一種提高畜禽免疫功能的甘草次酸納米脂質體及其製備方法
2023-05-03 04:30:56
專利名稱：一種提高畜禽免疫功能的甘草次酸納米脂質體及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種甘草次酸納米脂質體的製備方法，及其提高畜禽免疫功能的應用，屬於中獸藥製備技術及免疫應用領域。
背景技術：
甘草是一味最常用的補氣藥，具有補脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳，緩急止痛，調和諸藥等功效，在多種疾病防治中起到重要作用。甘草次酸作為甘草的主要有效成分，主要從甘草的根部或根莖提取而得，屬五環三萜皂苷類化合物。現代研究表明甘草次酸具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化、腎上腺皮質激素樣作用等多種藥理作用。但由於甘草次酸難溶於水，常規的給藥方式，如口服、皮下注射、靜脈注射等，甘草次酸幾乎不能被吸收，生物利用度非常低，這樣大大降低了甘草次酸的臨床應用價值。同時，甘草次酸會產生鈉瀦留、鉀流失、高血壓等不良副作用，而且這些副作用可能存在劑量依賴關係。因而，研究甘草次酸新劑型，提高其生物利用度，減小其不良副作用就變得非常必要。脂質體是由類脂質製備的具有復層或單層單位膜結構的小囊，其結構類似生物膜，在體內能生物降解。由於脂質體成份為磷脂和膽固醇，也是生物細胞膜的主要成分，屬機體內源性物質，具有良好的生物相容性和可降解性，無毒、無免疫原性。脂質體的結構和生物細胞相似，易被細胞吸附、融合、脂交換、內吞而被細胞攝取；且具有一定的彈性和變形性，比相同粒徑的其他類型的納米粒容易進入病灶組織。因此，脂質體已成為現代藥物載體研究的內容之一。同時脂質體還可用作免疫佐劑，早在1974年由Allison等首次報導脂質體能增強機體的體液和細胞介導的免疫應答，對疫苗的增效作用可達數十倍甚至更高。脂質體具有靶向釋藥、 緩釋、無免疫原性、降低藥物毒副作用等優勢。脂質體是微米級類脂質雙分子層結構，大小於I οομπι之間。如果在脂質體的類脂質雙分子層中加入適當表面活性劑，則可形成納米脂質體。納米脂質體除粒徑小於普通脂質體外，還具有高度的自身變形性，更易於提高其生物利用度。如將甘草次酸包封於脂質體中，脂質體不僅可以避免甘草次酸的不良副作用，而且可以有效維持甘草次酸在機體內的有效濃度，提高了其生物利用度。因而脂質體可以作為甘草次酸的一種優良載體。本發明首次將甘草次酸製備成納米脂質體，並將其和動物疫苗一起應用，建立了甘草次酸納米脂質體的製備方法，優化了製備條件，發現甘草次酸納米脂質體能顯著提高甘草次酸的免疫增強作用，提高其生物利用度。
發明內容
技術問題本發明針對甘草次酸水溶性低、不易被吸收、易產生不良反應，生物利用度低等問題，提供一種甘草次酸納米脂質體的製備方法，達到顯著提高甘草次酸免疫增強作用目的，並應用於畜禽臨床。技術方案
用薄膜分散法及響應面法設計甘草次酸納米脂質體的製備方法。經優化後甘草次酸納米脂質體最佳製備方法為:稱取大豆磷脂150mg、膽固醇60mg、吐溫-80 75mg和甘草次酸16.7mg,加入IOmL氯仿振搖使之充分溶解。在旋轉蒸發儀上減壓蒸發除去氯仿，使溶液在瓶壁上形成一層均勻的薄膜，後加入磷酸緩衝溶液(PBS，pH 7.4)，繼續旋轉洗脫至薄膜完全溶解，經水浴超聲20min，形成納米脂質體，再將其過孔徑為0.22 μ m的微孔濾膜。將脂質體置於-20°C條件下凍結，之後置於31°C水浴中融化，如此反覆操作兩次。按此方法製備的甘草次酸納米脂質體，平均包封率為83.46%、粒徑在150nm以下。將甘草次酸納米脂質體和疫苗一起應用於雞，能顯著提高其細胞免疫功能和體液免疫功能，對提高畜禽免疫功能，防制疾病具有重要應用價值。有益效果動物疫病主要靠疫苗來預防，但是很多疫苗存在免疫原性較弱等缺點，需要免疫增強劑輔助才能產生強大的免疫應答。現有的常用免疫增強劑如油佐劑、鋁膠佐劑等常存在刺激性強、有殘留等缺點。由於中藥具有綠色安全的特點，從中藥中開發免疫增強劑已成為熱點。甘草次酸是甘草的主要藥效成分，具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化、腎上腺皮質激素樣等多種藥理作用。但由於甘草次酸難溶於水，常規的給藥方式，如口服、皮下注射、靜脈注射等，甘草次酸幾乎不能被吸收，生物利用度非常低，這樣大大降低了甘草次酸的臨床應用價值。利用脂質體包封甘草次酸，不僅可以有效維持甘草次酸在機體內的有效濃度，提高了其生物利用度，而且可以避免甘草次酸的不良副作用。本發明採用卵磷脂、膽固醇及表面活性劑吐溫-80將甘草次酸製備成納米脂質體，包封率較高、粒徑小，不僅便於藥物的吸收，而且可以使藥物緩慢地的釋放，有效地延長了藥效，能顯著提高動物細胞免疫功能和體液免疫功能，對抵抗疫病有重要意義。本發明作為一種新型中獸藥，沒有副作用。與現有技術相比，本發明優點如下:1.甘草次酸納米脂質體的製備國內外未見報導，本發明提供了一種甘草次酸納米脂質體的製備方法及其優化的條件，填補了國內外研究的空白。2.甘草次酸納米脂質體的免疫增強活性未見報導。通過本發明的實施，證明甘草次酸的免疫增強作用弱，通過製備成納米脂質體後能夠顯著提高其免疫增強活性，表現為明顯提高抗體效價、淋巴細胞增殖、IgG和IgM含量、淋巴細胞亞群⑶4+和⑶8+比率，與甘草次酸比，在免疫後期效果更好，具有較強的緩釋作用，從而增強動物體液免疫和細胞免疫。因此，甘草次酸納米脂質體可以作為研製新型免疫增強劑的材料，為研製新型免疫增強劑提供了材料和不範。
具體實施例方式1.甘草次酸納米脂質體的製備採用薄膜分散法製備甘草次酸脂質體。精密稱取大豆磷脂、膽固醇、吐溫-80和甘草次酸，加入IOmL氯仿振搖使之充分溶 解。在旋轉蒸發儀上減壓蒸發除去氯仿，使溶液在瓶壁上形成一層均勻的薄膜，後加入磷酸緩衝溶液(PBS，pH 7.4)，繼續旋轉洗脫至薄膜完全溶解，經水浴超聲20min，形成納米脂質體，再將其過孔徑為0.22 μ m的微孔濾膜。將脂質體置於_20°C條件下凍結，之後置於水浴中融化，如此反覆操作兩次，以提高包封率。在單因素試驗的基礎上，選出對脂質體包封率有較顯著影響的三個因素:脂藥比(大豆磷脂與甘草次酸質量比，A)、膜材比(大豆磷脂與膽固醇質量比，B)和水浴溫度(°C)。再根據脂藥比、膜材比和水浴溫度3個單因素試驗所確定的水平範圍，採用Design-Expert 7.0軟體設計響應面試驗，選用BBD模型，以脂質體的包封率為響應值，做3因素3水平共17個試驗點(5個中心點)二次回歸正交組合試驗。試驗設計及結果見表I。由表I可見，包封率從44.32%到81.00%變化。對試驗結果進行響應面分析，經過二次回歸擬合後，得出Y與影響因素Xi之間關係的擬合方程式如下:Y = 80.33-7.83x^5.25χ2+0.76χ3_1.32χ1χ2-7.29χ1χ3+3.06χ2χ3_9.δΙχ^-6.46χ2_12.40χ32表IBox-Behnken試驗設計表及結果
權利要求
1.一種甘草次酸納米脂質體的製備方法，採用薄膜分散法及響應面法設計優化製備甘草次酸納米脂質。
(1)採用薄膜分散法製備甘草次酸納米脂質體。精密稱取大豆磷脂150mg、膽固醇60mg、吐溫-80 75mg和甘草次酸16.7mg,加入IOmL氯仿振搖使之充分溶解。在旋轉蒸發儀上減壓蒸發除去氯仿，使溶液在瓶壁上形成一層均勻的薄膜，後加入磷酸緩衝溶液(PBS，pH7.4)，繼續旋轉洗脫至薄膜完全溶解，經水浴超聲20min，形成納米脂質體，再將其過孔徑為0.22 μ m的微孔濾膜。將脂質體置於-20°c條件下凍結，之後置於31°C水浴中融化，反覆2次。
(2)按照上述方法製備甘草次酸納米脂質體的條件為:脂藥比為9.0: 1，膜材比為2.5: 1，水浴溫度為31°〇。
(3)在最佳條件下製備的甘草次酸納米脂質體，包封率平均值為83.46±0.55%。
2.權利要求1所述方法獲得的甘草次酸納米脂質體能夠顯著提高動物體液免疫和細胞免疫功能，具有較好 免疫增強功能。
全文摘要
本發明涉及一種提高畜禽免疫功能的甘草次酸納米脂質體及其製備方法，屬於中獸藥製備技術及免疫應用領域。用薄膜分散法製備甘草次酸納米脂質體，以包封率為指標，採用響應面法研究了脂藥比、膜材比和水浴溫度3個因素並對其進行優選，確定最佳製備條件為脂藥比為9.0∶1，膜材比為2.5∶1，水浴溫度為31℃，所得甘草次酸納米脂質體的包封率高，免疫增強活性強。本發明甘草次酸納米脂質體顯著提高了甘草次酸的免疫增強活性。
文檔編號A61P37/04GK103181895SQ20111044837
公開日2013年7月3日 申請日期2011年12月29日 優先權日2011年12月29日
發明者王德雲, 趙曉娟, 胡元亮, 劉家國, 範雲鵬, 袁菊 申請人:南京農業大學