新的單克隆抗體和線蟲幼蟲抗原的製作方法

2023-05-03 04:59:31 9

專利名稱：新的單克隆抗體和線蟲幼蟲抗原的製作方法
技術領域：
本發明涉及單克隆抗體及線蟲幼蟲抗原。具體地，本發明涉及對寄生線蟲的第三階段幼蟲(L3)的表面抗原具有特異性的單克隆抗體。
背景技術：
線蟲類動物寄生蟲，如羊和牛寄生蟲的群襲現象在農業上具有重要的經濟學意義，通常用驅蟲藥給藥治療線蟲感染。
然而，常規驅蟲藥的主要的缺點是線蟲對大量的驅蟲藥產生抗性變得越來越廣泛，因而產生嚴重困憂(Waller，1997；Sangsteret al，1999；Van Wyk et al，1999)。
已有許多假設試圖解釋線蟲被驅除出免疫羊的腸道的機理(Rothwell 1989)。有證據表明速髮型超過敏反應因素與其有關，在該反應中，抗原刺激IgE敏感性黏膜柱細胞而使可能影響線蟲存活的化合物在粘液積累(Miller 1996；Emery等1997)。粘液的抗線蟲屬性與化學介質(Douch等1983；Jones等1990)及抗體(Lee Ogilvie 1981；Miller 1987；Carlisle等1991)的存在有關。最近本發明人發現通過多次截短型感染使羊體免疫後，獲取其腸道粘液與幼蟲混合，後注入初次接受免疫的羊的十二指腸，能夠改變幼蟲形成的模式(Harrison等1999)。從對蛇形毛園線蟲(Trichostrongyluscolubriforriis)具免疫力的羊的小腸中收集粘液，發現其具有抗線蟲活性，將其與幼蟲通過十二指腸導管注入初次接受免疫的羊後，其使線蟲在體外結塊，從而顯著減少了羊體內幼蟲形成的數目。
免疫印跡表明免疫粘液內含有IgG和IgA抗體，它們對分子量約為35kDa的抗原具有識別優勢。從培養在免疫粘液中的幼蟲的表面洗脫得到的抗體也與線蟲勻漿物印跡上的35kDa的抗原反應。免疫螢光檢測法和免疫金電鏡顯微實驗表明該35kDa的抗原存在於L3的上表皮，在向L4蛻變過程中減少。在蟲卵、L1、L2、L4及成蟲上不存在該抗原，僅僅在感染前及感染後5天內的L3提取物中發現。該結果表明抗體與幼蟲表面結合防止了幼蟲在其偏好部位生長，並將它們清除出腸道。用部分純化的35kDa的抗原免疫羊，蛇形毛園線蟲感染後的蟲卵數目顯著下降，這表明該抗原在疫苗方面的潛在用途。
製備稱為PAB-1的單克隆抗體(PAB-1單抗，MAb PAB-1)來對抗幼蟲表面抗原。PAB-1單抗與羊粘液抗體均識別35kDa的蛇形毛圓線蟲幼蟲的抗原，且與捻轉血矛線蟲(Haemonchuscontortus)和環頸奧斯他胃蟲(Ostertagia circumcincta)寄生性線蟲的L3提取物印跡上的一種具有相似分子量的抗原及古巴毛樣線蟲(Cooperia curticei)和匙狀細頸毛樣線蟲(Nematodirusspathiger)的L3提取物的抗原印跡上的22kDa的抗原發生交叉反應。這表明其他線蟲種屬上也存在具有免疫潛力的通用表面抗原，該抗原被PAB-1單抗識別。35kDa的幼蟲抗原及相關分子可能是宿主免疫應答的新靶標，因此可在抗線蟲感染的疫苗或在其他免疫療法中使用。
PAB-1單克隆抗體在標準親和色譜法中可用來純化表面抗原。用連結於諸如瓊脂糖、瓊脂糖凝膠(sepharose)等固相支持物上的PAB-1單克隆抗體與L3粗提物中的表面抗原結合，使用低pH值的緩衝液可將表面抗原從抗體基質上洗脫出來，經SDSPAGE電泳法顯示得到的表面抗原基本已提純。通過此法提純的表面抗原以羊的免疫粘液抗體印跡法檢測，並可用檢測糖類的方法進行染色。
已知35kDa的幼蟲抗原及其相關大分子具有糖優勢結構，該抗原對蛋白激酶K消化具有抗性的原因是因為其在膠中不被敏感的蛋白染色劑染色；而被糖類染色劑染色，且能被諸如生物素-醯肼等的糖類標記試劑標記。
因此，PAB-1單抗可能可用於鑑別及分離表面抗原以研製抗線蟲感染的疫苗或其他免疫療法。
感染了蛇形毛圓線蟲的羊的血清及腸道粘液中含有能識別35kDa幼蟲抗原及其相關分子的抗體，因此，當存在針對幼蟲抗原的抗體時，表明感染了寄生蟲；所以，PAB-1單抗可能可用於鑑定動物感染的有效工具。
包括任何專利或專利申請在內的所有本說明書引用的參考文獻均在此被引為參考，這並不是認可任何參考文獻都構成現有技術。關於參考文獻提及的其作者的主張的討論，申請人保留對所引用文獻的準確性及妥當性提出質疑的權利。需要清楚解釋的是，雖然一些現有技術的文獻在此被涉及，但是並不認為這些文獻在紐西蘭或任何其他國家已經成為該領域的公知知識。
發明概述本發明的第一方面提供了分離的單克隆抗體mAb PAB-1，該抗體已於2002年1月24日在ATCC保藏，登記號為PTA-4005，其能與線蟲L3表面抗原結合。
本發明的第二方面提供了如上所述的分離的單克隆抗體，其中該抗體與源自蛇形毛圓線蟲L3的抗原結合，且還原條件下該抗原在SDS PAGE膠中約35kDa處出現條帶。
本發明的第三方面提供了如上所述的分離的單克隆抗體，其與L3的表面抗原結合，該表面抗原選自a)古巴毛樣線蟲(C.curticei)上的表面抗原，其在還原條件下在SDS PAGE凝膠中約46kDa處和約22kDa處出現條帶；
b)匙狀細頸毛樣線蟲(N.spathiger)上的表面抗原，其在還原條件下在SDS PAGE凝膠中約22kDa處出現條帶；c)捻轉血矛線蟲(H.contortus)上的表面抗原，其在還原條件下在SDS PAGE凝膠中約35kDa處和約22kDa處出現條帶；及d)環頸奧斯他胃蟲(O.circumcincta)上的表面抗原，其在還原條件下在SDS PAGE凝膠中約35-39kDa處出現條帶；e)T.axei或T.vitrinus上的表面抗原，其在還原條件下在SDSPAGE凝膠中約35kDa處出現條帶；f)結節線蟲(O.ostertagi)上的表面抗原，其在還原條件下在SDS PAGE凝膠中約30-45kDa處出現條帶；g)C.oncophera上的表面抗原，其在還原條件下在SDS PAGE凝膠中約20kDa處和約45kDa處出現條帶；h)巴西奴卡菌(N.brasiliensis)上的表面抗原，其在還原條件下在SDS PAGE凝膠中約9kDa處和約12kDa處出現條帶；i)D.eckerti上的表面抗原，其在還原條件下在SDS PAGE凝膠中約30kDa處出現條帶；本發明的第四方面提供了如上所述的分離的單克隆抗體，其中當該抗體與固體支持物連結時，其能用於通過免疫親和色譜法純化表面抗原。
本發明的第五方面提供了源自線蟲L3的分離的糖表面抗原，其中該抗原能與的單克隆抗體mAb PAB1結合，該單克隆抗體已於2002年1月24日在ATCC保藏，登記號為PTA-4005。
最優選的所述抗原在1M NaOH中對沸騰有抗性。
本發明的第六方面提供了分離的與上述抗原基本上一致的抗原，其中該抗原在還原條件下SDS PAGE凝膠中基本上在20-35kDa間出現條帶；或基本上在9kDa和12kDa處出現條帶。
本發明的第七方面提供了分離的與上述抗原基本上一致的抗原，其中該抗原源自蛇形毛圓線蟲L3。
本發明的第八方面提供了一種分離的與上述抗原基本上一致的抗原，其中該抗原源自線蟲L3，該線蟲L3分離自古巴毛樣線蟲、匙狀細頸毛樣線蟲、捻轉血矛線蟲、環頸奧斯他胃蟲、T.axei、T.vitrinus、結節線蟲、C.oncophera、巴西奴卡菌和D.eckerti。
本發明的第九方面提供了含有與上述抗原基本上一致的抗原和藥學上或獸學上可接受的載體或稀釋劑的組合物。
本發明的第十方面提供了與上述抗原基本上一致的抗原的用途，該用途是生產用於預防、治療線蟲感染或降低線蟲感染易感性的組合物。
本發明的第十一方面提供了與上述組合物基本上一致的組合物用於受線蟲感染的易感羊體以預防、治療線蟲感染或降低其感染易感性的用途，這些線蟲選自蛇形毛園線蟲、古巴毛樣線蟲、匙狀細頸毛樣線蟲、捻轉血矛線蟲、環頸奧斯他胃蟲、T.axei、T.vitrinus、結節線蟲、C.oncophera、巴西奴卡菌和D.eckerti。
本發明的第十二方面提供了與上述組合物基本上一致的組合物，該組合物用於除羊之外的易感動物以預防、治療線蟲感染或降低線蟲感染易感性；其中這些其它種類的線蟲也具有可通過與上述單克隆抗體PAB-1反應來檢測的幼蟲表面抗原。
優選地，這些其它種類動物可是任何易感於線蟲感染的如前所述的動物，還可以是小鼠、大鼠、豚鼠、兔、山羊、綿羊、馬、豬、犬、貓、雞、牛或鹿等。
本發明的第十三方面提供了與上述組合物基本上一致的組合物，其中該組合物還含有至少一種佐劑或細胞因子。
本發明的第十四方面提供了診斷易感動物線蟲感染的方法，該方法包含如下步驟a)自動物上獲得血液樣品；
b)通過合適的檢驗方法，分析血樣是否存在抗本發明第三方面所述抗原的抗體。
優選地，所述的檢驗方法可是ELISA或western印跡法，但這並不能看作是對可用的其它方法的限制。
本發明的第十五方面提供了與上述抗體基本相同的分離的抗體，其中該抗體來源於動物的胃腸道粘液，這些動物用選自下列的線蟲的截短型感染(truncated infection)免疫蛇形毛園線蟲、古巴毛樣線蟲、匙狀細頸毛樣線蟲、捻轉血矛線蟲、環頸奧斯他胃蟲、T.axei、T.vitrinus、結節線蟲、C.oncophera、巴西奴卡菌和D.eckerti。
本發明的第十六方面提供了通過用本發明的組合物給藥來預防或治療動物線蟲感染的方法。
本發明的第十七方面提供了本發明的抗原用於在羊或其他易感動物的腸道粘液內引起抗體反應以預防、治療線蟲感染或降低線蟲感染易感性的用途。
本發明的第十八方面提供與上述單克隆抗體基本一致的抗體用於檢測羊體內線蟲感染的用途。
術語「分離的」的意思是指本發明的單克隆抗體或糖已經從原始環境中移離，並與提供該抗體或糖的天然系統中的所有或部分共存物質分離。
術語「L3」指的是線蟲生活周期中特定的幼蟲發育階段。
除非在上下文中另有指定，35kDa抗原一般指具有基本相同分子量的蛇形毛圓線蟲抗原。術語「易感動物」是指容易感染線蟲，如蛇形毛園線蟲、古巴毛樣線蟲、匙狀細頸毛樣線蟲、捻轉血矛線蟲、環頸奧斯他胃蟲、T.axei、T.vitrinus、結節線蟲、C.oncophera、巴西奴卡菌和D.eckerti的羊，或指容易感染那些具有用所述PAB-1單抗檢測出的抗原的線蟲的其他動物。
發明的詳細說明本發明的單克隆抗體是一種能夠識別寄生性線蟲L3上的糖類表面抗原的單克隆抗體。本發明人發現，該單克隆抗體與用蛇形毛圓線蟲免疫的羊的腸道粘液中存在的抗幼蟲抗體具有相同的特異性。能產生單克隆抗體mAb PAB-1的雜交瘤於2002年1月24日在ATCC保藏，相應的登記號為PTA-4005。
下文用通用的非限制性術語對本發明的抗體鑑定步驟進行了簡要描述。
容易遭受線蟲感染的羊自出生至4月齡在無線蟲環境中飼養成長，四月齡時一些既定數目的動物被施以一系列的蛇形毛圓線蟲截短型感染致免疫。其它的免疫羊繼續在無線蟲條件下飼養成長。優選地，所用的羊在一段時間內被進行3次截短型感染，每次感染在經歷一段既定的時限後停止。優選地，這一既定的時限是14天，再次感染的時間約是前次結束後7天，但是這些時限的數值不應該視為限制。
最後一次感染結束後，屠殺羊，取其小腸內的粘液。這基本上按照Harrison et al，1999的描述進行，但是該方法不應視為限制，其理由是也可以應用其他的一些方法。未感染的未感染羊的粘液也如上法取得。
一旦獲得粘液樣品，分析免疫的和未感染的羊的粘液未感染羊樣品以觀察蛋白差異。例如用SDS PAGE凝膠及Coomassie藍、銀染分析。
然後特徵鑑定粘液抗體，優選地通過免疫印跡均勻混合抗原和碳針檢測免疫的及未感染羊的粘液樣品進行檢測。檢測抗體的結合時，可以通過與商業上可用的抗羊免疫球蛋白產生的並與酶結合的抗血清反應來進行。優選地，結合的該抗體可以通過RAS/IgG-HRP法檢測。
可以通過下法製備L3均勻混合物在適合的清潔劑或變性劑的存在或不存在的情況下，藉助機械手段或化學手段將任何一種在此列出的寄生性線蟲的出鞘的(exshealthed)L3裂解；隨後以離心和/或過濾法使提取物澄清。
最優選地，可以通過裂解冷凍於液氮的蛇形毛圓線蟲的出鞘的L3來製備均勻混合物，即用研缽及乳槌將冷凍的L3研磨直至裂解。隨後將幼蟲的組分提取入中性緩衝液，如含有1～2％諸如CHAPS、去氧膽酸鈉、脲或SDS等助溶劑的、pH7.5的50mM的Tris-HCl緩衝液。以100,000×g離心提取物1小時，或用孔徑逐漸變小，如5.0μM至0.2μM的系列濾膜過濾來使其澄清。
製備單克隆抗體mAb PAB的方法可以是任何合適方法，如Kohler及Milstein(1975)所述的方法。
例如，可以從聚丙烯醯胺凝膠片上切下35kDa片段，用同體積的不完全油佐劑浸泡並混合，然後給藥到需要免疫的動物的腹腔、皮下或腳墊等位置，所述動物如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、山羊、綿羊、馬、豬、犬、貓、雞、牛或鹿等。這些動物中優選小鼠。
諸如脾細胞、淋巴細胞、外周血細胞等的抗體產生細胞，可以從免疫動物上收集，與骨髓瘤細胞(一種腫瘤細胞株)融合後形成雜交瘤。優選脾細胞作為抗體產生細胞。
細胞融合用的骨髓瘤細胞優選那些與免疫動物異源的細胞系，但是各種動物的細胞系均可使用。
優選地，NS-1細胞可以用作骨髓瘤細胞，但是這不應該視為對本發明範圍的限制。
雖然本發明所述的單克隆抗體一般是一種通過雜交瘤產生的抗體，但是通過諸如血漿酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等不具降解抗原結合位點(Fab)能力的蛋白水解酶與抗體相互作用獲得的抗體片段，如Fab，F(ab′)2，Facb等，或通過分子克隆技術生產的抗體片段均包括在本發明的單克隆抗體之內，條件是只要它們具備本發明的單克隆抗體的性質。
本發明的糖類表面抗原存在於蛇形毛園線蟲、古巴毛樣線蟲、匙狀細頸毛樣線蟲、捻轉血矛線蟲、環頸奧斯他胃蟲、T.axei、T.vitrinus、結節線蟲、C.oncophera、巴西奴卡菌和D.eckerti的L3表面。
下文用通用的非限制性術語對本發明的抗體鑑定步驟進行了簡要描述。
本發明的糖類表面抗原可以從此處列出的線蟲L3提取物中分離出。優選地，糖類抗原從如上所述的蛇形毛圓線蟲L3的提取物中分離。PAB-1單克隆抗體先與固體支持介質相連結，優選地與蛋白A-瓊脂糖或蛋白G-並共價連結以防止抗體從凝膠上脫落。
隨後將凝膠裝塞入色譜柱，採用L3提取物。用中性緩衝液衝洗後，優選用含有0.05％Tween 20的PBS衝洗以防止非特異性結合後，用高pH值或低pH值或高鹽水平的洗脫緩衝液使結合的糖類抗原從柱上洗脫，優選地，用pH2.5-2.8的甘油-鹽酸緩衝液洗脫抗原。洗脫後糖類抗原的pH值可以用添加1M Tris的方法提高到中性，隨後電泳法和免疫羊粘液抗體的印跡法進行進一步分析鑑定該糖類抗原。用檢測糖類的銀染法染色和結合糖類的生物素-醯肼試劑進行印跡，可以檢測糖類抗原的性質。
本領域的技術人員能夠理解其他檢測糖類的方法也可以使用，這些方法包括但不限於凝集素結合、HPLC、TLC、螢光基團輔助的糖電泳、MS及NMR。
製備藥劑組合物的方法及藥學載體是本領域內公知的，正如教科書Remington′s Pharmaceutical Sciences，19th Edition，MackPublishing Company，Easton，Pennsylvania，USA)所述。
本發明所述物質、疫苗或組合物可以用任何合適的途徑給藥，本領域的技術人員能夠容易地根據治療的情況確定最合適的給藥途徑及劑量。劑量由相關的內科醫生或獸醫審慎判斷後決定，取決於治療情況的狀態和性質、治療對象的的年齡、總體健康狀況、給藥途徑及給藥的前期治療。
所述的載體或稀釋劑、及其他賦形劑取決於給藥途徑，本領域的普通技術人員根據個案能夠容易地確定最合適的配方。
為了實現本說明書的目的，很明顯「包含」一詞的意思是「包括但不局限於」，與「含有」的意思相同。
附圖的簡要說明通過實施例並參考如下附圖，下文將對本發明的其它方面座更清除的說明。


圖1顯示了在將幼蟲與不同量的未感染羊粘液或免疫羊粘液共孵育後在未感染的羊中的幼蟲數量；圖2顯示了顯示了在將幼蟲與未感染羊粘液或免疫羊粘液共孵育不同時間後在未感染的羊中的幼蟲數量；圖3顯示了用未感染的或免疫的粘液中的L3混合物灌輸未感染的受體羊後未感染羊的最近部分和最遠部分的幼蟲數量；圖4顯示了在免疫不同時間後免疫粘液的抗幼蟲活性；圖5顯示了免疫的和未感染的粘液的SDS PAGE分析結果；圖6顯示了免疫的和未感染的粘液的植物凝集素印跡結果，AUEA-1(α-L-果糖) BJAC(α-gal-Me-吡喃糖苷)CWGA(N-乙醯氨基葡萄糖)DLL(甘露糖，葡萄糖)；圖7顯示了免疫的和未感染的粘液的植物凝集素印跡結果，APNA(β-半乳糖-N-乙醯氨基半乳糖)BEcorA(β-半乳糖-N-乙醯氨基半乳糖)
CSBA(N-乙醯氨基半乳糖)DECA(β-半乳糖-N-乙醯氨基半乳糖)；圖8顯示了免疫的和未感染的粘液的植物凝集素印跡結果，ASNA(唾液酸)B用RAS/IgG-HRP免疫印跡探查圖9顯示了蛇形毛園線蟲L3抗原的免疫印跡結果，其中的L3抗原用免疫羊(第1、5、10、11、12和19道)或未感染羊(第13-18道)的腸粘液、免疫粘液的100 000×g離心上清(第3道)、從蛋白G-瓊脂糖純化出的免疫粘液上清(第4和7道)、從出鞘的蛇形毛園線蟲L3洗脫出的抗體(第6和20道)、來自免疫羊的硫酸胺沉澱的腸道內腔液體的抗體(第8和9道)探測。第2道顯示了用膠體金著色的蛇形毛園線蟲L3蛋白，用RAS/IgG-HRP檢測IgG抗體(第1-18道)，用MAS/IgA，接著用RAS/IgG-HRP檢測IgA抗體(第19和20道)；圖10顯示了用未感染的或免疫的粘液探查的蛇形毛園線蟲L3抗原的免疫印跡結果，抗原帶與未感染的粘液或免疫的粘液反應，然後與RAS/IgG、抗IgG1的mAB、抗IgG2的mAB、抗IgA的mAB、抗IgM的mAB反應；圖11顯示了蛇形毛園線蟲L3抗原，古巴毛樣線蟲L3抗原和匙狀細頸毛樣線蟲L3抗原的免疫印跡結果；圖12顯示了捻轉血矛線蟲、環頸奧斯他胃蟲、匙狀細頸毛樣線蟲、古巴毛樣線蟲和蛇形毛園線蟲的L3的抽提物的免疫印跡分析的結果；圖13顯示了蛇形毛園線蟲L3抗原的腸粘液IgG和IgA抗體滴度與抗感染保護作用的關係；圖14顯示了腸粘液中的IgG和IgA抗體滴度隨時間的推移逐漸降低；
圖15顯示了與免疫的或未感染的粘液反應的出鞘的蛇形毛園線蟲L3(上圖)，並顯示了在感染並與免疫粘液反應後第5天收集的蛇形毛園線蟲的幼蟲(下圖)；圖16顯示了在與未感染的(A)或免疫的(B)粘液反應後出鞘的蛇形毛園線蟲L3的電子顯微照片。圖C-F顯示了在感染並與免疫的粘液反應後第2、3、4或5天收集的蛇形毛園線蟲的幼蟲；圖17顯示了對蛇形毛園線蟲卵漸近線SDS PAGE和免疫印跡分析的結果。圖A、C和D與免疫粘液反應，圖B是銀染色蛋白；圖18顯示了感染前和感染後不同時間的蛇形毛園線蟲L3的SDS PAGE和免疫印跡分析結果；圖19顯示了與免疫粘液或單克隆抗體PAB-1反應的蛇形毛園線蟲L3抽提物和蛋白酶K消化的L3抽提物的免疫印跡分析結果；圖20顯示了來自與單克隆抗體PAB-1反應的5個線蟲種的L3抗原抽提物和蛋白酶K消化的L3抽提物的印跡分析結果；圖21顯示了與對照的單克隆抗體(左和中間的圖)或與單克隆抗體PAB-1(右圖)反應的出鞘蛇形毛園線蟲L3的表面螢光；圖22顯示了Tc幼蟲表面抗原的分析結果，該抗原用單克隆抗體PAB-1進行免疫親和色譜來純化；圖23顯示了加熱、氧化、消化或用有機溶劑沉澱後的蛇形毛園線蟲L3抽提物的免疫印跡分析結果；圖24顯示了用蛋白酶或脂酶消化後蛇形毛園線蟲L3抽提物的免疫分析結果；圖25顯示了用蛋白酶消化後蛇形毛園線蟲L3抽提物的免疫分析結果；
圖26顯示了用糖苷酶消化後蛇形毛園線蟲L3抽提物的免疫分析結果；圖27顯示了顯示了鹼分解後蛇形毛園線蟲L3抽提物的免疫分析結果；圖28顯示了加熱或鹼或酸分解後蛇形毛園線蟲L3抽提物的免疫印跡分析結果；圖29顯示了加熱或鹼或酸分解後蛇形毛園線蟲L3抽提物的免疫分析結果；圖30顯示了加熱或鹼分解或蛋白酶消化後蛇形毛園線蟲L3抽提物的免疫分析結果；圖31顯示了在原始條件下或在脲或去氧膽酸鈉存在的條件下電泳後蛇形毛園線蟲L3抽提物的免疫印跡分析和蛋白染色結果；圖32顯示了在二維電泳後蛇形毛園線蟲L3抽提物的免疫印跡分析和蛋白染色結果；圖33顯示了在6隻其它線蟲的L3抽提物中存在糖著色分子；圖34顯示了蛇形毛園線蟲L3抽提物(L3)和在非變性條件下(無去汙劑或還原劑)電泳純化的糖基幼蟲抗原(C)的凝膠電泳(8％PAGE)和免疫印跡分析結果。
實現發明的最佳方式1.材料與方法1.1截短型感染對羊的免疫所有的羊的實驗均按照Wallaceville動物倫理委員會的規定進行。Romney羊自出生開始就在無線蟲的條件下成長，圈養並飼以市售羊飼料，乾草及水，自由進食。羊在進行免疫感染時至少4月齡。以40000隻蛇形毛圓線蟲L3截短型感染免疫羊，至少進行三次。每次感染均在14天後通過口腔灌餵奧芬達唑(Systamex，Schering Plough Ltd.，4.5mg kg-1)中止，羊在灌餵7天後重複進行感染操作。在一些實驗中，羊還被給予第四次的感染(加強劑量)，此時不用灌餵給藥法中止，而是在加強給藥2-3天後將羊屠殺。
1.2.採樣羊以槍殺及放血法被屠殺。羊的小腸被打結成5米的片段，每個片段用4×150毫升的生理鹽水衝洗以收集幼蟲。為了供生化分析及體內注射用，收集小腸前6米處的粘液，以哈裡森(Harrison等1999)所述的方法改良後處理，改良如下述。在輕柔地用100毫升生理鹽水淋洗去除腸的內容物後，在4℃放置小腸2小時，然後以拇指和食指用力擠壓小腸使流出粘液，隨後以2×5毫升的生理鹽水洗滌。收集粘液和洗液，並以哈裡森(Harrison等1999)所述方法處理，貯存在-20℃。
對於進行了4次截短型感染的羊，在最後一次免疫後的第3，16，35天收集粘液的活組織檢查樣本。在手術時，定位十二指腸並用手術鉗輕柔夾取分離一段5釐米的片段。應用具鈍端的18規格的針頭注入3毫升生理鹽水。液體前後搖蕩10次使粘液與生理鹽水混合後，取樣2-3毫升。縫合切口，使羊逐漸康復。
1.3不同方法處理對粘液體外活性的影響通過幼蟲結塊實驗評價粘液結合幼蟲的能力，將2000隻出鞘的L3放入一個置于振動平臺的Eppendorf管中，37℃下與0.4毫升的粘液共孵育。四小時後，檢驗樣本並估算幼蟲結塊的程度，以與未感染的粘液或生理鹽水共孵育的L3為對照，與對照比較。
免疫粘液以多種不同的方法處理，然後分析其幼蟲結塊的效力。等分取1毫升免疫粘液IP5置於4℃生理鹽水中透析24小時，在10000×g、10000×g或100000×g下離心，60℃加熱或100℃加熱5分鐘，在10mM的DTT中還原或烷基化1小時，然後在冰上與20mM碘乙醯胺反應30分鐘，再以pH7.4的TBS水解過夜，以除去多餘的鹽分。以胃蛋白酶處理時，粘液以1MHCl調節pH至4.5，在3毫升粘液中加入含3毫克胃蛋白酶的pH4.5的0.1M乙酸緩衝液，于振動平臺上37℃共孵育20小時，加入Tris至濃度為2M令反應停止。以蛋白水解酶處理時，於每毫升粘液中加入溶於pH7.5的0.1M Tris的1毫克鏈蛋白酶，于振動平臺上37℃共孵育20小時，反應通過加入蛋白水解酶抑制劑而停止。粘液以脂肪酶處理時，每毫升粘液用1毫克的脂肪酶處理，於pH7.2的PBS中37℃下孵育20小時，然後冷凍貯存。粘液氧化處理時，以醋酸調節pH值至4.5，加入高碘酸鹽於pH4.5的50mM醋酸鈉緩衝液中至120mM，並於室溫攪拌下避光孵育2小時，加入硼氫化鈉至50mM，攪拌下孵育1小時。超濾粘液時，將5毫升免疫粘液IP5稀釋至250毫升的pH7.2的PBS中，然後在Filtron 100000mw的膜上濃縮至5毫升，隨後將濾液在10000mw的膜上濃縮至5毫升，然後將濾液在3000mw的膜上濃縮至5毫升。凍幹低mw膜的濾液，重溶於5毫升的蒸餾水中，置入1000mw管中蒸餾水透析。
通過上述步驟處理後，冷凍儲存粘液樣品直至測定。
1.4體內粘液實驗40000隻出鞘的L3與2.5-10ml未感染羊體積的免疫羊或未感染羊的粘液共孵育24小時，然後通過一個特別的外科植入導管(Harrison等.1999)注入到未經線蟲感染的羊的十二指腸。一周後殺死羊，對每5米小腸片段內的生長的線蟲的數目進行計數。
40000隻出鞘的L3於37℃下與10ml體積的免疫羊或未感染羊的粘液，或與經100000×g離心後的2×10ml體積的粘液上清共孵育4小時。未感染羊孵育後取一等分的未感染羊及免疫羊的上清在200×g離心3分鐘以沉澱幼蟲。立即去除上清，以10ml生理鹽水清洗L3，如上法離心，去除上清，將L3在10ml生理鹽水重混懸。每10ml未感染羊等量的液體通過十二指腸管注入未感染羊腸道。一周後，殺死羊，計幼蟲數目。
1.5粘液生化分析以SDS-PAGE法和Coomassie藍染未感染羊或銀染染色法分析免疫羊組和未感染羊組樣品的蛋白差異。以凝集素印跡法檢查糖基化的差異，其中凝集素以生物素標記，以抗生蛋白鏈菌素-過氧化物酶檢測。粘液中IgG的存在與否通過RAS/IgG-HRP印跡法顯示。
1.6粘液抗體的特徵鑑定對免疫羊及未感染羊的樣品進行L3均勻混合抗原的免疫印跡法探查。抗體的結合通過對羊的IgG1，IgG2，IgA，及IgM的RAS/IgG-HRP或mAb檢測及隨後的GAM/Ig-HRP法進行測定。
出鞘的L3與粘液上清在37℃下孵育4小時，用45％硫酸銨從粘液中沉澱抗體，或用蛋白G從粘液中純化抗體。孵育後幼蟲用TBS-Tw清洗3次，通過在pH2.4的0.1M甘油-鹽酸緩衝液中孵育5分鐘洗脫全部結合態抗體。洗脫液以1M tris中和，用於探查Tc，Ns，Cc中的L3抗原的印跡。
體積為500毫升的免疫羊腸道內容物用45％硫酸銨處理以回收抗體。在透析後將抗體用於探查L3抗原，從蛋白G-Sepharose上洗脫的粘液上清或粘液抗體與幼蟲共孵育2小時，用TBS-Tw清洗3次後，與FITC-RAS/IgG反應。清洗後用螢光顯微法檢查幼蟲。
幼蟲在羊經感染後的不同時間收集，用上述免疫螢光及免疫印跡法和免疫金電鏡檢查法進行分析。將幼蟲固定在BGPA固定劑(90℃的含1％戊二醛及15％飽和苦味酸的0.1M磷酸緩衝液)中。埋入部分以蛋白G純化的粘液抗體進行染色，隨後用金標記抗羊抗體。
用於體內感染實驗的粘液樣本的抗體滴度以EIA法估算。微滴度板以Tc L3抗原包被，並與粘液稀釋液反應。經清洗後，結合態抗體通過對羊的IgA的RAS/IgG-HRP或mAb檢測及隨後的GAM/Ig-HRP法進行測定。
1.7單克隆抗體PAB-1的製備小鼠以含有Tc幼蟲表面抗原的多聚醯胺凝膠膠片進行免疫，該抗原在膠中的位置通過印跡相鄰泳道和檢測所述的粘液抗體來確定。浸泡含有抗原的凝膠膠片，將其與等量的不完全油佐劑混合，並注射入小鼠，共注射2次，每次相隔兩周。十天後取受試血液，篩選Tc L3抗原的粗產品，並對表面抗原進行部分純化。採用製備單抗的標準方法將陽性反應最強的小鼠的脾細胞與NS-1細胞融合，使用ELISA及印跡法進行初級和次級篩選以證實特異性。製備出的大量mAb PAB-1培養物，以等分在-20℃保存。
用單克隆抗體PAB-1探查幼蟲抗原的印跡，用RAM/IgG-HRP檢測結合態抗體。在90℃加熱出鞘的幼蟲20分鐘使其固定，與PAB-1反應，以TBS-Tw全面清洗，與RAM/IgG-FITC反應，並在紫外光下檢驗。針對非相關蛋白(羊細胞因子)的且具有相同PAB-1亞型的單克隆抗體用作陰性對照。
1.8幼蟲抗原的免疫親和純化單克隆抗體與蛋白A-瓊脂糖反應從而使該抗體結合，在PBS清洗去除未結合抗體之後，結合態抗體通過與交聯劑DSS(disuccinimidyl suberate)反應而永久地固定在蛋白A上。再次清洗後，L3提取物流過用含有0.05％Tween 20的PBS液全面清洗過的PAB-1-蛋白A-瓊脂糖柱，以pH2.5的0.2M甘油-鹽酸液洗脫全部的結合抗原。洗脫液以1M Tris中和，在pH8.0的5mMTris中透析，在Speedvac濃縮器中濃縮。抗體柱以PBS全面清洗重平衡。
從柱上洗脫的抗原樣本以SDS PAGE法及印跡法分析(圖23)。凝膠中的糖類以改良銀染法檢測(Kittelberger等，1993)；印跡上的糖類以生物素-醯肼反應法檢測(Bouchez-Mahiout等，1999)。
1.9幼蟲抗原的特徵鑑定將出鞘的Tc L3以液氮冷凍，以研缽及缽槌磨碎，蛋白質以2％Chaps+2％Tween 20、1％脫氧膽酸鈉、2％SDS，或9M脲溶解提取。提取物在10000g離心，上清在-20℃下貯存。蟲卵、L1、L2、成蟲線蟲直接溶解於SDS PAGE樣品緩衝液(含有2％SDS，20mM DTT的pH6.8的50mM Tris-HCl)中。將SDS抗原提取物用於電泳法及印跡法研究，將Chaps及脲提取物用於二維電泳，脲提取物在pH7.4的50mM tris-HCl中透析2天後，去除脲，隨後進行化學或酶學處理。抗原經適當方法溶解後，也僅在緩衝液，即0.5％DOC或6M urea中進行電泳。
在Tc L3脲提取物的二維電泳分析中，在以IPGphor(Pharmacia)固定於pI3-10長條的IEF上進行，隨後行SDS PAGE電泳。蛋白質或以Coomassie藍染/銀染，或與粘液抗體印跡發生反應來檢測抗原。Tc L3脲溶解抗原以上述方法透析，通過加入等體積的10％TCA、10倍體積的冷凍丙酮、9倍體積的氯仿∶甲醇(2∶1)或9倍體積的己烷∶異丙醇(3∶2)來使其沉澱。漩渦樣品並振動10分鐘，隨後在10000g離心10分鐘，並應用免疫印跡法分析離心出的沉澱，通過化學法及酶法降解分析糖。抗原以20mM的高碘酸在37℃處理24小時，或在60℃以1M NaOH及8MNaBH4處理18小時。樣品在電泳之前進行透析。抗原在100℃下以肼處理7和14天，或在4℃下以三氟乙酸處理4和16小時，隨後化合物用一個Speedvac離心機揮發，剩餘的抗原重溶解在SDS PAGE樣品緩衝液中。將各種酶溶解於生產商推薦的緩衝液中，並在37℃下與抗原溫浴22小時以進行酶消化。所用的酶是N-糖苷酶F，胰蛋白酶，胃蛋白酶，木瓜蛋白酶，鏈黴蛋白酶，蛋白水解酶K，枯草桿菌蛋白酶，脂肪酶，溶菌酶，彈性蛋白酶，膠原蛋白酶，磷酸肌醇-磷脂酶C，磷脂酶A2，磷脂酶D。顯色底物酪蛋白-試滷靈及彈性蛋白-剛果紅作為顯示蛋白酶及彈性蛋白酶的活性的對照。在一個實驗中，抗原在90℃下加熱變性20分鐘，隨後以胰蛋白酶或氫氧化鈉消化。在0.5％SDS、15mM DTT、50mM EDTA或2mM CaCl2存在或不存在的條件下於50℃下維持18小時來進行蛋白酶K的消化。捻轉血矛線蟲、環頸奧斯他胃蟲、古巴毛樣線蟲和匙狀細頸毛樣線蟲的幼蟲提取物也在相似的條件下用蛋白酶K處理。
1.10用35kDA的抗原進行的免疫用溶於含有Span 85、Tween 85及蓖麻油(比例是5.4∶4.6∶90)的菜油佐劑中的35kDa抗原，對5隻12月齡的Romney羊進行腹腔注射，如每2周一次，共3次。抗原從電泳分離出的TcL3凝膠膠片上得到。電泳後將每一個凝膠的條帶轉印到硝酸纖維素上與免疫粘液反應以檢測35kDa的抗原。用RAS/IgG-HRP進一步處理後，將印跡與凝膠的主要部分重新一一對應，切下與35kDA抗原位置相對應的凝膠片段。將取下的膠片置入裝有100mM pH7.8的trisHCl的透析管中，將透析管置入轉印槽中在50v下維持3小時以對凝膠中的抗原進行電洗脫。收集多個洗脫液，通過BCA實驗估計蛋白產出率約是0.2mg/ml。用Ultraturrax超聲勻漿器將抗原與同等量的菜油佐劑相混合。每一隻羊每次注射時接受0.2毫克左右的總蛋白量，但是糖類抗原的量未知。對照羊腹腔注射生理鹽水加佐劑。在第三次注射結束2周之後所有的羊通過口服感染40000隻Tc L3。在感染3-4周後獲取糞便中蟲卵計數資料。
2.結果2.1.體外實驗所有的粘液或經不同處理的粘液在體外引起幼蟲結塊的能力如表1所示，結果顯示透析或低速離心不影響免疫粘液使幼蟲結塊的能力，100000×g離心使幼蟲結塊的效應降低，但是洗滌劑Tx-100或CHAPS存在時例外。粘液在60℃加熱5分鐘後使幼蟲結塊的能力仍然存在，但是在100℃加熱後消失。粘液經蛋白酶消化或高碘酸氧化之後失去活性，但是脂肪酶消化無失活作用。這種幼蟲結塊作用與粘液中大分子量的成分相關。
2.2.體內實驗L3與遞增體積的粘液共孵育後使未感染受體羊中的幼蟲排出或數目減少的效應如圖1所示。幼蟲與5或10毫升未感染羊的粘液共孵育後仍然能夠在小腸前5米腸段正常生長。與免疫羊的粘液共孵育的幼蟲隨共孵育粘液體積的增加而逐漸地移位或消失。與未感染羊的粘液相比較，與10毫升免疫羊粘液共孵育的幼蟲的生長數目減少82％，且在腸道的前5米腸段幼蟲排出率達100％。
L3與10毫升粘液共孵育不同時間後的效果如圖2所示。幼蟲與免疫羊粘液共孵育的時間低至1小時的情況下，幼蟲的生長數目減少46％，且在腸道的前5米腸段處幼蟲排出率達81％。共孵育的時間為4，10，24小時時的減少超過94％，排出超過93％。
L3與16份未感染羊的粘液樣品及25份免疫羊的粘液樣品共孵育後對幼蟲生長的效應如圖3所示。總體上，接受L3+免疫羊粘液的受體的幼蟲減少率達67％(範圍0-95％)；給予L3+免疫羊粘液的羊的腸道前5米腸段的幼蟲生長率減少80％(p＜0.001)。
粘液收集時間對其抗幼蟲性質的影響如圖4所示。在最後一次以幼蟲免疫2-3天後收集到的粘液的活性大致上比一周後或更晚時刻收集的粘液的活性強。回歸分析表明免疫後粘液收集時間與其保護作用間呈顯著的陰性相關關係。
L3與未感染羊或免疫羊粘液的經清洗/未經清洗過的100000×g離心上清共孵育後的效應如表2所示。結果顯示L3與未感染羊粘液的上清或經清洗後的上清共孵育後能夠在未感染的受體羊上生長。與此相反，L3與免疫羊粘液的上清或經清洗後的上清共孵育後大部分不能夠在未感染羊接受者上生長，與未感染羊粘液組相比較數目減少了91％。
2.3粘液生物化學粘液的電泳分離結果如圖5所示。免疫羊及未感染羊粘液的蛋白總體情況高度複雜，兩系列的粘液間未見清楚明了的差異，凝集素印跡也表明兩系列顯示含有糖基的粘液都具有複雜的糖蛋白性質(圖6，7，8)。另外凝集素對免疫羊粘液或未感染羊粘液的結合的差異也不明顯，而花生凝集素對大部分的免疫羊樣品在與Ig的重鏈及輕鏈對應的約70000及28000mw處染色增強(圖7A)。然而，當粘液與RAS/IgG-HRP反應時，所有樣品均見55000及27000的主要條帶，其可能與IgG的重鏈及輕鏈對應(圖8B)。
2.4粘液印跡用粘液或自粘液回收的抗體探查Tc L3的免疫印跡結果如圖9所示。6個未感染羊的樣本(第13-18道)不與L3抗原反應。免疫羊的粘液樣本主要和35kDa的條帶反應，且兩隻羊的腸內容物通過硫酸銨沉澱得到的抗體的表現與此相同(第8，9道)。免疫羊粘液上清在蛋白G-瓊脂糖上純化後的抗體以及L3與免疫羊粘液共孵育後酸透析得到的抗體也與35kDa條帶反應(第4，7道及第6，20道)。接受3次Tc截短型感染的羊的血清還包括識別35kDa抗原和許多其他抗原的抗體(未顯示)。與35kDa條帶反應的粘液抗體的亞型特異性如圖10所示。存在IgG1及IgA亞型抗體，但是IgG及IgM未檢出。
用Tc免疫羊粘液探查腸道感染性線蟲匙狀細頸毛樣線蟲(Ns)和古巴毛樣線蟲(Cc)的L3抗原提取物的免疫印跡結果發現它主要與22kDa的條帶反應(圖11，第9，13道)。接受Ns截短型感染的羊的粘液與Ns及Cc的抗原反應(第12及16道)，也與Tc的35kDa條帶反應(第8道)。將260000隻出鞘的Tc L3與2ml免疫粘液共孵育使粘液內抗體完全消失(第1道)。用膠體金蛋白染色法檢測印跡上的蛋白(第4道)，在與免疫粘液的抗體檢測相對應的區域並未發現染色(第3，4道)。腸道線蟲匙狀細頸毛樣線蟲及古巴毛樣線蟲和胃線蟲捻轉血矛線蟲及環頸奧斯他胃蟲的L3提取物以Tc免疫羊粘液探查，發現在Tc和Hc的35kDa處，Oc的39kDa處；Cc的46kDa和22kDa和Ns的22kDa發生發應(圖12)。圖33示腸道線蟲T.axei(Ta)、T.vitrinus(Tv)、結節線蟲(Ooi)、C.oncophera(Co)、D.eckerti(De)、胃線蟲捻轉血矛線蟲(Hc)及環頸奧斯他胃蟲(Oc)的1M NaOH提取物以Tc免疫羊粘液探查的結果，顯示在Ta、Tv和Hc的35kDa處，Oo的45，35，33和30kDa處，Co的45kDa和20kDa，Nb的12kDa和9kDa處，以及De的30kDa處發生反應。
粘液IgG及IgA抗體滴度與粘液體內給予時所提供的保護作用之間的相互關係以線性回歸法分析(圖13)。抗L3抗原的IgG及IgG抗體的滴度與其保護作用之間存在著明顯的關係(R2＝0.6，P＜0.01)粘液活組織檢查發現樣本的抗體滴度自免疫3天後達到高水平(圖14)，然而，IgG及IgA的滴度到16天後下降，但是至免疫後第37天時仍然處於高於基線的水平。
幼蟲的免疫螢光染色結果如圖15所示。出鞘的L3在與免疫羊粘液共孵育後顯示強的表面螢光，但是與未感染羊的粘液共孵育並不能(上圖)。在感染羊2，3，4天後獲得的幼蟲也顯示出表面染色(未圖示)，但是感染第5天許多幼蟲不被抗體染色，且發現一些處於蛻皮階段(下圖)。蛻皮的L3的表皮與來自免疫羊粘液的抗體反應，但是出現的L4不被染色。在感染的6，7天獲得的L4不顯示表面染色。
免疫金電鏡檢查的結果與此類似，L3階段在表皮出現表面標記(圖16，B)。感染後第2天再觀察金標記，在第3，4天變弱，第5天消失(分別見圖C，D，E和F)。
在蟲卵、L1、L2、L3、及免疫羊感染不同時間後獲取的幼蟲的抗原提取物以粘液抗體探查進行免疫印跡(圖17及18)。L3在感染前至感染5天後發現存在35kDa的抗原，但是在蟲卵期、L1或L2、感染後7～14天的L4、或線蟲成蟲上無此抗原。
2.5PAB-15單克隆抗體
PAB-1單克隆抗體及Tc免疫羊粘液的抗體與Tc L3抗原的印跡反應的對比在圖19中顯示。單抗在35kDa處與主要的Tc L3抗原，在30-40kDa處與離散抗原和一些更低分子量的抗原反應。
其他種屬的線蟲的抗原的鑑定結果如圖20所示。腸道線蟲匙狀細頸毛樣線蟲和古巴毛樣線蟲及胃線蟲、捻轉血矛線蟲和環頸奧斯他胃蟲的L3提取物以單克隆抗體PAB-1探查，發現在Tc及Hc的大約35kDa處，Oc的39kDa處，Cc的46kDa及22kDa處，Ns的22kDa處發生反應(圖20)。將L3提取物用蛋白酶K消化後，以取自免疫羊粘液的抗體或單克隆抗體MAB-1進行免疫印跡發現該酶不消化幼蟲抗原(圖19和20)。
以抗鼠FITC結合物染色與出鞘的Tc L3反應的mAb PAB-1，發現了強的表面螢光(圖21)，IgG3對照單抗不與幼蟲表面反應。
2.6幼蟲抗原的免疫親和純化使用鍵合在蛋白A-瓊脂糖上的單抗PAB-1來免疫親和純化幼蟲抗原的結果如圖22所示。對洗脫物進行銀染髮現沒有蛋白染色帶在幼蟲抗原的可能電泳區域出現。在洗脫物中檢測出一個單一的糖染色條帶，其位置與以免疫羊粘液抗體免疫印跡法檢出的抗原在相同的分子量的位置上。用一種能與經高碘酸氧化後暴露的糖基相結合的生物素-醯肼試劑也在原位標記了該條帶。
2.7幼蟲抗原的特徵鑑定L3抗原的各種化學或酶處理對35kDa抗原與粘液抗體的免疫印跡反應的影響如圖23-30所示。抗原在37℃下加熱18小時對其中的35kDa抗原的免疫印跡反應無影響(圖23，第2道)，用高碘酸或脂肪酶處理輕微降低信號強度(圖23，第3，5道)，但是鏈黴蛋白酶無作用(第4道)，35kDa抗原在酸沉澱或溶劑沉澱後發現存在於沉澱物中(第6-9道)。
以胰蛋白酶，胃蛋白酶，蛋白水解酶K，磷脂酶A2處理L3抗原使印跡反應變得更加分散，但是不降低分子量(圖24，第2，3，5，11道)。以木瓜蛋白酶，枯草桿菌蛋白酶，裂解酶處理L3抗原引起信號強度降低，但是不改變分子量(第6-8道)。鏈黴蛋白酶，脂肪酶，溶菌酶，磷酸肌醇-磷脂酶C，磷脂酶D沒有作用(第4，9，10，12，13道)。以彈性蛋白酶處理產生分子量稍微降低的條帶(圖25，第1道)。膠原蛋白酶、蛋白水解酶K在37℃下無作用(第2，3，4道)。在多種條件下蛋白水解酶K在50℃處理18小時也不能毀壞35kDa抗原，仍能夠在印跡上檢測到(第6-9道)。以N-糖苷酶F處理L3抗原引起35kDa抗原印跡信號強度降低，但是不改變分子量(圖26，第4道)，而在此條件下對照糖蛋白胎球蛋白被降解(第2道)，這說明酶具有活性。以1M氫氧化鈉在60℃處理18小時後，印跡上分子量稍微降低的條帶的數目增加，但是在35kDa處的反應仍然是主要的(圖27，第2道)。用NaOH加NaBH4處理，銀染後未見任何的蛋白，但是35kDa抗原的印跡反應與對照抗原比較未見減弱(圖27，第3道)。
L3抗原以氫氟酸在4℃處理48小時，或以醯肼在20℃處理16小時不能毀壞35kDa抗原(圖28)。以醯肼在100℃處理7或14天，與未處理的對照抗原相比印跡的強度降低(圖29，第1，2道)。以氫氟酸處理4或16小時毀壞了抗原(圖29，第4，5道)。
如免疫印跡所示(圖30)，L3抗原以下列程序處理不能毀壞35kDa抗原蛋白酶K+SDS在50℃下處理4小時或20小時(第1及2道)；0.1-1.0M NaOH在37℃下處理18小時(圖30，第3，6，7，8道)；在90℃下進行20分鐘的熱變性，然後以1M NaOH消化(第4道)；不論其是否在90℃下進行了20分鐘的熱變性都在37℃下用胰蛋白酶消化22小時(第10及14道)；蛋白酶K+SDS+DTT在50℃下處理22小時(第12道)。來自5個種屬的線蟲的L3抗原以蛋白酶K消化都不能破壞35kDa抗原，或其他種屬的46、35或22kDa的交叉反應抗原(圖20)。
Tc L3提取物在原生條件下和在0.5％DOC或6M脲存在下以電泳法及印跡法分析。抗原在此條件下電泳出高分子量的模糊帶(圖32)。向樣品加入還原劑(20mM DTT)和電泳緩衝液不改變這些結果(未圖示)。
Tc L3脲提取物進行二維電泳分析顯示了35kDa處的強免疫印跡反應，其超出pH3-10範圍(圖33)。儘管印跡強度大，但相應區域未見蛋白。
3.6羊免疫實驗FEC(糞便線蟲計數)數據如表3所示。在感染3周後，組間FEC無顯著差異，但是免疫組第四周的計數顯著下降(p＜0.05)。綜合兩周的計數值，免疫組FEC總值具顯著的下降(p＜0.05)。
圖34顯示了蛇形毛圓線蟲L3提取物及純化的糖類幼蟲抗原(c)在非變性條件(無洗滌劑及還原劑)下的凝膠電泳(8％PAGE)及免疫印跡分析結果。凝膠進行了蛋白質或糖染色。印跡與PAB-1單抗反應後，與兔抗鼠Ig-HRP結合物或免疫羊粘液反應，最後與免疫羊Ig-HRP結合物反應。
表1.免疫羊粘液經不同處理後的體外抗L3活性處理方法 幼蟲結塊*未處理+++透析 +++10000×g離心，上清+++50000×g離心，上清++100000×g離心，上清 +100000×g離心，上清，DTT -100000×g離心，上清，TX100++100000×g離心，上清，CHAPS++還原並烷基化 ++60℃加熱 ++100℃加熱 -胃蛋白酶 +鏈黴蛋白酶-高碘酸-脂肪酶++＞100000mw滯留物 +++10-100000mw -3-10000mw -*結塊分值+++＝大部分幼蟲成大團狀結塊；++＝一些結塊；+＝輕微結塊；-＝無結塊。
表2.L3與未感染羊/免疫羊的粘液、經100000×g離心的粘液上清或經上述離心後清洗過的上清共孵育，注入未感染的受體羊一周後小腸5米腸段內生長的蛇形毛圓線蟲幼蟲的數目樣品 0-5米 5-10米 10-15米總計減少率％*未感染羊的粘液10664 1400 10804上清 24978 5900 25568上清+清洗 8140 1480 8288免疫羊的粘液 148 7700 918 91上清 130 0 396526 98上清+清洗 224 4200 644 92*％與未感染羊的粘液的總計量相比幼蟲數目的減少量。
表3.用35kDA抗原免疫的羊的FEC數據組別 各自的FEC 平均值SD第3周對照 600 700 1300 1500 1700 1800 2500 2500 1575 715免疫的300 400 800 1900 24001160 940第4周對照 900 1100 1300 1700 1800 2200 2500 40001938 993免疫的600 600 900 1100 1300 900 308*與對照有明顯差別(P＜0.023，Kruskall-Wallis測試)3.討論免疫羊粘液影響線蟲存活的能力已經在先期的工作中發現，如果將幼蟲與粘液共孵育，幼蟲出篩遷徙就會受抑制(Douch等1983)。最近我們觀察到幼蟲與免疫粘液共孵育後常成團結塊，且這種幼蟲若通過十二指腸導管注入未感染羊後不能正常生長(Harrison等1999)。這些發現引發了本研究，結論性地表明免疫粘液能夠有效防止幼蟲生長，這種對感染的保護程度取決於免疫後收集粘液的時間及劑量。抗體下降的水平與時間的關係在粘液或組織檢查樣本中可以觀察到，該樣本取自免疫5星期後的截短型感染羊。免疫粘液的100000×g離心上清也能防止幼蟲生長，該發現表明這種作用存在於粘液的可溶性成分中，而不是由於粘液的物理阻礙性，如粘性引起。共孵後清洗幼蟲並不影響免疫粘液上清防止幼蟲生長的效果，這表明活性因子與幼蟲發生了結合。
免疫粘液經透析、離心或分子篩過濾處理後體外進行幼蟲結塊分析，結果表明其結塊能力與粘液中的高分子量成分相關。熱處理、蛋白酶消化表明結塊需要粘液中的蛋白組分。然而，SDSPAGE分析及Coomassie藍染/銀染法檢測蛋白並沒有發現免疫羊和未感染羊樣品組中的粗蛋白存在差異。與此相似，凝集素印跡法也未發現兩組粘液的糖蛋白組分存在差異。例外的是免疫粘液樣本中的花生凝集素，其可以檢測到存在於重鏈及輕鏈上的糖，重鏈為70kDa，表明IgA存在。印跡法也顯示了所有粘液樣本中存在IgG。
上述發現和免疫粘液中存在IgG及IgA表明是識別線蟲抗原的抗體導致了幼蟲結塊並在體內提供保護。以免疫粘液探查幼蟲抗原的免疫印跡發現存在IgG1及IgA抗體，這些抗體主要與主抗原的35kDa反應，也和9、12、20、30-45kDa的離散區域反應。重要的是，與免疫粘液共孵育後，用從完整出鞘幼蟲中洗脫下的抗體探查L3抗原的印跡也表明該抗原是優勢反應抗原。這些結果與表面螢光染色法及免疫金電鏡法的結果一起說明了抗原表型存在於幼蟲表面，抗35kDa抗體存在於用於體內感染實驗的粘液樣本中，而且IgG、IgA的滴度與免疫粘液提供的保護程度存在明顯相關。蛇形毛圓線蟲免疫羊的粘液抗體也識別其它腸道線蟲古巴毛樣線蟲、匙狀細頸毛樣線蟲、T.axei、T.vitrinus、結節線蟲、C.oncophera、巴西奴卡菌、D.eckerti和胃線蟲捻轉血矛線蟲及環頸奧斯他胃蟲的幼蟲提取物印跡上的抗原。這種交叉反應顯示其他種屬線蟲表面存在與蛇形毛圓線蟲抗原功能類似的表面分子，可以是免疫反應的標靶。PAB-1單抗也與這些抗原反應，因此能用來鑑定與純化這些種屬寄生性線蟲的表面抗原。所有產生交叉反應的受試抗原對蛋白酶K的消化具有抗性的發現證明了它們同樣也不是蛋白質，而是與蛇形毛圓線蟲的35kDa抗原的性質相似。
與蛋白A-瓊脂糖相連結的PAB-1單抗能純化蛇形毛圓線蟲幼蟲表面抗原，發現這種蛇形毛圓線蟲幼蟲表面抗原主要是糖類，這通過其對蛋白酶K等蛋白酶消化具有抗性，對糖基進行銀染改良法染色和用能與暴露的糖基結合的生物素-醯肼試劑標記得到證實。該抗原不被諸如銀染/Coomassie藍染法等的蛋白質檢測術所染色。該抗原對脂肪酶降解有抗性，且不溶於有機溶劑，這表明脂類成分不存在或不能進入。用N-糖苷酶F處理不影響抗原，這說明糖不是N-連接的，或者說明酶不能進入而產生攻擊作用。鹼處理或醯肼廣泛水解不毀壞抗原，表明其糖結構不常見。以三氟乙酸進行強酸水解，抗原遭毀壞。
以PAB-1單抗探查蛇形毛圓線蟲幼蟲提取物，觀察到印跡上的低分子量抗原以階梯狀條帶形式出現多級條帶圖案，這表明35kDa抗原的結構含有由更小單元組成的多聚體。但是，在存在於幼蟲表面時的原生狀態下，抗原是一個高分子量的複合物，正如非變性條件下進行的電泳結果所顯示。將該複合物溶解於SDS+DTT使其降解為一種在印跡的35kDa處能檢測到的抗原，表明該複合物是一種35kDa抗原的多聚物或35kDa抗原與其他未明組分的異聚體。該抗原在以等電聚焦分離時顯示出帶電異質性，這再次說明它是一個複雜的結構。上述結果表明了這種存在於幼蟲外表面的分子複合物可能對線蟲宿主的胃腔、腸道內所能有的物理條件所致的降解具有抗性。線蟲表面抗原的這些性質所隱含的功能性作用尚未確定，但是個複合物可能在幼蟲通過宿主系統內的敵對環境達到其嗜好的小腸時發揮臨時保護作用。35kDa抗原僅僅在L3感染前直至感染後5天內出現，這表明這種覆層是幼蟲通過胃腔時保護所需要的。當在小腸內蛻皮成L4過程中，由於不需要，因而這種保護性覆層蛻離。很明顯針對該保護性覆層的免疫反應能嚴重損壞線蟲在宿主體內成功生長的能力，因此對線蟲控制具有廣泛意義。在對羊的初級疫苗試驗中，用含有部分純化35kDa抗原和油佐劑的疫苗對動物免疫，與對照組比較，免疫組的糞便蟲卵數量顯著減少。
本發明的所有方面僅以實施例的形式描述，需說明的是，在不超出所附權利要求的範圍的情況下可以對其進行的修改與增加。
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1.分離的單克隆抗體mAb PAB-1，於2002年1月24日在ATCC保藏，登記號為PTA-4005，其能夠與線蟲L3表面的抗原結合。
2.如權利要求1所述的分離的單克隆抗體，其中該抗體與源自蛇形毛圓線蟲(T.colubriformis)L3的抗原結合，且在還原的條件下該抗原在SDS PAGE凝膠中約35kDa處出現條帶。
3.如權利要求1所述的分離的單克隆抗體，其與L3的表面抗原結合，該表面抗原選自a)古巴毛樣線蟲(C.curticei)上的表面抗原，其在還原條件下SDS PAGE凝膠中基本上在46kDa處和22kDa處出現條帶；b)匙狀細頸毛樣線蟲(N.Spathiger)上的表面抗原，其在還原條件下SDS PAGE凝膠中基本上在22kDa處出現條帶；c)捻轉血矛線蟲(H.contortus)上的表面抗原，其在還原條件下SDS PAGE凝膠中基本上在35kDa處出現條帶；d)環頸奧斯他胃蟲(O.circumcincta)上的表面抗原，其在還原條件下SDS PAGE凝膠中基本上在約35-39kDa處出現條帶；e)T.axei或T.vitrinus上的表面抗原，其在還原條件下SDSPAGE凝膠中基本上在35kDa處出現條帶；f)結節線蟲(O.ostertagi)上的表面抗原，其在還原條件下在SDS PAGE凝膠中基本上在30-45kDa處出現條帶；g)C.oncophera上的表面抗原，其在還原條件下SDS PAGE凝膠中基本上在20kDa處和約45kDa處出現條帶；h)巴西奴卡菌(N.brasiliensis)上的表面抗原，其在還原條件下SDS PAGE凝膠中基本上在9kDa處和約12kDa處出現條帶；i)D.eckerti上的表面抗原，其在還原條件下SDS PAGE凝膠中基本上在30kDa處出現條帶。
4.如權利要求1所述的分離的單克隆抗體，其中當該抗體與固體支持物連結時，其能用於通過免疫親和色譜法純化表面抗原。
5.源自線蟲L3的分離的糖表面抗原，其中該抗原能與單克隆抗體mAb PAB1結合，該單克隆抗體已於2002年1月24日在ATCC保藏，登記號為PTA-4005。
6.基本上如權利要求5所述的分離的抗原，其中該抗原在還原條件下SDS PAGE凝膠中基本上在20-35kDa間出現條帶，或基本上在9kDa和12kDa處出現條帶。
7.如權利要求5所述的分離的抗原，其中該抗原源自蛇形毛圓線蟲L3。
8.如權利要求5所述的分離的抗原，其中該抗原源自線蟲L3，該線蟲L3分離自古巴毛樣線蟲、匙狀細頸毛樣線蟲、捻轉血矛線蟲、環頸奧斯他胃蟲、T.axei、T.vitriyzus、結節線蟲、C.oncophera、巴西奴卡菌或D.eckerti。
9.含有如權利要求5所述的抗原和藥學上或獸學上可接受的載體或稀釋劑的組合物。
10.如權利要求5所述的抗原在製備用於預防、治療線蟲感染或降低線蟲感染易感性的組合物的用途。
11.如權利要求9所述的組合物用於受線蟲感染的易感羊，以預防、治療線蟲感染或降低其感染易感性，這些線蟲選自蛇形毛園線蟲、古巴毛樣線蟲、匙狀細頸毛樣線蟲、捻轉血矛線蟲、環頸奧斯他胃蟲、T.axei、T.vitrinus、結節線蟲、C.oncophera、巴西奴卡菌和D.eckerti。
12.如權利要求9所述的組合物，該組合物用於除羊之外的易感動物以預防、治療線蟲感染或降低線蟲感染易感性，其中這些其它種類的線蟲也具有可通過與上述單克隆抗體PAB-1反應來檢測的幼蟲表面抗原。
13.如權利要求9所述的組合物，其中的組合物還包含至少一種佐劑或細胞因子。
14.診斷易感動物線蟲感染的方法，該方法包括如下步驟a)自動物獲得血液樣品；b)通過合適的檢驗方法，分析血樣是否存在抗如權利要求3所述抗原的抗體。
15.如權利要求3所述的分離的抗體，其中該抗體來源於動物的胃腸道粘液，這些動物用選自下列的線蟲的截短型感染免疫蛇形毛園線蟲、古巴毛樣線蟲、匙狀細頸毛樣線蟲、捻轉血矛線蟲、環頸奧斯他胃蟲、T.axei、T.vitrinus、結節線蟲、C.oncophera、巴西奴卡菌和D.eckerti。
16.通過用如權利要求9所述的組合物給藥來預防、治療動物線蟲感染或降低線蟲感染易感性的方法。
17.如權利要求5-8中任一項所述的抗原用於在羊或其他易感動物的腸道粘液內引起抗體反應以預防、治療線蟲感染或降低線蟲感染易感性的用途。
18.如權利要求1-3中任一項所述的抗體用於檢測羊體內線蟲感染的用途。
全文摘要
本發明涉及到分離的單克隆抗體mAb PAB－1，該抗體於2002年1月24保藏於ATCC，登記號為PTA－4005，其能與線蟲L3的表面抗原結合。本發明還涉及到能與該單克隆抗體結合的抗原以及該單克隆抗體和抗原在診斷和治療或預防線蟲感染方面的應用。
文檔編號A61P33/00GK1625567SQ03802969
公開日2005年6月8日 申請日期2003年1月30日 優先權日2002年1月30日
發明者加文·伯納德·李爾·哈裡森, 韋恩·羅伯特·海恩, 休·道格拉斯·普爾福德, 查理·比克斯·舒梅克 申請人:奧維塔有限公司