGCAAGCCGGCCAGGATCGTCGGCGTCGACCTGACCCCGAGCCACGTCCGCATCGCCTCCGAGCGCGCGGAGCGCGAGAACGTGCAGGACCGCCTGCAGTTCAAGGAGGGCTCGGCGACCGACCTGCCCTTCGGCGCGGAGACCTTCGACCGCGTCACCTCCCTGGAGTCGGCCCTGCACTACGAGCCGCGGACCGACTTCTTCAAGGGCGCGTTCGAGGTGCTCAAGCCCGGAGGCGTGCTGGCCATCGGCGACATCATCCCGCTCGACCTGCGCGAGCCCGGTTCCGACGGACCGCCGAAGCTGGCGCCGCAGCGGTCGGGATCGCTGTCCGGCGGCATCCCGGTGGAGAACTGGGTGCCCCGCGAGACCTACGCCAAGCAGCTCCGCGAAGCGGGCTTCGTCGACGTCGAGGTGAAGTCGGTCCGCGACAACGTGATGGAGCCCTGGCTGGACTACTGGCTGCGCAAGCTGCAGGACGAGTCGTTCAAGAAGAGCGTGAGCAGGCTCTTCTACAGCCAGGTCAAGCGGTCGCTGACCAGCGACTCGGGCATGAAGGGCGAGCTGCCCGCGCTCGACTTCGTGATCGCCTCAGCCCGCAAGCCCGGCGCGTAGCAGGTCCCGGCGCACGGCACCGGCCACCTCGGTGACCTGTTCACCCAGGTAGAAGTGCCCGCCGGGGAAGGTCCTGGTCCGGCCGGGGATGACCGAGTGCTGCAACCAGCGCTCGGCGTCCCCGGTCGCGGTCAGCGGGTCGGCGTCGCCGCACAGCGCGGTGATGCCGGCCCGCAGCGGTGGTCCGTCCGCCCAGGCGTAGGAGCGCAGCACGCGGTAG 在本發明中所述的紅黴素啟動子，是具有如下所示的核苷酸序列 TTAAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTTTTTTTTGGAGATTTTCAACGTGAAAAAATTATTATTCGCAACTCCTTTAGTTGTTCCTTTCTATTCTCACTCCGCTGAAACTGTTGAAAGTTGTTTAGCAAAACCTCATACAGAAAATTCATTTACTAACGTCTGGAAAGACGACAAAACTTTAGAACTAGAAGCCCGACCCGAGCACGCGCCGGCACGCCTGGTCGATGTCGGACCGGAGTTCGAGGTACGCGGCTTGCAGGTCCAGGAAGGGGACGTCCATGCGAGTGTCCGTTCGAGTGGCGGCTTGCGCCCGATGCTAGTCGCGGTTGATCGGCGATCGCAGGTGCACGCGGTCGATCTTGACGGCTGGCGAGAGGTGCGGGGAGGATCTGACCGACGCGGTCCACACGTGGCACCGCGATGCTGTTGTGGGCACAATCGTGCCGGTTGGTA 如本發明所用，「所述的羥基化酶，甲基化酶和紅黴素啟動子」包括上述的基因序列對應的蛋白酶，也指經過一個或多個胺基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的同功能酶。比如，所述的羥基化酶類似物的序列是對羥基化酶的一個或多個保守胺基酸進行替代所形成的，所述經胺基酸替換後形成的序列並不影響其活性或保留了其大部分的活性。適當替換胺基酸是本領域的公知的技術，所述技術可以很容易地被實施並且確保不改變所得分子的生物活性。這些技術使本領域人員認識到，一般來說，在一種蛋白或多肽的非必要區域改變一個或多個胺基酸基本上不會改變生物活性(見Watson等Molecular Biology ofThe Gene，第四版，1987，The Benjamin/Cummings Pub.Co.P224)。
本發明提供的上述重組質粒的構建方法，系由載體和在多克隆位點上加入一個含有紅黴素啟動子，大環骨架上碳12位羥基化酶，碳黴糖甲基化酶組合的片段組成，其中載體為大腸桿菌和鏈黴菌穿梭質粒，可以為pKC1139、pOJ260，pWHM3或pSET152等及其類似的載體；所述的組合，是含有紅黴素啟動子(ErmE*)為m個，羥基化酶(EryK)為n個，甲基化酶(EryG)為k個，其中，m＝1～3，n＝1～5，k＝0～4，它們可以如所述的數目，任意搭配組合。
可以進一步描述如下 針對現有紅黴素產生菌的遺傳改造主要集中在與紅黴素生產相關的底物供應或限制因素的改進方面，並未就紅黴素生物合成的次級代謝途徑做特異性的遺傳修飾，因此，在解決紅黴素生產中經常面臨的有效組分偏低等問題時缺乏有效的針對性。本發明人經過長期而深入的研究和試驗，首次通過基因工程的手段對克隆的紅黴素生物合成後修飾酶，更具體的是指大環骨架上碳12位羥基化酶和碳黴糖甲基化酶，以及克隆並改進的紅黴素啟動子，通過其不同搭配組合來構建重組質粒，並用於紅黴素產生菌的遺傳改造，發現能明顯改善紅黴素組分，甚至獲得了只產生單一有效組分的生產菌種。基於此完成了本發明。
(1)，以紅黴素生產菌株S.erythraea HL3168E3的基因組為模板，採用引物5』-AAA CTG CAG CAC CGC GGA AGT CTC GAC ACC-3』和5』-TTT AAGCTT CGC CGG GGC AGT GCA AGT ACG-3』克隆eryK基因的編碼序列，得到1.7kb的PCR產物，將其置於PermE*啟動子下，通過酶切位點克隆到大腸桿菌和鏈黴菌穿梭載體中，得到含有ermE*-eryK結構的重組質粒； (2)，以紅黴素生產菌株S.erythraea HL3168E3的基因組為模板，採用引物5』-AAA CTC GAG CAC CGC GGA AGT CTC GAC ACC-3』和5』-TTT ACTAGT GCT GCC CGA CTA CGC CGA CTG-3』克隆eryK基因的編碼序列，得到1.3kb的PCR產物，其中不包含eryK基因下遊自身含有的終止序列；同樣地，採用引物5』-TTA CCA TGG GGT GCT GTT GCC GTC CCT GCG-3』and 5』-TCG ACTAGT CTA CCG CGT GCT GCG CTC CTA-3』克隆eryG基因的編碼序列，得到1.5kb的PCR產物，將eryK-G的拷貝置於PermE*啟動子下，通過酶切位點克隆到大腸桿菌和鏈黴菌穿梭載體中，得到含有ermE*-eryK-eryG結構的重組質粒；或 (3)，將上述(2)得到的eryK基因PCR產物和eryG基因PCR產物，通過酶切位點克隆到載體中，得到兩種不同順序拷貝的基因，eryK-K-G和eryK-G-K，分別置於PermE*啟動子下，再通過酶切位點連入大腸桿菌和鏈黴菌穿梭載體中，得到含有ermE*-eryK-eryK-eryG結構或含有ermE*-eryK-eryG-eryK結構的重組質粒。
本發明還提供一種所述的重組質粒的用途，用於紅黴素產生菌的遺傳改造，該紅黴素生產菌已經同時申請發明名稱為『一種優化紅黴素發酵組分的菌種、構建方法和用途』的中國專利。紅黴素生產菌可以含有所述的重組質粒；或 它的基因組中整合有額外的所述數目的羥基化酶，甲基化酶和紅黴素啟動子。
所述的紅黴素生產菌，是具有紅黴素生產能力的糖多孢紅黴菌，分類命名為Saccharopolyspora erythraea。
在本發明的優選例中所述的紅黴素生產菌可以為Saccharopolysporaerythraea HL3168E3、Saccharopolyspora erythraea E1、Saccharopolysporaerythraea NRRL2338或Saccharopolyspora erythraea A226。
可以進一步描述如下 (1)，以含有ermE*-eryK結構的重組質粒對紅黴素生產菌S.erythraeaHL3168E3進行改造，能夠完全消除原菌株的雜質紅黴素B組分。
將含有含有ermE*-eryK結構的重組質粒通過屬間接合轉移的方法導入紅黴素生產菌S.erythraea HL3168E3，通過抗性篩選初步得到接合子，進一步通過southern確證，得到通過同源重組方式與原生產菌S.erythraea HL3168E3基因組eryK基因發生單交換重組的重組菌S.erythraea ZL1001。其基因型為PermK*-K+PermE*-K+PermA*-G。基因型的分析和southern確證如圖8A，B所示。
如圖9所示，重組菌S.erythraea ZL1001的生物效價測定相對野生型S.erythraea HL3168E3沒有明顯變化。但發酵液的HPLC分析揭示(如圖8C)，Er-B幾乎完全排除，而同時Er-C卻相應地從6％增加到19％，Er-AEr-B+C的比例也從出發菌株的2.9提高到3.9。這一結果說明使用這樣的重組質粒對原生產菌株進行遺傳改造，能夠完全消除雜質紅黴素B組分，達到有效改善紅黴素組分的目的。
(2)，以含有ermE*-eryK-eryG結構的重組質粒對紅黴素生產菌S.erythraea HL3168E3進行改造，能夠明顯降低原菌株的雜質紅黴素B和C組分。
將含有含有ermE*-eryK-eryG結構的重組質粒通過屬間接合轉移的方法導入紅黴素生產菌S.erythraea HL3168E3，通過抗性篩選初步得到接合子，進一步通過southern確證，得到通過同源重組方式與原生產菌S.erythraea HL3168E3基因組eryK基因發生單交換重組的重組菌S.erythraea ZL1002，其基因型為PermK*-K-G+PermE*-K+PermA*-G。或與原生產菌S.erythraea HL3168E3基因組ery G基因發生單交換重組的重組菌S.erythraea ZL1003，其基因型為PermK*-K+PermA*-G+PermE*-K-G。基因型的分析和southern確證如圖8A，B所示。
發酵液的HPLC分析(如圖8C)顯示，重組菌S.erythraea ZL1002和ZL1003的中間產物Er-B和Er-C明顯減少，ZL1002的Er-AEr-B+C的比例也提高到17.20。而生物效價測定結果顯示(圖9)，ZL1003與出發菌株的差異不是很顯著，但ZL1002的Er產量提高了21.5％，而相應的Er-B+C下降了20.3％。這一結果說明使用這樣的重組質粒對原生產菌株進行遺傳改造，能夠明顯降低原菌株的雜質紅黴素B和C組分，達到有效改善紅黴素組分的目的。
(3)，以含有ermE*-eryK-eryG-eryK結構的重組質粒對紅黴素生產菌S.erythraea HL3168E3進行改造，能夠完全去除原菌株的雜質紅黴素B和C組分。
將含有含有ermE*-eryK-eryG結構的重組質粒通過屬間接合轉移的方法導入紅黴素生產菌S.erythraea HL3168E3，通過抗性篩選初步得到接合子，進一步通過southern確證，得到通過同源重組方式與原生產菌S.erythraea HL3168E3基因組eryK基因發生單交換重組的重組菌S.erythraea ZL1007，基因型為PermK*-K-G-K+PermE*-K+PermA*-G，和ZL1008基因型為PermK*-K+PermE*-K-G-K+PermA*-G，或與原生產菌S.erythraea HL3168E3基因組ery G基因發生單交換重組的重組菌S.erythraea ZL1009，基因型為PermK*-K+PermA*-G-K+PermE*-K-G。基因型的分析和southern確證如圖8A，B所示。
從發酵液的HPLC分析(如圖8C)可以看出，採用這一策略能明顯改善紅黴素組分。有兩種重組菌能基本上去除雜質組分，ZL1007的Er-B和Er-C基本上降低至0，只產生單一有效組份Er-A。這種重組菌的發酵粗產物已經基本上達到了去除雜質組分的目的。而且採用這一策略，也能更進一步提高紅黴素產量(如圖9)。相對出發菌S.erythraea HL3168E3，重組菌S.erythraea ZL1007，ZL1008，ZL1009的Er產量提高了30.2％，27.7％，11.5％。
採用本發明的上述重組質粒可以用於紅黴素生產菌的遺傳改造，能夠明顯改善紅黴素組分，甚至獲得只產生紅黴素主要有效組份紅黴素A的生產菌種。



圖1PCR擴增得到羥基化酶，甲基化酶基因的瓊脂糖電泳結果。
圖2含有ermE*-eryK結構的重組質粒的構建過程。
圖3含有ermE*-eryK-eryG結構的重組質粒的構建過程。
圖4含有ermE*-eryK-eryK-eryG結構的重組質粒的構建過程。
圖5含有ermE*-eryK-eryG-eryK結構的重組質粒的構建過程。
圖6組合分別為ermE*-eryK、ermE*-eryK-eryG、ermE*-eryK-eryK-eryG或ermE*-eryK-eryG-eryK結構的重組質粒的酶切鑑定。
圖7出發菌株S.erythraea HL3168E3發酵液的高效液相色譜(HPLC)分析以及和紅黴素A、B和C標準品的對照。
圖8出發菌株S.erythraea HL3168E3和重組菌的基因型和表型。
圖9出發菌株S.erythraea HL3168E3和重組菌的生物效價測定。
符號說明 附圖1中A是羥基化酶的1.7kb PCR產物，其中泳道1.1kb分子量標準，泳道2.EryK基因1.7kb PCR產物；B是羥基化酶1.3kb PCR產物和甲基化酶1.5kbPCR產物，其中泳道1.1kb分子量標準，泳道2.eryG基因PCR產物，泳道3.eryK基因PCR產物。
附圖6中A是含有ermE*-eryK結構的重組質粒pCY1-56-B(A)的酶切鑑定，其中泳道1.1Kb分子量標準，泳道2.pCY1-56-B EcoRI/HindIII酶切，泳道3.pCY1-56-B PstI酶切，泳道4.pCY1-56-B BamHI酶切；B是含有ermE*-eryK結構的重組質粒pCY1-96-1(B)的酶切鑑定，其中泳道5.1Kb分子量標準，泳道6.pCY1-96-1EcoRI/HindIII酶切，泳道7.pCY1-96-1BamHI酶切；C是含有ermE*-eryK-eryG結構的重組質粒pCY3-69-1的酶切鑑定，其中泳道1.1Kb分子量標準，泳道2.pCY3-69-1EcoRI/HindIII酶切，泳道3.pCY3-69-1XhoI酶切；D是含有ermE*-eryK-eryK-eryG結構的重組質粒pCY3-69-3的酶切鑑定，其中泳道1，4.1Kb分子量標準，泳道2.pCY3-69-3EcoRI/HindIII酶切，泳道3.pCY3-69-3XhoI酶切；E是含有ermE*-eryK-eryG-eryK結構的重組質粒pCY4-17-6的酶切鑑定，其中泳道4.1Kb分子量標準，泳道5.pCY4-17-6EcoRI/HindIII酶切，泳道6.pCY4-17-6XhoI酶切；kb表示鹼基對。
附圖8中誤差線I表示95％標準偏差；A是SmaI或SphI的限制酶切圖譜；B是以含有eryK基因的1.7kb的片段為探針，用SmaI或SphI消化的總DNA的southern圖譜；C，紅黴素發酵液的HPLC分析●，紅黴素C；★，紅黴素A；▲，紅黴素B；I表示出發菌株S.erythraea HL3168E3；II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX和X分別表示重組菌；kb表示鹼基對。
附圖9中Erythromycin表示紅黴素；HL3168表示出發菌株S.erythraeaHL3168E3；ZL1001～ZL1009分別表示相對應的附圖8中的II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX和X重組菌。

具體實施例方式 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。本發明的其它方面由於本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的，下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用於本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示範之用，但不能限制本方面的內容。
實施例1含有ermE＊-eryK結構的重組質粒的構建 以工業生產上糖多孢紅黴菌S.erythraea HL3168E3的基因組DNA為模板，採用引物5』-AAA CTG CAG CAC CGC GGA AGT CTC GAC ACC-3』和5』-TTT AAG CTT CGC CGG GGC AGT GCA AGT ACG-3』克隆eryK基因的編碼序列，結果如圖1.A所示，得到1.7kb的PCR產物。
將上述PCR產物回收純化後克隆至

-Teasy載體，酶切驗證後，進行測序。我們將測序結果與Genebank中Stassi提交的數據進行比較後發現，有兩處不一致。一處位於啟動子區，在起始密碼子上遊38bp處，鹼基由TGC變為TTC，這一位置的胺基酸由Genebank的半胱氨酸(Cys)變為我們生產菌中的苯丙氨酸(Phe)；另一處位於編碼區內，在起始密碼子下遊988bp處，鹼基由TTC變為CTC，相應胺基酸由資料庫中的苯丙氨酸(Phe)變為生產菌中的亮氨酸(Leu)。
從測序正確的克隆載體pCY1-40-B中用PstI和HindIII雙酶切下1.7kb目的片段eryK基因，克隆至PstI/HindIII酶切的載體pWHM3得到重組質粒pCY1-50-C，再從質粒BSVII-41-F中用EcoRI/XbaI酶切下0.5kb含有改造的紅黴素自身的強啟動子PermE＊，克隆到EcoRI/XbaI酶切的質粒pCY1-50-C，於是得到含有PermE＊-eryK基因的重組質粒pCY1-56-B。用EcoRI/HindIII酶切質粒pCY1-56-B，回收2.2kb目的片段，克隆入EcoRI/HindIII酶切的pKC1139載體中，得到重組質粒pCY1-96-1。構建過程如圖2所示。
分別選用幾組酶來酶切驗證重組質粒pCY1-56-B和pCY1-96-1，酶切圖譜如圖6.A和B所示，與理論預期完全一致，證明構建的重組質粒正確。
實施例2含有ermE＊-eryK-eryG結構的重組質粒的構建 以工業生產上糖多孢紅黴菌S.erythraea HL3168E3的基因組DNA為模板，採用引物5』-AAA CTG CAG CAC CGC GGA AGT CTC GAC ACC-3』和5』-TTT AAG CTT CGC CGG GGC AGT GCA AGT ACG-3』及5』-TTA CCA TGGGGT GCT GTT GCC GTC CCT GCG-3』和5』-TCG ACT AGT CTA CCG CGTGCT GCG CTC CTA-3』克隆eryK基因和eryG基因的編碼序列，產物用1％瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖1.B所示，可見產物有非常特異的擴增。
將eryK基因PCR產物克隆到載體pANT841中，測序鑑定，得到eryK基因序列正確的載體pCY3-48-K4。從質粒BSVII-41-F中用EcoRI/SacI酶切下改造的紅黴素組成型啟動子PermE＊片段，插入到EcoRI/SacI酶切的質粒pCY3-48-K4，於是得到含有PermE＊-eryK基因的重組質粒pCY3-58-B1。將eryG基因PCR產物用NcoI/SpeI酶切下克隆到載體pANT841中，測序鑑定，得到含有eryG基因序列正確的重組質粒pCY3-48-G4。用NcoI/HindIII酶切質粒pCY3-48-G4，回收1.5kb的eryG基因目標產物，插入到NcoI/HindIII酶切的載體pET-28a，得到重組質粒pCY3-60-A8，再用XbaI/HindIII酶切質粒pCY3-60-A8，回收1.5kb的eryG基因目標產物，利用SpeI和XbaI的同尾酶特點，將回收片段插入到SpeI/HindIII酶切的質粒pCY3-58-B1，得到含有PermE＊-eryK-eryG基因拷貝的重組質粒pCY3-64-KG1，並用EcoRI/HindIII酶切，回收3.3kb目的片段，克隆入EcoRI/HindIII酶切的載體pKC 1139中，得到pKC1139衍生的重組質粒pCY3-69-1，構建過程如圖3所示。
分別選用幾組酶來酶切驗證重組質粒pCY3-69-1，酶切圖譜如圖6.C所示，與理論預期完全一致，證明構建的重組質粒正確。
實施例3含有ermE＊-eryK-eryK-eryG結構和ermE＊-eryK-eryG-eryK結構的重組質粒的構建 從eryK基因測序正確的質粒pCY3-48-K4中用XhoI和HindIII雙酶切下1.3kb目的片段eryK基因，克隆至XhoI/HindIII酶切的載體pGEM-7zf，得到質粒pCY3-58-F6，而後再用XbaI/HindIII酶切下目的片段eryK基因，利用XbaI和SpeI同尾酶的特點，克隆到SpeI/HindIII雙切的質粒pCY3-58-B1，於是得到含有PermE＊-eryK-eryK基因串聯拷貝形式的重組質粒pCY3-62-KK8。
另外從eryG基因測序正確的質粒pCY3-60-A8中用XbaI/HindIII雙酶切下1.5kb目的片段eryG基因，再克隆到SpeI/HindIII雙切的質粒pCY3-62-KK8中，得到含有PermE＊-eryK-eryK-eryG基因串聯拷貝形式的重組質粒pCY3-66-KKG6，然後用EcoRI/HindIII酶切，回收4.6kb目的片段，克隆入EcoRI/HindIII酶切的載體pKC 1139中，得到pKC 1139衍生的重組質粒pCY3-69-3，構建過程如圖4所示。
從質粒pCY3-58-F6用XbaI/HindIII酶切下目的片段eryK基因，克隆到SpeI/HindIII雙切的質粒pCY3-64-KG1，得到含有PermE＊-eryK-eryG-eryK基因串聯拷貝形式的重組質粒pCY4-16-8，然後用EcoRI/HindIII酶切，回收4.6 kb目的片段，克隆入EcoRI/HindIII酶切的載體pKC 1139中，得到pKC1139衍生的重組質粒pCY4-17-6，構建過程如圖5。
分別選用幾組酶來酶切驗證重組質粒pCY3-69-3和pCY4-17-6，酶切圖譜如圖6.D和E所示，與理論預期完全一致，證明構建的重組質粒正確。
實施例4含有ermE＊-eryK結構的重組質粒用於紅黴素工業生產菌HL3168E3的遺傳改造 將鑑定後的重組質粒pCY1-96-1轉化到大腸桿菌E.coli ET12567中，按如下方式將其導入S.erythraea HL3168E3中培養含有適當質粒的E.coli ET12567至OD600＝0.5-0.6，25mL培養液中的細菌細胞離心收集，用等體積的LB洗兩次，重懸於2mL LB中，作為大腸桿菌供體細胞。取適量凍存於-80℃的S.erythraeaHL3168E3的20％甘油孢子懸液500μL，用等體積的TES buffer洗兩次，重懸於等體積的TES buffer，50℃熱激10min使孢子萌發。再加等體積的TSB，37℃溫育2-5hr。離心重懸於0.5-1mL LB中作為鏈黴菌受體細胞。將不同濃度的受體細胞100μL與等體積的供體細胞混合直接塗布在含有10mM MgCl2的MS平板上，30℃培養20hr後，採用無菌水輕輕洗滌平板表面以洗去大部分大腸桿菌，在每一平板的表面覆蓋含萘啶酮酸(終濃度為50ng/μL)和相應抗生素的1mL無菌水。30℃培養5天以上挑取接合子。
所得到的重組菌株，取出10μL接種至液體培養基TSB(Am 25μg/ml)，37℃，振蕩培養2-3天，小量抽提基因組DNA，用SmaI酶切DNA，使用用於同源交換的含有eryK基因的1.7kb的片段作為探針進行Southern雜交，鑑定其基因型。理論分析整合前基因組的基因型為PermK＊-eryK+PermA＊-eryG，整合後基因型為PermK＊-eryK+PermE＊-eryK+PermA＊-eryG(如圖8A所示)。雜交後結果如圖8B所示，出發菌株和重組菌株與理論分析整合前後的片段大小比較，完全一致，證明ermE*-eryK結構的基因已經整合到紅黴素生產菌S.erythraeaHL3168E3中。Southern鑑定獲得其基因型為PermK*-K+PermE*-K+PermA*-G，命名為重組菌S.erythraea ZL1001。
實施例5紅黴素的搖瓶發酵 紅黴素工業生產菌株HL3168E3和它的重組菌株在斜面培養基[/L10g玉米澱粉，10ml玉米漿，3g氯化鈉，3g硫酸銨，5g碳酸鈣，pH 7.0，2g瓊脂粉](重組菌培養時在培養基中加入適當的抗生素)34℃培養7天生長孢子，作為液體發酵的種子。
液體發酵時，從斜面培養基上取1cm2大小方塊接入50ml發酵種子培養基[/L50g玉米澱粉，18g黃豆餅粉，13ml玉米漿，3g氯化鈉，1.2g硫酸銨，1.2g硝酸銨，5ml豆油，6g碳酸鈣，pH 6.8～7.0]，在34℃，250rpm培養2天。然後將5ml的種子培養液轉接到50ml發酵培養基[/L40g玉米澱粉，30g黃豆餅粉，30g糊精，2g硫酸銨，10ml豆油，6g碳酸鈣，pH自然]，在34℃，250rpm培養6天。接種24小時後補加0.5ml的正丙醇。
實施例6紅黴素發酵液產物抽提 在100ml燒杯中，準確量取適量發酵液以NaOH調pH至8.9。若樣品冰凍，應融化後混合均勻定量轉移至250ml容量瓶中，以水定容，混合均勻，8000～9000離心10min。
取25ml上述溶液於125ml分液漏鬥中，加25ml正己烷，震蕩5min，收集水相(下層)於離心管中，用水洗滌己烷層2次後，水相與離心管水相混合，加入10ml氯仿，激烈震蕩5min，2500離心5min，依樣品情況，可能會在界面形成乳狀液，可用玻棒分散或再次離心，棄水相，將氯仿(下層)移至10ml的小瓶中，濃縮。
實施例7紅黴素發酵液生物效價測定 取直徑約90mm，高16-17mm的平底雙碟，分別注入加熱融化的培養基20ml，使在碟底內均勻攤布，放置水平臺上使凝固，作為底層，另取培養基適量加熱融化後，放冷至48-50℃，加入短小芽孢桿菌菌懸液適量，搖勻，在每一雙碟中分別加入5ml，使在底層上均勻攤布，作為上層含菌層。放置水平臺上冷卻後，在每一雙碟中以等距離安置不鏽鋼小管(內徑6.0mm±0.1mm，高1.0±0.1mm，外徑7.8±0.1mm)四個，用瓦蓋覆蓋備用。將樣品分成高低兩個濃度以磷酸緩衝液進行適當稀釋後加入牛津杯。高低濃度的稀釋倍數為2∶1或4∶1，二劑量法標準溶液的高濃度所致的抑菌圈直徑在18-22mm以內，抗生素濃度範圍為5-20單位/ml。37℃培養14-16小時後，測量抑菌圈大小。
[稀釋緩衝液磷酸氫二鉀5.59g與磷酸二氫鉀0.41g加水至1000ml，過濾，115℃滅菌30min。pH＝7.8 效價的計算 標準品(S)試驗品(T)AT是T的估計效價效價PT 生物檢定將T和其S在相同的試驗條件下同時對生物或離體器官等的作用進行比較，通過對比計算出它們的等反應效呈比值(R)，以測得T的效價PT R是S和T的等反應劑呈(dS，dT)的比值，即R＝dS/dT M是S和T的對數等反應劑呈(XS，XT)之差，即M＝lgdS-lgdT＝XS-XT R＝antilgM PT是通過檢定測得T的效價含量，稱T的測得效價，是將效價比值(R)用T的估計效價AT校正之後而得，即 PT＝AT*R 或試驗品效價＝Q＊估計效價 Q＝log-1[(T2+T1-S2-S1)＊I/(T2+S2-T1-S1) I為高劑呈與低劑呈之比，I為4∶1時logI＝0.6021 2∶1時logI＝0.3010 S2高劑呈標準品的抑菌圈半徑 S1低劑呈標準品的抑菌圈半徑 T2高劑呈試驗品的抑菌圈半徑 T1低劑呈試驗品的抑菌圈半徑] 實施例8紅黴素發酵液的色-質譜分析 樣品分析前加入適當的流動相，超聲助溶，進樣20μl。
組分的分析採用HPLC檢測 色譜柱NUCLEOSIL 100-5CN(250×4.6mm，Ser.No.6105322，MACHEREY-NAGEL Inc.，Germany)。
流動相69％A相(32mM potassium phosphate buffer，pH8.0)，31％B相(acetonitrile/methanol75/25)。
檢測條件流速1ml/min，UV檢測波長215nm，在Agilent 1100HPLCsystem(Agilent Technologies.Palo Alto，CA)上分析時間為50分鐘。
組分的鑑定採用LC-MS檢測 色譜柱Microsorb-MV C 18(250×4.6mm，Part No.281505，VARIAN Inc.，American)。
流動相62％A相(30mM ammonium acetate，pH4.8)，38％B相(acetonitrile)。
檢測條件流速1ml/min，UV檢測波長215nm，在LCMS-2010A(LiquidChromatograph Mass Spectrometer，SHIMADZU，JP)上分析時間為30分鐘。
Er-A，Er-B和Er-C分子離子峰分別為m/z＝734.2，m/z＝718.3and m/z＝720.3，與對應的分子式C37H67NO13，C37H67NO12and C36H65O13一致。
實施例9核酸分子雜交 1)DIG DNA標記將待標記的DNA用無菌水稀釋至總體積15μL，沸水浴中加熱變性10分鐘，立即置於冰鹽浴中冷卻。接著加入2μL引物混合物，2μLdNTP混合物，1μL酶，混合均勻後，37℃水浴約16小時。加入0.8μL 0.8MEDTA(pH8.0)以終止反應，加入2.5μL 4M LiCl混合均勻，再加入75μL預冷的無水乙醇沉澱標記後的DNA，置於-80℃沉降40分鐘。4℃，12000rpm離心20分鐘收集DNA，用預冷的70％乙醇洗滌DNA沉澱，真空乾燥後重新溶於50μL TE((pH 8.0)中。
2)DIG DNA探針標記後的質量檢測稀釋經1)標記得到的DNA探針，至以下六個梯度，1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5。稀釋標記的對照DNA至以下濃度1μg/mL，100ng/mL，10ng/mL，1ng/mL，0.1ng/mL，0.01ng/mL。分別取1μL上述梯度的DNA樣品點在雜交用的尼龍膜上，根據6)所述步驟進行顯色反應，對比標記的DNA探針和對照DNA的顯色強度以決定所標記的DNA探針濃度。
3)Southern雜交的膜轉移DNA樣品在適當濃度的瓊脂糖凝膠上電泳至適當距離，做好標記。浸泡於400mL 0.25M HCl中脫嘌呤20分鐘，使溴酚藍變黃，用去離子水洗數次。室溫下浸入鹼性緩衝液(0.5M NaOH，1M NaCl)15分鐘並輕輕振蕩。換液一次繼續浸泡凝膠20分鐘，並輕輕振蕩，去離子水洗三次。取一張每邊都比凝膠大1mm的尼龍膜，用去離子水完全浸溼，做好標記。採用向上毛細管轉移方法，用10×SSC轉移緩衝液轉移8-24hr。用2×SSC略微洗膜，120℃烘烤30分鐘。
4)預雜交和雜交預熱雜交液(20mL/100cm2)至雜交溫度68℃，放入雜交尼龍膜，輕輕振蕩並保溫30分鐘。將DIG標記的DNA探針在沸水浴中變性5分鐘，立即置於冰鹽浴中冷卻。冷卻後，將DNA探針與合適體積的DIG雜交液(2.5mL/100cm2)混合均勻。去除預雜交液並立即把DNA探針/DIG雜交液加入，輕輕振蕩保持雜交溫度64℃或68℃約16小時。
5)雜交後嚴緊洗脫室溫下用2×SSC/0.1％SDS漂洗兩次，每次5分鐘。68℃，用0.1×SSC/0.1％SDS振蕩漂洗兩次，每次15分鐘。
6)顯色反應和檢測嚴緊洗脫後的尼龍膜在洗滌緩衝液(0.1M馬來酸，0.15M NaCl，pH＝7.5，0.3％(v/v)Tween 20)中平衡1-5分鐘，接著在封閉緩衝液(封閉試劑以10％的濃度溶於0.1M馬來酸，0.15M NaCl，pH＝7.5)中封閉30分鐘，然後在抗體中浸泡30分鐘。用洗滌緩衝液漂洗尼龍膜兩次後，用檢測緩衝液(0.1M Tris-HCl，0.1M NaCl，pH＝9.5)平衡2-5分鐘，最後將尼龍膜置於10mL新配製的顯色溶液[NBT(nitroblue tetrazolium chloride)溶於70％DMF，濃度為70mg/mL，BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate)溶於水，濃度為50mg/mL。用時10mL顯色溶液中加45μL NBT，35μL BCIP]中，置於黑暗中顯色。顯色合適後用去離子水漂洗以終止反應。
權利要求
1.一種基因工程構建的重組質粒，由載體和在多克隆位點加入一個含有紅黴素啟動子ErmE*為m個，大環骨架上碳12位羥基化酶EryK為n個，碳黴糖甲基化酶EryG為k個組合的片段組成，其中載體為大腸桿菌和鏈黴菌穿梭質粒，其特徵在於，所述的紅黴素啟動子，羥基化酶和甲基化酶之間的組合，具有如下所示的結構
(X)m-(Y)n-(Z)kI
其中，X為紅黴素啟動子ErmE*，所述的紅黴素啟動子具有如下的核苷酸序列
TTAAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTTTTTTTTGGAGATTTTCAACGTGAAAAAATTATTATTCGCAACTCCTTTAGTTGTTCCTTTCTATTCTCACTCCGCTGAAACTGTTGAAAGTTGTTTAGCAAAACCTCATACAGAAAATTCATTTACTAACGTCTGGAAAGACGACAAAACTTTAGAACTAGAAGCCCGACCCGAGCACGCGCCGGCACGCCTGGTCGATGTCGGACCGGAGTTCGAGGTACGCGGCTTGCAGGTCCAGGAAGGGGACGTCCATGCGAGTGTCCGTTCGAGTGGCGGCTTGCGCCCGATGCTAGTCGCGGTTGATCGGCGATCGCAGGTGCACGCGGTCGATCTTGACGGCTGGCGAGAGGTGCGGGGAGGATCTGACCGACGCGGTCCACACGTGGCACCGCGATGCTGTTGTGGGCACAATCGTGCCGGTTGGTA；
Y為紅黴素生物合成過程中大環骨架上碳12位羥基化酶EryK，具有如下的核苷酸序列
CACCGCGGAAGTCTCGACACCCCGTCCGGCGCGCGACTAAGCTCAAGATCGCGACGCGTGTTCGCCGACGTGGAAACGACCTGCTGCGCGAGGAGAACGTTGACCACCATCGACGAAGTTCCCGGCATGGCCGACGAAACCGCACTCCTCGACTGGCTGGGCACGATGCGCGAGAAGCAGCCGGTGTGGCAGGACCGGTACGGCGTGTGGCACGTCTTCCGCCACGCCGACGTCCAGACGGTGTTGCGCGACACCGCCACGTTCTCCTCCGACCCGACCCGCGTCATCGAGGGCGCGAGCCCGACGCCGGGCATGATCCACGAGATCGACCCGCCGGAGCACCGCGCCCTGCGCAAGGTCGTCAGCAGCGCCTTCACCCCGCGCACCATCTCCGACCTCGAACCCCGCATCCGCGACGTCACCCGCTCGCTGCTGGCCGATGCCGGCGAGAGCTTCGACCTCGTCGACGTGCTCGCGTTCCCGCTGCCGGTCACGATCGTCGCGGAGCTGCTGGGCCTGCCGCCGATGGACCACGAGCAGTTCGGCGACTGGTCGGGTGCCCTGGTCGACATCCAGATGGACGACCCGACCGACCCGGCGCTGGCCGAACGGATCGCGGATGTGCTCAACCCGCTCACCGCGTACCTGAAGGCCCGCTGCGCCGAGCGCCGCGCCGATCCCGGCGACGACCTGATCTCCCGCCTTGTCCTGGCCGAGGTCGACGGGCGCGCGCTCGACGACGAGGAGGCGGCCAACTTCTCCACCGCGCTGCTGCTGGCCGGCCACATCACCACGACCGTCCTGCTCGGCAACATCGTGCGCACCCTCGACGAGCACCCGGCCCACTGGGACGCCGCCGCCGAGGACCCCGGCCGGATCCCGGCGATCGTCGAGGAGGTCCTGCGCTACCGGCCGCCGTTCCCGCAGATGCAGCGCACGACGACCAAGGCCACCGAGGTCGCGGGCGTGCCCATCCCGGCCGACGTCATGGTCAACACCTGGGTGCTCTCGGCCAACCGCGACTCCGACGCCCACGACGACCCCGACCGGTTCGACCCGTCGCGCAAGTCCGGCGGCGCCGCGCAGCTCTCCTTCGGCCACGGCGTGCACTTCTGCCTCGGCGCGCCCCTGGCCCGGCTGGAGAACCGCGTGGCGCTGGAGGAGATCATCGCCCGGTTCGGGCGGCTCACCGTCGACCGCGACGACGAGCGCCTGCGCCACTTCGAACAGATCGTGCTCGGGACCCGTCACCTGCCGGTGCTGGCGGGCTCCTCGCCGAGGCAGTCGGCGTAGTCGGGCAGCATCCCTCGCCGCCTGGCGGTCTCCAGGTCCACGGCCACCGTGTCGCGGTCGGAGAGCACGACCTCCAGGTCCGCGGGCCACGGCAGACCCAGCGCGGGGTCGAACGGGTCGATCGCCTGCTCGTACTCGGCCACGTACGGCGTGCTGACCAGGTACGACATCAGGGTGTCGTCCTCAAGCGCGAGGAAGGCGTGCGCGGTGCCCCTGGGGAAGTAGACCGCCCGGAAGTGCTCGGTGTCCATCTCCACCGCGTCCCACTTCCCGAACGTCGGCGAGCCGACCCGGATGTCGACGATGACGTCGAGCGCCCGGCCGCGCGCGCAGTAGACGTACTTGCACTGCCCCGGCG；
Z為紅黴素碳黴糖甲基化酶EryG，具有如下的核苷酸序列
GGTGCTGTTGCCGTCCCTGCGCCCGGCGATCGAGGCCTACGAGAAGTTCTGCCGCAACCTCGGCGAAGACCCGGCCGAGGTGGGGCTCGCATGGGTGCTGTCCCGGCCCGGCATCGCCGGCGCCGTCATCGGCCCGCGAACCCCCGAGCAGCTCGACTCCGCGCTGAAGGCGTCCGCGATGACCCTGGACGAGCAGGCGCTGTCCGAACTGGACGAGATCTTCCCCGCGGTGGCCTCCGGCGGCGCGGCGCCGGAAGCCTGGTTGCAGTGAGCACAAGAGGAACCGAGAAAGGATACGGCTGGTGAGCGTGAAGCAGAAGTCAGCGTTGCAGGACCTGGTCGACTTCGCCAAGTGGCACGTGTGGACCAGGGTGCGGCCGTCCAGCCGTGCGCGCCTGGCCTACGAGCTGTTCGCCGACGACCACGAGGCCACGACCGAGGGCGCCTACATCAACCTCGGCTACTGGAAGCCCGGGTGCGCCGGCCTGGAGGAGGCCAACCAGGAGCTGGCGAACCAGCTCGCCGAGGCCGCGGGGATCAGCGAGGGCGACGAGGTGCTCGACGTCGGGTTCGGGCTCGGCGCGCAGGACTTCTTCTGGCTCGAGACGCGCAAGCCGGCCAGGATCGTCGGCGTCGACCTGACCCCGAGCCACGTCCGCATCGCCTCCGAGCGCGCGGAGCGCGAGAACGTGCAGGACCGCCTGCAGTTCAAGGAGGGCTCGGCGACCGACCTGCCCTTCGGCGCGGAGACCTTCGACCGCGTCACCTCCCTGGAGTCGGCCCTGCACTACGAGCCGCGGACCGACTTCTTCAAGGGCGCGTTCGAGGTGCTCAAGCCCGGAGGCGTGCTGGCCATCGGCGACATCATCCCGCTCGACCTGCGCGAGCCCGGTTCCGACGGACCGCCGAAGCTGGCGCCGCAGCGGTCGGGATCGCTGTCCGGCGGCATCCCGGTGGAGAACTGGGTGCCCCGCGAGACCTACGCCAAGCAGCTCCGCGAAGCGGGCTTCGTCGACGTCGAGGTGAAGTCGGTCCGCGACAACGTGATGGAGCCCTGGCTGGACTACTGGCTGCGCAAGCTGCAGGACGAGTCGTTCAAGAAGAGCGTGAGCAGGCTCTTCTACAGCCAGGTCAAGCGGTCGCTGACCAGCGACTCGGGCATGAAGGGCGAGCTGCCCGCGCTCGACTTCGTGATCGCCTCAGCCCGCAAGCCCGGCGCGTAGCAGGTCCCGGCGCACGGCACCGGCCACCTCGGTGACCTGTTCACCCAGGTAGAAGTGCCCGCCGGGGAAGGTCCTGGTCCGGCCGGGGATGACCGAGTGCTGCAACCAGCGCTCGGCGTCCCCGGTCGCGGTCAGCGGGTCGGCGTCGCCGCACAGCGCGGTGATGCCGGCCCGCAGCGGTGGTCCGTCCGCCCAGGCGTAGGAGCGCAGCACGCGGTAG；
其中m＝1～3，n＝1～5，k＝0～4。
2.一種如權利要求1或2所述的重組質粒，其特徵是所述的組合為(X)1-(Y)1或(X)1-(Y)1-(Z)1或(X)1-(Y)2-(Z)1或(X)1-(Y)1-(Z)1-(Y)1的結構。
3.一種如權利要求1或2所述的重組質粒，其特徵是所述的載體為pKC1139、pOJ260、pWHM3或pSET152及其類似的載體。
4.一種如權利要求1所述的重組質粒的構建方法，其特徵在於，通過下述(1)、(2)或(3)三種步驟分別獲得
(1)，以紅黴素生產菌株S.erythraea HL3168E3的基因組為模板，採用引物5』-AAA CTG CAG CAC CGC GGA AGT CTC GAC ACC-3』和5』-TTT AAGCTT CGC CGG GGC AGT GCA AGT ACG-3』克隆eryK基因的編碼序列，得到1.7kb的PCR產物，將其置於PermE*啟動子下，通過酶切位點克隆到載體中，得到含有(X)1-(Y)1-(Z)0結構的重組質粒；
(2)，以紅黴素生產菌株S.erythraea HL3168E3的基因組為模板，採用引物5』-AAA CTC GAG CAC CGC GGA AGT CTC GAC ACC-3』和5』-TTT ACTAGT GCT GCC CGA CTA CGC CGA CTG-3』克隆eryK基因的編碼序列，得到1.3kb的PCR產物，其中不包含eryK基因下遊自身含有的終止序列；同樣地，採用引物5』-TTA CCA TGG GGT GCT GTT GCC GTC CCT GCG-3』and 5』-TCG ACTAGT CTA CCG CGT GCT GCG CTC CTA-3』克隆eryG基因的編碼序列，得到1.5kb的PCR產物，將eryK-G的拷貝置於PermE*啟動子下，通過酶切位點克隆到載體中，得到含有(X)1-(Y)1-(Z)1結構的重組質粒；或
(3)，將上述(2)得到的eryK基因PCR產物和eryG基因PCR產物，通過酶切位點克隆到載體中，得到兩種不同順序拷貝的基因，eryK-K-G和eryK-G-K，分別置於PermE*啟動子下，再導入載體中，得到含有(X)1-(Y)2-(Z)1結構或含有(X)1-(Y)1-(Z)1-(Y)1結構的重組質粒。
5.一種如權利要求1或2所述的重組質粒用於紅黴素生產菌種的遺傳改造。
6.如權利要求5所述的重組質粒的用途，其特徵是所述的紅黴素產生菌含有如權利要求1所述的載體；或它的基因組中整合有額外的如權利要求1所述數目的羥基化酶，甲基化酶和紅黴素啟動子。
全文摘要
本發明公開了一種基因工程構建的重組質粒，以及該重組質粒的構建方法和該質粒在紅黴素產生菌遺傳改造上的應用。重組質粒由載體和在多克隆位點加入一個含有紅黴素啟動子，大環骨架上碳12位羥基化酶，碳黴糖甲基化酶組合的片段組成，其中載體為大腸桿菌和鏈黴菌穿梭質粒，可以為pKC1139、pOJ260、pWHM3或pSET152等類似的載體；所述的組合，主要特徵是含有紅黴素啟動子(ErmE*)為m個，羥基化酶(EryK)為n個，甲基化酶(EryG)為k個，其中，m＝1～3，n＝1～5，k＝0～4，它們可以任意搭配組合。使用這樣的重組質粒對紅黴素產生菌進行遺傳改造，可以明顯改善組分，甚至獲得只產生有效單一組分的生產菌種。
文檔編號C12N15/80GK101285073SQ20071017370
公開日2008年10月15日 申請日期2007年12月28日 優先權日2007年12月28日
發明者文 劉, 張嗣良, 雲 陳, 瑋 鄧 申請人:中國科學院上海有機化學研究所, 華東理工大學