從木豆根中分離純化cajanol的方法
2023-05-03 00:46:16 1
專利名稱：從木豆根中分離純化cajanol的方法
技術領域：
本發明涉及從植物中提取、分離和純化活性成分的方法，具體是從木豆新鮮或乾燥的根莖中提取、分離和純化cajanol。
背景技術：
Cajanol屬於黃酮類化合物，是一種良好的抗菌劑同時又有抗癌的效果。它對表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、變形桿菌、綠膿桿菌都具有較強的抗性，可以通過損害DNA來抑制大腸桿菌，而對金黃色葡萄球菌的抗菌作用主要是通過作用於膜上的卵磷脂、磷酸鹽和DNA來抑制金黃色葡萄球菌增長(Liu Xiao-Iei 2010)。另夕卜，cajanol還可以在體外抑制革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌生長。除了抗菌效果以 夕卜，cajanol還有較強的抗癌效果，cajanol可以對MCF-7細胞表現出抗性，同時表現出濃度依賴，cajanol使MCF-7細胞存活率下降，導致細胞阻滯於G2/M期，並誘導細胞凋亡，Cajanol誘導的細胞凋亡通過線粒體依賴性途徑，包括抑制Bcl-2的表達和Bax的表達誘導desintegrate線粒體膜外,並導致細胞色素c釋放。因此,cajanol作為一種潛在的藥用成分具有良好的開發前景。根據我們目前的研究發現，cajanol僅存在於木豆根中，並且含量較聞。木豆是為豆科木豆屬一年生或多年生木本植物、常綠灌木。又名鴿子豆、樹黃豆等，是一種民間用藥。《陸川本草》記載木豆葉「平、淡、有小毒」。《中華藥海》對此作了進一步說明木豆葉「平、淡、有小毒、入心徑」，主治小兒水痘、痛腫。另外木豆還有有清熱解毒、補中益氣、利水消食、止血止痢、散癖止痛、排痛腫之效。然而，目前對於木豆的研究集中在對木豆葉的研究，對木豆根的研究卻報導較少，許多木豆根的藥用價值沒有得到體現。綜上所述，cajanol是一種活性較好的黃酮類物質，其良好的抗菌活性和抗腫瘤活性，使其極有可能成為一種潛在的藥用成分。但是，到目前為止對於cajanol的提取、分離和純化工藝尚未見報導，同時，大量的木豆根資源都被當做農業廢棄物燃燒掉，不僅消耗了資源還破壞了環境。因此，本發明旨在建立一種通過多種現代分離純化技術結合，快速高效的分離cajanol的方法，使木豆根的資源得到合理高效的利用，充分發揮木豆根的價值，並且得到高純度的cajanol樣品為科研和工業生產提供原料。
發明內容
本發明的目的在於提供一種以木豆新鮮或乾燥的根莖為原料，通過勻漿誘導技術、酶誘導技術、溶劑提取技術、超聲波振蕩絮凝技術、負壓空化混懸液固萃取技術、大孔吸附樹脂富集技術、正相矽膠中壓柱層析分離技術及低溫析晶和重結晶技術，從而大量、快速獲得cajanol單體，該方法簡單易行、目標化合物損失少。本發明的目的是通過以下方案來達到的木豆新鮮或乾燥的根經過水勻漿體系誘導、酶水解，可提高cajanol含量，後經60-85%乙醇溶劑提取，提取物加入水在30-45°C超聲波振蕩、靜止絮凝，所得到絮凝物經負壓空化混懸液固萃取、大孔樹脂法富集和一次正相矽膠中壓柱層析後得到cajanol的產品，純度大於80%，經過低溫析晶和重結晶得到純度大於95%的純品。上述的cajanol提取純化方法，其特徵在於，取一定量的新鮮或乾燥的木豆根加入水，溫度30-45°C，體積為固體質量的3-8倍，連續勻漿誘導3次，每次1_10分鐘；在提取過程中使用酶對新鮮或乾燥木豆根進行誘導水解；將勻漿誘導後的漿液用檸檬酸、冰醋酸或鹽酸調PH為3. 0-6. 0 ;取0. 2-2%固形物重量的纖維素酶、果膠酶、葡萄糖苷酶的任意兩種或三種組成複合酶，溶於PH 為3. 0-6. 0的緩衝液中，在50-60°C水浴中激活8_15分鐘；將激活後的複合酶緩衝液加入勻漿誘導漿液中，在溫度為30-50°C的水浴上酶解3-6小時；乙醇提取液所提物質為勻漿誘導和酶誘導後的固形物，提取方法選自超聲波輔助提取、冷浸提取、超臨界CO2提取或微波輔助提取，誘導後固形物使用60-85%乙醇提取，誘導液及乙醇提取液合併濃縮後，木豆根提取物中加入水，將提取物加入3-6倍體積的40-50°C溫水，於超聲波振蕩提取器中50-60KHZ條件下振蕩絮凝15-30分鐘，靜止15-30分鐘，超聲波的震蕩作用使得粘稠絮凝物中包含的極性較大的雜質逐漸溶出，絮凝物富集了提取液中90 99%的cajanol。得到絮凝物，以0. 03-0. 06MPa負壓為動力用有機溶劑進行負壓空化混懸液固萃取，每克粗提物加入萃取溶劑5mL-20mL,萃取次數為5_8次,所用溶劑為乙酸乙酯、三氯甲烷或二氯甲烷中的一種，有機相回收溶劑後可得目標固形物；濃縮萃取液至幹，得到的固形物以20-30%乙醇混懸，配置成料液濃度為2-4mg/mL混懸藥液，同時將大孔吸附樹脂採用溼法裝柱，保留液面，將混懸的藥液通過吸附柱，上樣量0. 5-1BV,以流速為每小時6-8mL/g樹脂、pH = 5條件下過吸附柱。吸附後用30-40%乙醇3BV洗雜質，然後用50-60%乙醇8-10BV解吸。收集解析液，濃縮至幹得到固形物。預先稱取質量為提取物質量的5-10倍的矽膠，採用溼法裝柱，所用溶劑除石油醚外，還包括正己烷。將所得固形物用少量有機溶劑溶解，加入與浸膏質量比為I : I. 2的層析矽膠拌勻、減壓旋幹，裝入正相矽膠中壓柱。先後以10-20BV石油醚、石油醚乙酸乙酯=10 I、石油醚乙酸乙酯=5 I、甲醇連續中壓洗脫連續中壓洗脫，收集洗脫液，每份1/40-1/20BV。TLC監測收集流分，合併相同部分，展開劑為石油醚乙酸乙酯=10 1-2 I,紫外波長為254nm和365nm。得到cajanol溶液，低溫析晶得到產品，重結晶後得到純品。上述的木豆中cajanol的提取純化方法所用的大孔吸附樹脂為D101、NKA-9、NKA-2、AB-8、AL-9、H103、ADS-7、ADS-8、ADS-17 或 ADS-21。本發明的優點I.本發明以在農業生產中大都被廢棄的新鮮或者乾燥木豆根為原料，提高了木豆這種農業植物的使用價值，合理的利用了資源，對於木豆的開發和利用有著積極和深遠的意義。2.發明中採用先進的勻漿誘導技術、酶水解技術、溶劑提取技術、超聲波振蕩絮凝技術、負壓空化混懸液固萃取技術、大孔吸附樹脂富集技術、正相矽膠中壓柱層析分離技術及低溫析晶和重結晶技術用於cajanol的誘導和提取分離，所得產品得率高、純度高。3.本發明所用方法科技含量高，周期短，有機溶劑用量少，對環境汙染小，能耗低，成本低，同時,本發明可實現大規模產業化生產。
圖I為cajanol的結構圖2為分離純化流程圖
具體實施例方式實例I稱取木豆乾燥根lOOOg，進行初步粉碎，加入8倍體積的40°C溫水後連續勻漿誘導3次，每次5分鐘，將勻漿誘導好的漿液用冰醋酸調pH為4. O ;取0. 5%固形物重量的纖維素酶、果膠酶、葡萄糖苷酶按照質量比I : I : I組成的複合酶，溶於PH為4. O的緩衝液中，在40°C水浴中激活8分鐘；將激活後的複合酶緩衝液加入勻漿誘導漿液中，在溫度為45°C的水浴上酶解6小時。誘導液分離後固形物使用70%乙醇提取，誘導液及乙醇提取液合併濃縮後將提取物加入40°C溫水中，體積為4. 5L，於超聲波提取器中50-60KHZ條件下振蕩絮凝20分鐘，靜止15分鐘，取絮凝物，以O. 05MPa負壓為動力用13. 5L乙酸乙酯進行負壓 空化混懸液固萃取，濃縮萃取液，以30%乙醇配置成料液濃度為4mg/mL混懸藥液，上樣量
O.8BV,流速為每小時8mL/g樹脂、pH = 5條件下過NKA-9型大孔過吸附樹脂柱。吸附後用30%乙醇3BV洗雜質，然後用50%乙醇IOBV解吸。收集解吸液，濃縮至幹後用少量甲醇溶解，加入與浸膏質量比為I : I. 2的目數為500-800的層析矽膠拌勻、50°C減壓蒸乾。預先稱取提取物質量7倍的500-800目矽膠，採用石油醚溼法裝柱，將拌好樣品的矽膠裝入中壓柱內，先後以15BV石油醚、石油醚乙酸乙酯=10 I、石油醚乙酸乙酯=5 I、甲醇連續中壓洗脫連續中壓洗脫，TLC監測收集流分，濃縮得到cajanol粗品，以石油醚乙酸乙酯=5 I的混合溶劑在15°C下結晶，到化合物為cajanol，43. 21mg，純度為95%。實例2稱取新鮮的木豆根2000g，初步粉碎，加入6倍體積的45°C溫水後連續勻漿誘導3次，每次3分鐘，將勻漿誘導好的漿液用冰醋酸調pH為4. 5 ;取0. 4%固形物重量的纖維素酶、果膠酶、葡萄糖苷酶按照質量比I : I : I組成的複合酶，溶於PH為4. 5的緩衝液中，在45°C水浴中激活8分鐘；將激活後的複合酶緩衝液加入勻漿誘導漿液中，在溫度為45°C的水浴上酶解6小時。誘導液分離後固形物使用70%乙醇提取，誘導液及乙醇提取液合併濃縮後將提取物加入40°C溫水中，體積為4. 5L，於超聲波提取器中50-60KHZ條件下振蕩絮凝15分鐘，靜止15分鐘，取絮凝物，以0. 055MPa負壓為動力用10L乙酸乙酯進行負壓空化混懸液固萃取，濃縮萃取液，以30%乙醇配置成料液濃度為4. 5mg/mL混懸藥液，上樣量
0.8BV，流速為每小時8mL/g樹脂、pH = 5條件下過AB-8型大孔過吸附樹脂柱。吸附後用30%乙醇3BV洗雜質，然後用50%乙醇10BV解吸。收集解吸液，濃縮至幹後用少量甲醇溶解，加入與浸膏質量比為I : I. 2的目數為500-800的層析矽膠拌勻、50°C減壓蒸乾。預先稱取提取物質量8倍的500-800目矽膠，採用石油醚溼法裝柱，將拌好樣品的矽膠裝入中壓柱內，先後以15BV石油醚、石油醚乙酸乙酯=10 I、石油醚乙酸乙酯=5 I、甲醇連續中壓洗脫連續中壓洗脫，TLC監測收集流分，濃縮得到cajanol粗品，以正己烷乙酸乙酯=2 I的混合溶劑在20°C下結晶，得到化合物為cajanol，38. 75mg，純度為97%。
權利要求
1.從木豆根中分離和純化cajanol的方法,包括以下步驟 (1)誘導和酶水解將木豆根通過勻漿誘導技術誘導，再經過酶水解技術水解以增加游離的cajanol的含量； (2)提取誘導和水解後的固體物質通過60-85%乙醇提取，誘導和水解液及乙醇提取液合併濃縮後加入40-50°C的水超聲波振蕩絮凝，靜止，得到絮凝物，將絮凝物經有機溶劑負壓空化混懸液固萃取； (3)分離將萃取得到溶液濃縮後通過大孔吸附樹脂進行富集和一次正相矽膠中壓柱層析後得到cajanol的粗製品； (4)結晶^fcajanol的粗製品經過低溫析晶和重結晶得到純度大於95%的純品。、
2.按照權利要求I所述的從木豆根中分離和純化cajanol的方法，其特徵在於步驟(I)所述的木豆根來源於海南產木豆的新鮮或乾燥的根部，經過粉碎處理。
3.按照權利要求I所述的從木豆根中分離和純化cajanol的方法，其特徵在於步驟(1)所述的勻漿誘導技術，所用的溶劑為水，溫度30-45°C，體積為固體質量的3-8倍，連續勻漿誘導3次，每次1-10分鐘；步驟(I)所述的酶水解技術，首先將勻漿誘導後的漿液用檸檬酸、冰醋酸或鹽酸調PH為3. 0-6. 0，然後取0. 2-2%固形物重量的纖維素酶、果膠酶和葡萄糖苷酶中的任意兩種或三種組成的複合酶，溶於pH為3. 0-6. O的緩衝液中，在50-60°C水浴中激活8-15分鐘；將激活後的複合酶緩衝液加入勻漿誘導漿液中，在溫度為30-50°C的水浴上酶解3-6小時。
4.按照權利要求I所述的從木豆根中分離和純化cajanol的方法，其特徵在於步驟(2)所述的乙醇提取液，乙醇提取液所提物質為勻漿誘導和酶水解後的固形物，提取方法選自超聲波輔助提取、冷浸提取、超臨界CO2提取、微波輔助提取，所用溶劑為60-85%乙醇。
5.按照權利要求I所述的從木豆根中分離和純化cajanol的方法，其特徵在於步驟(2)所述的超聲波振蕩絮凝技術，木豆根莖提取物中加入水，溫度40-50°C，體積為提取物質量的3-6倍，超聲波振蕩絮凝時間為15-30分鐘，頻率為50-60KHZ，靜止時間為15-30分鐘。
6.按照權利要求I所述的從木豆根中分離和純化cajanol的方法，其特徵在於步驟(2)所述的負壓空化混懸液固萃取技術，對絮凝物進行負壓空化混懸液固萃取，所用有機溶劑為乙酸乙酯、三氯甲烷或二氯甲烷中的一種，每克粗提物加入萃取溶劑5mL-20mL，萃取次數為5-8次，所用壓力為0. 03-0. 06MPa，有機相回收溶劑後可得目標固形物。
7.按照權利要求I所述的從木豆根中分離和純化cajanol的方法，其特徵在於步驟(3)所述的大孔吸附樹脂富集方法，所用樹脂選自DlOl、NKA-9、NKA-2、AB_8、AL_9、H103、ADS-7、ADS-8、ADS-17或ADS-21大孔吸附樹脂，該方法中大孔樹脂吸附步驟採用溼法裝柱，保留液面，將負壓空化混懸液固萃取所得到的固形物部分用20-30%乙醇溶液配製成料液濃度為2-4mg/mL混懸藥液，同時將大孔吸附樹脂採用溼法裝柱，保留液面，將混懸的藥液通過吸附柱，上樣量為0. 5-1BV,以流速為每小時6-8mL/g樹脂、pH = 5條件下過吸附柱；吸附後用30-40%乙醇3BV洗雜質，然後用50-60%乙醇8-10BV解吸；收集解吸液，濃縮至幹，所得固形物為粗目標產物。
8.按照權利要求I所述的從木豆根中分離和純化cajanol的方法，其特徵在於步驟(3)所述的一次性正相矽膠中壓柱層析技術，正相矽膠中壓柱層析所用樣品為樹脂富集後所得固形物，所用矽膠為300-800目；預先稱取質量為樣品量的5-10倍的矽膠，採用石油醚、正己烷或乙酸乙酯溼法裝柱，將樣品用少量甲醇溶解，加入與浸膏質量比為I ;`1.2的層析矽膠拌勻、減壓旋幹，裝入預先裝好的矽膠柱中；先後以10-20BV石油醚、石油醚乙酸乙酯=10 I、石油醚；乙酸乙酯=5 I、甲醇連續中壓洗脫，收集洗脫液，每份`1/40-1/20BV;用矽膠薄層層析檢測洗脫液成分，合併相同部分，展開劑為三氯甲烷；甲醇`=30 1-1 1，紫外 波長為 254nm 和 365nm。
9.按照權利要求I所述的從木豆根中分離和純化cajanol的方法，其特徵在於步驟(4)所述的低溫析晶和重結晶技術，重結晶所用溶劑為石油醚、乙醚或正己烷中的一種與三氯甲烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙睛或甲醇中的一種按照50 1-1 I的比例組成的混合溶劑，低溫析晶溫度為-10°C -25°C。
全文摘要
本發明涉及從木豆根中提取分離純化活性成分cajanol的方法。目的是提供簡便、安全、經濟有效的從木豆根莖中提取分離純化高純度cajanol的方法。本發明所採取的技術方案是以木豆新鮮或乾燥根為原料，採用勻漿誘導技術、酶誘導技術、溶劑提取技術、超聲波振蕩絮凝技術、負壓空化混懸液固萃取技術、大孔吸附樹脂富集技術、正相矽膠中壓柱層析分離技術及低溫析晶和重結晶技術等得到精製的cajanol，純度達95％以上。該方法的原料豐富易得，工藝簡單易行，得率高，純度高，產品附加值高，適用於工業化生產。
文檔編號C07D311/40GK102731460SQ20111009156
公開日2012年10月17日 申請日期2011年4月13日 優先權日2011年4月13日
發明者付玉傑, 張東陽, 祖元剛 申請人:東北林業大學, 付玉傑