具有抗炎活性的發酵鹿茸提取物的製備方法、由此得到的提取物及該提取物的用途

2023-05-03 07:58:51 1

具有抗炎活性的發酵鹿茸提取物的製備方法、由此得到的提取物及該提取物的用途
【專利摘要】本發明涉及一種具有抗炎活性的發酵鹿茸提取物的製備方法及該提取物的用途，尤其涉及一種包括下列步驟的由鹿茸製造鹿茸發酵提取物的方法、由此得到的提取物及如此得到的提取物的用途：步驟1.在細切的鹿茸添加精製水並進行熱水提取及過濾；步驟2.在步驟1中得到的液相成分上添加芽孢桿菌菌株培養液並予以發酵而得到第一發酵提取液；及步驟3.在步驟1中得到的鹿茸渣滓上添加精製水後，添加麴黴菌株培養液並予以發酵而得到第二發酵提取液。本發明利用最接近大自然的發酵方法提取鹿茸，能夠減少鹿茸的生理活性物質的破壞、增加有效成分的含量、提高生產性，因此該方法可以有效地作為各種領域中所使用的鹿茸提取物製備方法。尤其是，由於本發明系統性地闡釋了抗炎活性而非常適合廣泛地應用在食品、化妝品等處。
【專利說明】具有抗炎活性的發酵鹿茸提取物的製備方法、由此得到的 提取物及該提取物的用途

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種鹿茸提取物的製造方法、由此得到的提取物及該提取物的用途， 尤其是，一種利用發酵提取製造鹿茸提取物的製造方法、由此得到的提取物及該提取物的 用途。

【背景技術】
[0002] 鹿鸞（Cervi Parvum Corun)指的是一般鹿角，其具體指稱雄鹿的下述角，該角開 始生長不到2個月並且沒有進行角質化而用手觸摸時能稍微感到柔軟，組織柔軟並且均勻 地分布有毛。柔軟的角到了秋天會角質化而變硬，這是為了在發情期為佔有雌鹿而戰鬥時 使用，經過角質化的角則成為效用低於鹿茸的鹿角。該鹿角錯過收穫時期而進行鈣化後由 於硬化而自然掉落的則稱為落角。
[0003] 根據東醫寶鑑等文獻的記載，鹿茸具有強壯作用、補血作用、強精作用、鎮痛作用、 造血作用、生長發育促進作用、心功能不全的治療作用及機能亢進作用等功效，此外，還具 有恢復疲勞，增強身體活力及加強腎臟利尿功能等眾多效能。
[0004] 傳統中醫藥所使用的鹿茸服用方法主要包括下列兩種：把鹿茸與各類草藥劑混合 並加以粉碎後，以水為溶劑進行加熱提取並服用其濾液的方法；把草藥劑加以粉碎製成粉 末後，以丸劑方式服用的方法。上述兩種方法各有其優缺點，提取後服用的方法雖然較易吸 收鹿茸的有效成分，卻會浪費掉提取渣滓中所含有的有效成分。提取鹿茸後濃縮使用時，固 形粉含量達到20%以上時會出現凝膠化問題而難以應用到產品。丸劑型雖然具有能夠攝取 鹿茸本身的優點，但很難在體內完全吸收有效成分。
[0005] 韓國公開專利第10-2003-0073134號揭示的鹿茸提取方法在細切的鹿茸上添加 水並加熱減壓提取後，把濾液加以濃縮、噴霧乾燥後予以粉末化，該方法針對傳統中醫藥 所使用的熱水提取法進行了局部改善並且為了服用便利而將提取液粉末化，卻沒有解決 現有問題，亦即，無法利用提取渣滓中所含大量有效成分而予以廢棄。韓國公開專利第 10-2005-0090041號揭示的鹿茸提取方法則將鹿茸或鹿角粉碎後進行溫水提取、蛋白分解 酶處理及鹽酸分解處理，該方法為了克服溫水提取法的界限而另外進行處理及鹽酸分解處 理，但其工序包含很多步驟而繁複耗時，由於使用強酸而破壞了對人體有益的生理活性物 質。而且，如此得到的現有鹿茸提取物大部分具有令人不快的味道與顏色而較難應用到食 品或化妝品，只有很少一部分能夠作為原料使用。
[0006] 解決的技術課題
[0007] 為了解決現有鹿茸提取方法的問題，本發明的目的是提供一種鹿茸發酵提取物的 製造方法，本發明為了避免破壞鹿茸固有的生理活性物質而在低溫僅僅使用發酵方法2次 卻能順暢地提取，從而得以在短時間內充分地分解而製成有效成分含量高的鹿茸發酵提取 物。
[0008] 而且，本發明的另一個目的是提供一種憑藉本發明的製備方法得到的提取物及配 合物。
[0009] 而且，本發明的再一個目的是提供一種功能性健康食品及化妝品，該功能性健康 食品及化妝品為了提高如此得到的鹿茸發酵提取物的穩定性而利用分子膠囊化技術設計 出對光線、空氣、熱及酸穩定的劑型而且還能在流通期限內維持抗炎活性。
[0010] 解決課題的技術方案
[0011] 為了達到上述目的，本發明提供一種包括下列步驟的由鹿茸製造鹿茸發酵提取物 的方法：
[0012] 步驟1，在細切的鹿茸添加精製水並進行熱水提取及過濾；
[0013] 步驟2,在步驟1中得到的液相成分上添加芽孢桿菌菌株培養液並予以發酵而得 到第一發酵提取液；及
[0014] 步驟3,在步驟1中得到的鹿茸渣滓上添加精製水後，添加麴黴菌株培養液並予以 發酵而得到第二發酵提取液。
[0015] 根據本發明，優選地，還包括下列步驟，在選自上述第一發酵提取液、第二發酵提 取液、第一發酵提取液及第二發酵提取液的混合物所構成的群之一個以上添加包合配合 物，然後攪拌而予以分子膠囊化。
[0016] 根據本發明，在上述步驟1中，在細切的鹿茸每100重量份添加200到500重量份 的精製水，在80到100°C進行熱水提取較佳。
[0017] 根據本發明，在上述步驟2中，在細切的鹿茸每100重量份添加10到30重量份的 芽孢桿菌菌株培養液，在30到40°C的溫度發酵2到3天較佳。
[0018] 根據本發明，芽孢桿菌菌株培養液包含乳酪芽孢桿菌（Bacillus casei)較佳。
[0019] 根據本發明，在上述步驟3中，在細切的鹿茸每100重量份添加10到30重量份的 麴黴菌株培養液，在50到70°C的溫度發酵2到3天較佳。
[0020] 根據本發明，麴黴菌株培養液包含酪麴黴（aspergillus casei)較佳。
[0021] 根據本發明，在選自第一發酵提取液、第二發酵提取液、第一發酵提取液及第二發 酵提取液的混合物所構成的群之一個以上對該混合物每100重量份添加20到30重量份的 環糊精（Cyclodextrin)後，在60到70°C攪拌，將其緩緩冷卻到常溫而實現分子膠囊化較 佳。
[0022] 根據本發明，包合配合物選自環糊精、冠醚、聚氧化烯、prophorine、聚娃氧燒、 phophazene及沸石所組成的群較佳。
[0023] 而且，本發明提供一種配合物，該配合物由對細切鹿茸進行熱水提取後得到的液 相成分上添加芽孢桿菌菌株培養液並發酵而得到的發酵提取液與包合配合物形成。
[0024] 而且，本發明提供一種配合物，該配合物由對細切鹿茸進行熱水提取後得到的固 形鹿茸粉上添加麴黴菌株培養液並發酵而得到的發酵提取液與包合配合物形成。
[0025] 而且，本發明提供一種配合物，該配合物由對細切鹿茸進行熱水提取後得到的液 相成分上添加芽孢桿菌菌株培養液並發酵而得到的發酵提取液、對細切鹿茸進行熱水提取 後得到的固形鹿茸粉上添加麴黴菌株培養液並發酵而得到的發酵提取液的混合物、及包合 配合物所形成。
[0026] 根據本發明，包合配合物選自環糊精、冠醚、聚氧化烯、prophorine、聚娃氧燒、 phophazene及沸石所組成的群較佳。
[0027] 而且，本發明提供通過本發明的製備方法製造的生成物或將本發明的配合物予以 高壓滅菌而得到的液相型的鹿茸發酵提取物。
[0028] 而且，本發明提供通過本發明的製備方法製造的生成物或將本發明的配合物予以 高壓滅菌並凍幹後得到的粉末型鹿茸發酵提取物。
[0029] 而且，本發明提供一種功能性健康食品及功能性化妝品，其把選自通過本發明的 製備方法製造的鹿茸發酵提取物、本發明的配合物及液相型及粉末型鹿茸發酵提取物的至 少一個作為有效成分而包含。
[0030] 有益效果
[0031] 本發明僅僅通過利用芽孢桿菌及麴黴菌株的發酵提取方法就能在短時間內提取 足夠的鹿茸有效成分，因此能夠解決現有熱水提取或利用強酸、酶的水解法對生理活性物 質的破壞問題，還能憑藉分子膠囊化方法實現生理活性物質含量高的鹿茸發酵提取物的高 穩定性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0032] 圖1是示出鹿茸的分子量大小隨著發酵時間而變化的照片。
[0033] 圖2是圖示了各提取方法的神經節苷脂類熱穩定性試驗的圖形。
[0034] 圖3是圖示了各提取方法的神經節苷脂類酸穩定性試驗的圖形。
[0035] 圖4是圖示了 LPS同時處理後發酵鹿茸分子膠囊對於在血清生產IL-6所發揮出 來的效果的圖形。
[0036] 圖5是圖示了 LPS同時處理後發酵鹿茸分子膠囊對於在血清生產MCP-1所發揮出 來的效果的圖形。
[0037] 圖6是圖示了 LPS同時處理後發酵鹿茸分子膠囊對於在血清生產IL-lb所發揮出 來的效果的圖形。
[0038] 圖7是圖示了 LPS同時處理後發酵鹿茸分子膠囊對於在血清生產TNF-a所發揮出 來的效果的圖形。

【具體實施方式】
[0039] 本發明的第一形態提供由鹿茸製造鹿茸發酵提取物的方法。尤其是，本發明提供 包括下列步驟的由鹿茸製造鹿茸發酵提取物的方法：步驟1，在細切的鹿茸添加精製水並 進行熱水提取及過濾；步驟2,在步驟1中得到的液相成分上添加芽孢桿菌菌株培養液並予 以發酵而得到第一發酵提取液；及步驟3,在步驟1中得到的鹿茸渣滓上添加精製水後，添 加麴黴菌株培養液並予以發酵而得到第二發酵提取液。
[0040] 下面按照各步驟詳細說明本發明的鹿茸發酵提取物的製備方法。
[0041] 熱水提取步驟
[0042] 在步驟1中，在細切的鹿茸添加精製水並進行熱水提取及過濾。更具體地說，在被 乾燥並細切的鹿茸100重量份添加精製水200到500重量份，添加300到40重量份則較佳。 在80°C到100°C提取該混合液2到5小時並過濾。精製水的量小於或大於上述所記載的範 圍時會降低提取效率或導致稀釋，從而在後續的發酵步驟中引起經濟性問題。
[0043] 憑此，把得到的生成物區分成液相成分及鹿茸粉。在此，鹿茸粉指的是憑藉熱水提 取得到的物質中液相成分以外的其餘固形粉，是含有較多角質而無法溶解在水的固形粉。
[0044] 第一次發酵提取步驟
[0045] 步驟2針對上述步驟所得到的液相成分添加芽孢桿菌菌株培養液並發酵而得到 第一發酵提取液。尤其是，本步驟在上述步驟所得到的液相成分上對細切的鹿茸每1〇〇重 量份添加芽孢桿菌菌株培養液10到30重量份，優選地，添加20到25重量份，然後在30°C 到40°C，優選地，在35°C到37°C發酵2天到3天。
[0046] 本發酵提取步驟使用芽孢桿菌菌株培養液，其所含發酵菌株以乳酪芽孢桿菌 (Bacillus casei，受託編號KACC91310P)、枯草芽孢桿菌（B. subtilis)、納豆芽孢桿菌 (B.natto)、短芽孢桿菌（B.brevis)較適合。
[0047] 作為一例，本發明的芽孢桿菌菌株培養液是在月示蛋白腖（proteosepeptone) no. 3310. 0g、牛肉提取物10. 0g、酵母提取物5. 0g、右旋糖（dextrose) 20. 0g、吐溫801. 0g、 朽1檬酸銨（ammonium Citrate) 2. 0g、乙酸鈉5. 0g、硫酸鎂0. lg、硫酸猛0. 05g、磷酸氫二鉀 (Dipotassium Phosphate)20g接種幹乳酪桿菌（Lactobacillus casei) (KACC91310P)並培 養一個晚上後的液體。
[0048] 在該第一次發酵提取步驟，如果發酵溫度小於或大於上述所記載的溫度範圍則無 法進行發酵或者菌株失去活性而無法進行發酵。
[0049] 經過了第一次發酵提取步驟後，可以進行過濾以清除未反應固形粉。過濾方面，則 使用〇. 1到3 μ m過濾器過濾1次以上較佳。過濾器的氣孔尺寸小於0. 1 μ m時由於過濾器 超精密、價格超高（超濾法）而降低了經濟性，超過3ym時，則不具備除菌能力而使得真菌 或細菌被包含在最終提取物，從而很可能在流通過程中被汙染。
[0050] 憑此，通過本步驟的第一次發酵提取步驟得到第一發酵提取液。
[0051] 第二次發酵提取步驟
[0052] 在步驟3中，在上述步驟1中得到的鹿茸渣滓添加精製水後添加麴黴菌株培養液 10到30重量份，優選地，添加20到25重量份，在50°C到70°C，優選地，在60°C到65°C發酵 2天到3天。鹿茸渣滓的發酵由於角質成分較多而在相對較低的發酵溫度條件無法完全發 酵，因此在較高溫度發酵較適合。
[0053] 本發酵提取步驟使用麴黴菌株培養液，其所含發酵菌株為酪麴黴（aspergillus casei)、米麴黴（A. oryzae)、黑麴黴（A. niger)、灰綠麴黴（A. glaucus)，其中以黑麴黴 (aspergillus niger)較適合。
[0054] 作為一例，本發明的麴黴囷株培養液可以如下所述地製造：把黑麴黴KK2囷株接 種到PDA (potato dextrose agar)斜面培養基並且在28°C培養7天後，添加0· l%Tween80 溶液將孢子予以懸浮。把孢子懸液（每1. 〇mL含3. 5X 107孢子）10mL接種到含有90mL 麥芽提取物（malt extract)的250mL的三角燒瓶後，在28°C的振蕩培養器以200rpm進 行種菌培養（seed culture)48小時。在121°C、在1. 5氣壓下對含有本培養基47. 5M1的 250mL三角燒瓶進行滅菌20分鐘，然後進行了種菌。接種2. 5mL並且在28°C的振蕩培養器 以200印111培養5天。本培養基由2.5(%的稻草（1'；^6 81:四￥，0.31111]1以下的尺寸）、1.25(% 的麥鼓（wheat bran，0.4mm 以下的尺寸）、4·5% 的玉米楽（corn steepliquorhO.lZS1% 的工業酵母提取液（industrial yeast extract)、0· 65 % 的憐酸二氫鉀（potassium phosphate, monobasic)、0· 05 %的硫酸銅五水化物、0· 01 %的硫酸鈷七水化物構成，以5N 氫氧化鈉把pH調整成7.0。
[0055] 經過了第二次發酵提取步驟可以進行過濾以清除未反應固形物質。過濾方面，則 使用〇. 1到3 μ m過濾器過濾1次以上較佳。過濾器的氣孔尺寸小於0. 1 μ m時由於過濾器 超精密、價格超高（超濾法）而降低了經濟性，超過3μπι時則不具備除菌能力而使得真菌 或細菌被包含在最終提取物，從而很可能在流通過程中被汙染。
[0056] 分子膠囊化步驟
[0057] 為了得到本發明的增強了穩定性的鹿茸發酵提取物，本發明的製備方法還包括下 列步驟，亦即，在上述第一發酵提取液及/或第二發酵提取液的混合物添加包合配合物，然 後攪拌而予以分子膠囊化。尤其是，在上述第一發酵提取液及/或第二發酵提取液的混合 液100重量份投入環糊精20到30重量份後並且在60°C到70°C攪拌4小時而把生理活性 物質予以分子膠囊化。為了讓分子膠囊進一步穩定化而緩緩冷卻到常溫後製成穩定性高的 膠囊。包合配合物以環糊精、冠醚、聚氧化烯、prophorine、聚娃氧燒、phophazene或沸石較 佳，環糊精則更佳。憑此，形成了由第一鹿茸發酵提取液及第二鹿茸發酵提取液的混合物與 包合配合物所形成的配合物。
[0058] 如此製造的本發明的提取物或配合物包括了進行高壓滅菌後得到的液相及將其 凍幹的粉末產品。優選地，高壓滅菌在121°C進行30分鐘。
[0059] 如此得到的第一發酵提取液及第二發酵提取液混合的鹿茸提取物、及/或將其予 以分子膠囊化後得到的配合物、及/或液相型或粉末型鹿茸發酵提取物可以作為有效成分 應用於功能性健康食品及化妝品等。
[0060] 本發明所得到的發酵提取液在低溫利用發酵方法2次二提取，不僅不會破壞生理 活性物質而且提取液所含鹿茸成分多於利用現有提取方法得到的提取液，而且可以憑籍分 子膠囊化提到穩定性而得以設計出對光線、空氣、熱及酸穩定的劑型，因此可以作為功能性 健康食品及化妝品的有效成分使用。
[0061] 除了本發明鹿茸提取物以外，需要添加的健康食品及化妝品的賦型劑及其它添加 劑的種類與量可由本領域的技術人員輕易地選擇，本說明書將不對此予以限制。
[0062] 下面結合具體實施例更詳細地說明本發明。但不能利用下述實施例局限本發明的 範疇，在本發明所屬領域中具有通常知識者可以在本發明的技術思想範疇與權利要求書的 均等範圍內進行各種變形及修改。

【具體實施方式】 [0063]
[0064] 〈實施例1>發酵鹿茸分子膠囊的製備
[0065] (1)把乾燥並細切的鹿茸10kg添加到精製水35 kg並且在90°C提取4小時後，通 過過濾把鹿茸渣滓予以分離後獲得濾液。
[0066] (2)為了得到第一階段發酵物，在所獲得的濾液添加枯草芽孢桿菌（bacillus subtilis)培養液lkg後在37°C發酵2天。之後，使用Ιμπι過濾器進行過濾而清除了未反 應固形粉。
[0067] (3)為了得到第二階段發酵物，把上述（1)項中分離的鹿茸渣滓添加到精製水 60kg，在此添加黑麴黴（aspergillus niger)培養液lkg後在60°C發酵2天。之後，使用 1 μ m過濾器進行過濾而清除了未反應固形粉。
[0068] (4)把上述發酵及過濾後的第一階段、第二階段鹿茸發酵物予以混合，通過瓊脂過 濾將該混合液過濾。在該濾液添加環糊精25kg並且在60°C攪拌4小時而把生理活性物質 予以分子膠囊化。為了讓分子膠囊進一步穩定化而緩緩冷卻到常溫後製成穩定性高的膠 囊。
[0069] 把如此製成的組合物予以凍幹並進行粉末化。此時得到的經過凍幹的粉末達到了 33kg以上。
[0070] 與此相關地，為了測量所獲得的上述上述第一階段、第二階段鹿茸發酵物的分子 量尺寸而進行了電泳實驗。其結果如圖1所示。從圖1得知，分子量尺寸隨著發酵進度而 變小，進而變成容易被人體吸收的尺寸。
[0071] 〈比較例1>利用酶製備鹿茸水解物
[0072] 利用粉碎機粉碎乾燥的鹿茸1 kg。在粉碎的鹿茸粉末1 kg添加木瓜蛋白酶 (papain) 10g及蒸餾水5 kg後，在70°C反應8小時，然後水解鹿茸粉末。把水解後的溶液予 以過濾清除未反應固形粉。此時，第一次過濾使用2 μ m過濾器，第二次過濾使用0. 45 μ m 過濾器，第三次過濾則使用〇. 2 μ m過濾器。
[0073] 〈比較例2>利用熱水提取製備鹿茸提取物
[0074] 利用粉碎機粉碎乾燥的鹿茸1 kg。把粉碎的鹿茸粉末1 kg添加到蒸餾水5L後在 100°C提取7小時，然後過濾。此時，第一次過濾使用2 μ m過濾器，第二次過濾使用0. 45 μ m 過濾器，第三次過濾則使用〇. 2 μ m過濾器。
[0075] 〈實驗例1>生理活性物質的分析
[0076] 1)氮總量及胺基酸
[0077] 針對上述實施例1及比較例1、2中最後得到的鹿茸提取物的氮總量進行了分析。 結果如下列表1所示。
[0078] 表 1
[0079] 項目胺基酸分析結果
[0080] 實施例1比較例1比較例2
[0081] 氮總量 8· 78 0· 78 0· I5
[0082] (氮總量及胺基酸分析）
[0083] 如上述表1所示，與現有方法得到的鹿茸提取物（比較例1及2)相比，本發明的 發酵鹿茸分子膠囊的氮總量與胺基酸含量增加了幾倍到幾十倍。
[0084] 2)生理活性物質分析
[0085] ①蛋白質定量分析
[0086] 在100ug/ml的標準牛血清白蛋白（BSA)溶液取出20、40、60、80、100ul後混合適 當量的蒸餾水（各為780、760、740、720、700ul)及200ul的蛋白質驗證染料後製成lml，在 595nm利用UV分光光度計對其測量了吸收度。把試料溶解到蒸餾水並混合蛋白質驗證染料 製成lml，在595nm利用UV分光光度計對其測量吸收度並且以對於BSA的含有量計算後決 定含量。
[0087] ②糖羰酸定量分析（Carbazole assay)
[0088] 把D-葡萄糖醒酸內酯作為標準物使用並且憑藉咔唑（carbazole)反應在530nm 利用UV分光光度計測量了吸收度。
[0089] 把試料溶解在蒸餾水並且憑藉咔唑反應在530nm利用UV分光光度計測量吸收度， 以對於D-葡萄糖醛酸內酯的含有量計算後決定含量。
[0090] ③葡萄糖胺聚糖（glycosaminoglycan)定量分析（Carbazole assay)
[0091] 把NZP硫酸軟骨素作為標準物使用並且憑藉咔唑反應在530nm利用UV分光光度 計測量了吸收度。
[0092] 把試料溶解在蒸餾水並且憑藉咔唑反應在530nm利用UV分光光度計測量吸收度， 以對於NZP硫酸軟骨素的含有量計算後決定含量。
[0093] ④唾液酸定量分析（Warren assay)
[0094] 把N-乙醯神經氨酸作為標準物使用並且憑藉Warren方法在549nm利用UV分光 光度計測量了吸收度。
[0095] 在80°C以0. 1N硫酸水解試料1小時，然後憑藉Warren方法在549nm利用UV分光 光度計測量吸收度，以對於N-乙醯神經氨酸的含有量計算後決定含量。
[0096] ⑤利用酶分解硫酸軟骨素
[0097] 把源於普通變形桿菌（Proteus vulgaris)的軟骨素酶ABC(chondroitinase ABC) (C2905, Sigma)溶入 50mM Tris-HC160mM 乙酸鈉緩衝劑（pH8. 0)而成為 lU/ml。以 NZP CS 作為標準物使用，把標準物與樣品溶解成l〇mg/ml後與緩衝劑混合，添加酶30mU，在37°C讓 其反應12小時並分析硫酸軟骨素的含有量。
[0098] ⑥EGF的分析
[0099] 為了分析EGF，針對鹿茸熱水提取物、水解物、發酵提取物進行了人的EGF特異 ELISA。為了製作標準曲線而在250pg/ml?0pg/ml濃度區段通過線性回歸分析選擇具備 先線性性的濃度區段，在該區段把3種試料各自適用於試驗後進行了吸收度分析。並且憑 此分析了基於標準EGF的濃度的試料EGF。
[0100] ⑦神經節苷脂的定量分析（zig-zag TLC scanner)
[0101] 把神經節苷脂標準物（Sigma Co.)溶解在甲醇後，通過TLC法展開後利用zig-zag TLC掃描器在波長550nm掃描得到RfO. 39與0. 42的最大積分值，憑此製作校正曲線。
[0102] 之後，按照和標準品方法相同的方法施於各試料並且從RfO. 39與0. 42的最大積 分值對各試料的神經節苷脂類進行了定量分析。
[0103] 利用上述分析法針對熱水提取、水解、發酵提取分子膠囊進行了生理活性物質的 分析並且將其結果列在下述表2。
[0104] 表 2
[0105] 成分試料蛋白質唾液酸GAG糖羰酸硫酸軟骨素 EGF(y g/g)神經節苷脂
[0106] 熱水提取 52. 2 0· 023 5. 83 0· 245 25. 6 0· 000245. 83
[0107] 水解 68. 4 0· 015 2. 67 0· 171 35. 3 - 2. 67
[0108] 發酵鹿茸分子膠囊 75. 8 0· 032 9. 35 0· 374 78. 6 0· 000579. 35
[0109] (各鹿茸提取物的生理活性物質分析）單位（mg/g)
[0110] 如上述表2所示，相比於熱水提取、水解的鹿茸提取物，通過發酵提取並將其分子 膠囊化時含有大量生理活性物質。
[0111] 〈實施例3>神經節苷脂的穩定性試驗
[0112] 針對作為鹿茸的代表性生理活性物質的神經節苷脂進行了熱、酸穩定性試驗。但， 由於上述表2中基於水解的神經節苷脂含量最低而在比較實驗中排除在外，在實施例1、比 較例2及實施例1中針對以沒有進行分子膠囊發酵提取方法製造的鹿茸在80°C保管4星期 的溫度嚴酷條件及在PH1保管4星期的酸嚴酷條件下測量了神經節苷脂的變化量。圖2與 圖3是其結果。
[0113] 從圖2的結果得知，以高溫進行熱水提取的鹿茸會隨著時間經過而大幅減少神經 節苷脂含量，提取溫度相對較低的發酵則比熱水提取具有較高的神經節苷脂含量，但也會 減少。然而，分子膠囊化的鹿茸的神經節苷脂含量則即使經過了較長時間其含量依然與初 始狀態沒有多少差異。
[0114] 從圖3的結果得知，以高溫進行熱水提取的鹿茸在強酸條件下隨著時間經過而大 幅減少神經節苷脂含量，提取溫度相對較低的發酵則比熱水提取具有較高的神經節苷脂含 量，但也會減少。然而，分子膠囊化的鹿茸的神經節苷脂的含量則即使經過了較長時間其含 量依然與初始狀態沒有多少差異。
[0115] 〈實施例4>發酵鹿茸分子膠囊的抗炎活性試驗
[0116] 1)試料：發酵鹿茸分子膠囊
[0117] 2)動物
[0118] 實驗動物方面，讓採購自大韓實驗動物中心的Balb/c系小鼠在實驗室環境適應1 星期後應用於實驗。動物飼育室的條件採取了通常的系統，在22±2°C條件下，在一天中的 12小時利用200-300LUX照明，12小時則遮蔽一切光線。為動物供應了足夠的固形飼料（粗 蛋白質22. 1 %以上，粗脂肪8. 0%以下，粗纖維5. 0%以下，粗灰分8. 0%以下，鈣0. 6%以 上，磷0.4%以上，三養社，沒有添加抗生素）與水。
[0119] 3)試劑及設備
[0120] 在本實驗所用試劑中，脂多糖類（LPS)使用Sigma(Sigma Co.，USA)產品，生理鹽 水使用 JW 製藥產品，IL-1 β，IL-6, TNF- a，MCP-1ELISA kit 使用 Millipore 公司（USA)產 品，其它試劑則使用優級純。本實驗所用設備則使用了離心分離器（Beckman Co.，USA)、 滾輪混合器（Gowon scientific technology C。·，Korea)、潤流混合器（vortex mixer) (Vision scientific Co.，Korea)、Luminex (Millipore，Co.，USA)等。
[0121] 4)實驗方法（in vivo實驗）
[0122] 在源於脂多糖類（LPS)的炎症小鼠模型及細胞因子測量用正常組，每隻口服投藥 鹽水200ul，發酵鹿茸分子膠囊劑量組則利用口服用針（oral zonde)按照一天一次的方式 對每隻小鼠口服投藥200mg、100mg/kg共7天。7天後，把脂多糖類（LPS) 1 mg / kg注射到 腹腔並且在60分鐘後利用乙醚麻醉，以心臟穿刺法採血。採血後分離血清並且以ELISA法 測量IL-1 β、IL-6、TNF- a、MCP-1的生成量。在各個孔（well)分注小鼠血清100 μ 1 (稀 釋1/100)後，處理抗體-蛋白生物素（Biotin)結合（conjugate)的100 μ 1，在室溫放置 2小時後，利用清洗緩衝溶液清洗2次後處理抗體抗生物素蛋白-HRP結合（conjugate) 的100 μ 1，在室溫放置2小時後重新清洗。在這裡各自分注TMB底物100 μ 1並且放置 於母牛30分鐘，然後處理100 μ 1的stop溶液後利用ELISA判讀器在450nm測量吸收度 (absorbance)〇 ·
[0123] 5)統計處理
[0124] 通過各種實驗得到的結果則以平均土標準偏差予以記錄，顯著性驗證則利用學 生檢驗（Student' st-test)分析方法決定。
[0125] 6)結果
[0126] 6-1) IL-6
[0127] 在7天內為BALB/c小鼠投入發酵鹿茸分子膠囊，然後從源於LPS的急性 炎症模型分離血清後測量IL-6的結果為，正常組為123. 2±35. 7(pg/ml)，對照組為 544.6±37. l(pg/ml)，發酵鹿茸分子膠囊100劑量組為301.6±56. 7(pg/ml)，發酵鹿茸分 子膠囊200劑量組為212. 2±9. 8(pg/ml)，對照組相比於正常組顯著地增加，在發酵鹿茸分 子膠囊劑量組則相比於對照組呈濃度依賴性地顯著0*P〈〇. 〇1，***Ρ〈〇. 001)減少。圖4是 其結果。
[0128] 6-2)MCP-l
[0129] 在7天內為BALB/c小鼠投入發酵鹿茸分子膠囊，然後從源於LPS的急性炎 症模型分離血清後測量MCP-1的結果為，正常組為124. 1±25. 2(pg/ml)，對照組為 418. 2±88. 1 (pg/ml)，發酵鹿茸分子膠囊100劑量組為214. 8±31. 1 (pg/ml)，發酵鹿茸分 子膠囊200劑量組為198. 2±22. 6 (pg/ml)，對照組相比於正常組顯著地增加，在發酵鹿茸 分子膠囊劑量組則相比於對照組呈濃度依賴性地顯著（*P〈〇. 05, **p〈0. 01)減少。圖5是 其結果。
[0130] 6-3) IL-lb
[0131] 在7天內為BALB/c小鼠投入發酵鹿茸分子膠囊，然後從源於LPS的急性炎症模型 分離血清後測量IL-lb的結果為，正常組為25. 6 ±5. 6 (pg/ml)，對照組為116. 8 ±8. 6 (pg/ ml)，發酵鹿茸分子膠囊100劑量組為61. 2± 11. 1 (pg/ml)，發酵鹿茸分子膠囊200劑量組 為51. 6±9. 2 (pg/ml)，對照組相比於正常組顯著地增加，在發酵鹿茸分子膠囊劑量組則相 比於對照組呈濃度依賴性地顯著（#P〈〇. 01，*#P〈〇. 001)減少。圖6是其結果。
[0132] 6-4) TNF-a
[0133] 在7天內為BALB/c小鼠投入發酵鹿茸提取粉末，然後從源於LPS的急性炎 症模型分離血清後測量TNF-a的結果為，正常組為131.4±36.0(pg/ml)，對照組為 397. 0±91. 1 (pg/ml)，發酵鹿茸分子膠囊100劑量組為311. 4±54. 5 (pg/ml)，發酵鹿茸分 子膠囊200劑量組為143. 2±32. 5 (pg/ml)，對照組相比於正常組顯著地增加，在發酵鹿茸 分子膠囊劑量組則相比於對照組呈濃度依賴性地顯著***P〈〇. 001)減少。圖7是其結果。
[0134] 產業上的用途
[0135] 本發明利用最接近大自然的發酵方法提取鹿茸，能夠減少鹿茸的生理活性物質的 破壞、增加有效成分的含量、提高生產性，因此該方法可以有效地作為各種領域中所使用的 鹿茸提取物製備方法。尤其是，由於本發明系統性地闡釋了抗炎活性而非常適合廣泛地應 用在食品、化妝品等用途。
【權利要求】
1. 一種由鹿茸製造鹿茸發酵提取物的方法，其包括下列步驟： 步驟1，在細切的鹿茸添加精製水並進行熱水提取及過濾； 步驟2,步驟1中得到的液相成分，對細切的鹿茸每100重量份添加10到30重量份的 芽孢桿菌菌株培養液，在30到40°C發酵2到3天後得到第一發酵提取液；及 步驟3,在步驟1中得到的鹿茸渣滓上添加精製水後，對細切的鹿茸每100重量份添加 10到30重量份的麴黴菌株培養液，在50到70°C發酵2到3天後得到第二發酵提取液。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於， 還包括下列步驟，在選自上述第一發酵提取液、第二發酵提取液、第一發酵提取液及第 二發酵提取液的混合物所構成的群之一個以上添加包合配合物，然後攪拌而予以分子膠囊 化。
3. 根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於， 在上述步驟1中，在細切的鹿茸每100重量份添加200到500重量份的精製水，在80 至lj 100°C進行熱水提取。
4. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於， 芽孢桿菌菌株培養液包含乳酪芽孢桿菌（Bacillus casei)。
5. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於， 麴黴菌株培養液包含酪麴黴（aspergilluscasei)。
6. 根據權利要求2所述的方法，其特徵在於， 在選自第一發酵提取液、第二發酵提取液、第一發酵提取液及第二發酵提取液的混合 物所構成的群之一個以上，對該混合物每100重量份添加20到30重量份的包合配合物後， 在60到70°C攪拌，將其緩緩冷卻到常溫而實現分子膠囊化。
7. 根據權利要求8所述的方法，其特徵在於，包合配合物選自環糊精、冠醚、聚氧化烯、 prophorine、聚娃氧燒、phophazene及沸石所組成的群。
8. -種配合物，其特徵在於， 由對細切鹿茸進行熱水提取後得到的液相成分上添加芽孢桿菌菌株培養液並發酵而 得到的發酵提取液與包合配合物形成。
9. 一種配合物，其特徵在於， 由對細切鹿茸進行熱水提取後得到的固形鹿茸粉上添加麴黴菌株培養液並發酵而得 到的發酵提取液與包合配合物形成。
10. -種配合物，其特徵在於， 由對細切鹿茸進行熱水提取後得到的液相成分上添加芽孢桿菌菌株培養液並發酵而 得到的發酵提取液、對細切鹿茸進行熱水提取後得到的固形鹿茸粉上添加麴黴菌株培養液 並發酵而得到的發酵提取液的混合物、及包合配合物所形成。
11. 根據權利要求8到權利要求10之任何一項所述的配合物，其特徵在於， 包合配合物選自環糊精、冠醚、聚氧化烯、prophorine、聚娃氧燒、phophazene及沸石所 組成的群。
12. -種鹿茸發酵提取物，其特徵在於， 其為由權利要求2得到的生成物或將權利要求10到權利要求12中任一項所述的配合 物予以高壓滅菌後得到的液相型的鹿茸發酵提取物。
13. -種鹿茸發酵提取物，其特徵在於， 其為由權利要求2得到的生成物或將權利要求10到權利要求12中任一項所述的配合 物予以高壓滅菌並將其凍幹而得到的粉末型鹿茸發酵提取物。
14. 根據權利要求8或權利要求10之任何一項所述的配合物，其特徵在於， 上述芽孢桿菌菌株培養液所含發酵菌株是選自乳酪芽孢桿菌（Bacilluscasei，受託編 號KACC91310P )、枯草芽孢桿菌（B. subtilis)、納豆芽孢桿菌（B. natto)、短芽孢桿菌（B. brevis)中的某一個。
15. 根據權利要求9或權利要求10之任何一項所述的配合物，其特徵在於， 上述麴黴菌株培養液所含發酵菌株是選自酪麴黴（aspergilluscasei)、米麴黴（A. oryzae)、黑麴黴（A. niger)、灰綠麴黴（A. glaucus)，尤其是黑麴黴（aspergillusniger) 中的某一個。
16. -種功能性健康食品，其特徵在於， 把選自 權利要求1或權利要求2所製造的鹿茸發酵提取物、 權利要求8到權利要求10之任一項的配合物、 通過權利要求2得到的生成物、或將權利要求10到權利要求12之任一項的配合物予 以高壓滅菌而得到的液相型鹿茸發酵提取物、及 通過權利要求2得到的生成物、或將權利要求10到權利要求12之任一項的配合物予 以高壓滅菌並予以凍幹後得到的粉末型鹿茸發酵提取物的一個以上作為有效成分而包含。
17. -種功能性化妝品，其特徵在於， 把選自 權利要求1或權利要求2所製造的鹿茸發酵提取物、 權利要求8到權利要求10之任一項的配合物、及 通過權利要求2得到的生成物、或將權利要求10到權利要求12之任一項的配合物予 以高壓滅菌並予以凍幹後得到的粉末型鹿茸發酵提取物的一個以上作為有效成分而包含。
【文檔編號】A61K35/32GK104105492SQ201280058853
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2012年10月19日 優先權日:2011年10月20日
【發明者】鄭昌暉, 崔學柱, 金東熙 申請人:株式會社美萊德可利亞, 鄭昌暉