通過添加銅離子來使植物轉化效率提高的方法

2023-05-03 01:45:51 2

專利名稱：通過添加銅離子來使植物轉化效率提高的方法
技術領域：
本發明是關於通過土壤桿菌屬細菌來高效地進行將基因導入到植物材 料中的方法。
背景技術：
根據土壤桿菌法的基因導入，是利用土壤桿菌機能的植物轉化方法。土 ;裡細菌土i裡桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)具有下列才幾能感染植物時，使 作為與土壤桿菌病原性相關的Ti(tumor-inducing)質粒的一部分的T-DNA重 組到植物基因組中。根據土壤桿菌法的植物轉化方法是下述方法製備將 Ti質粒的T-DNA結構域置換為希望向植物染色體組中導入的基因的轉化用 質粒，使用製備成具有該轉化用質粒代替了 Ti質粒的土壤桿菌，通過利用 土壤桿菌的上述機能，將希望向該植物染色體組中導入的基因導入到植物染 色體組中的方法。
由於認為土壤桿菌僅以雙子葉植物為宿主，並不寄生在單子葉植物中， 當初，根據土壤桿菌法的植物轉化法主要是作為雙子葉植物轉化法來發展 的。之後，進行了關於根據土壤桿菌法向單子葉植物進行基因導入的各種各 樣的嘗試，開發了具有強病原性土壤桿菌 一部分病原性基因的超級雙元載體 (super binary vector),據報告，在使用該超級雙元載體的方法中，在水稻、 玉米等單子葉植物中也穩定，可以效率比較高的進行轉化(例如參考特許
第2, 649， 287號公報;特許第3， 329, 819號公報;Hiei,Y.,等，(1994),The Plant Journal, Vol.6,p.271-282;以及Ishida,Y.,等,(1996),Nature Biotechnology, Vol.4,p.745-750)。而且，報導了根據土壤桿菌法也在小麥、大麥以及高梁這 樣的單子葉植物中轉化的成功例子(例如參考Cheng, M.,等，(1997), Plant Physiol" Vol.115, p.971-980; Tingay，S"等,(1997),Plant J" Vol. 11,p. 1369-1376;以 及Zhao, Z-Y.,等,(2000),Plant Mol.Biol.， Vol.44， p.789-798),達到了在單子葉植物中也可廣泛進行根據土壤桿菌法的轉化。
根據土壤桿菌法的轉化法， 一般的具有效率高，被導入的基因複製數
少，不用將叫做T-DNA的特定結構域片斷化就可導入，因為通過短期培養 就可獲得轉化體所以培養變異少等很多優異的特徵。因此，現在它作為在不 論雙子葉還是單子葉的很多種類的植物中最有用的轉化手段而廣泛應用。
根據土壤桿菌法的轉化方法，根據植物種類，受試材料、培養的培養基 的組成不同，但共同點是不管是哪種植物，都是使組織材料與土壤桿菌懸 濁液接觸，在共存培養後，進行轉化細胞的篩選，製備出轉化植物。 一般地， 形成材料的植物組織，視需要進行滅菌處理，但除此之外沒有特別的處理， 進行土壤桿菌的感染(例如參考Rogers,S，G.，等,(1988), Method for Plant Molecular Biology, p.423-436,CAAcademic Press Inc.;Visser，R.G.F., (1991), Plant Tissue Culture Manual, B5:l-9, Kluwer Academic Publishers; McCormick, S,, (1991), Plant Tissue Culture Manual, B6:l-9, Kluwer Academic Publishers;以 及Lindsey, K.，等(1991)， Plant Tissue Culture Ma畫l， B7:l-13， Kluwer Academic Publishers)。
根據土壤桿菌法的轉化在很多種類的植物中都有報導，但也存在其轉化 效率隨植物的種類、基因型以及形成材料的組織而有很大不同(例如參考 Potrykus, L，等，(1998), Agricultural Biotechnology, NY: Mercel Dekker Inc., p.ll9-159)的問題。在培育導入實用基因的品種時，製備出很多的轉化植物 是必要的，通過一年而高效率地穩定地獲得轉化植物的技術開發是重要的。 還有，不依賴植物的種類或基因型的轉化法，在高效率地培育實用品種方面 是極為有用的。而且，不依賴於形成材料的植物組織的轉化法的開發，也在 高效率地促進轉化方面是必要的。
開發象這樣地使基因導入效率提高的方法、或者是基因導入困難的植物 種類或基因型也能進行轉化的方法是重要的。到現在，為了獲得效率良好的 轉化植物，培養基組成的研究、標記基因或者啟動子的改變、受試材料的研 究、受試材料處理方法的研究等各個側面的很多技術都有報導。例如，在受 試材料的處理方法方面，報導了通過破壞組織結構來提高感染效率的方法， 還有，不破壞組織結構將植物組織離心處理(例如參考國際公開第02/12520 號小冊子；特開2000-342256)、加熱處理(例如參考特開2000-342255;特開2000-342253)的方法等。此外，本發明者們發現了將植物組織加壓處理對 提高基因導入效率是有用的(結果還未發表)。
此外，特別是在單子葉植物中，還存在玉米在根據土壤桿菌法的轉化中 的轉化效率與水稻相比較低的問題。到目前，為了提高根據土壤桿菌法的玉 米轉化中的轉化效率，進行了各種各樣的嘗試(例如參考Negrotto,D.,等， (2000), Plant Cell Reports, Vol.l9,p.798-803;Zhao,Z-Y"等，(2001), Mol. Breed., Vol.8, p.323-333; Frame,B,R.，等，(2002)， Plant Physiol.，VoU29,p.13-22;以及 Ishida,Y"等，(2003), Plant Biotechnology，Vol.l4,p.57-66)。作為為了提高土壤 桿菌法的玉米轉化效率的種種嘗試，進行了在N6基本培養基中的轉化細胞 篩選(例如參考Zhao,Z-Y.,等,(2001)， Mol.Breed., Vol,8，p.323-333)、在培養基 中添加硝酸銀以及羧千西林(例如參考Zhao,Z-Y,等,(2001)， Mol.Breed.， Vol.8，p.323陽333;以及Ishida，Y"等,(2003),Plant Biotechnology，Vol.l4,p.57-66)、 在共存培養基中添加半胱氨酸(例如參考Frame,B.R.,等，(2002)， Plant Physiol.,Vol.l29,p.l3-22)等，但其效果還是較低。對於象玉米這樣的，是主要 穀物而轉化效率低的植物，不只是在製備實用轉化植物的時候、而且在確認 新的基因效果的時候，也希望有轉化效率更高的轉化方法。
硫酸銅作為微量無機鹽存在於植物組織培養的多種培養基中。通常，在
植物組織培養基中含有的硫酸銅的濃度是O.l)iM。近年來，有報導在單子
葉植物的組織培養以及轉化試驗中，通過在培養基中添加比通常高出50-
500倍或500倍以上的硫酸銅顯示出種種效果。Ghaemi們(參考Ghaemi, M.，
等，(1994), Plant Cell,Tissue and Organ Culture,Vo1.36, p.355-359)報導，通過
將小麥的花葯在含有10mg/l的硫酸銅和2.5~5mg/l的硝酸銀的培養基中培
養，提高了胚狀體(embryoid)的形成率。Zhang們(參考Zhang,S.,等，(W99),Plant
Cell Reports, VoU8,p.959-966)報導，通過將由完全成熟的大麥種子發芽的形
成的小苗在含有5pM硫酸銅和30g/l麥芽糖的培養基中培養，提高了苗條
分裂組織培養(shoot meristematic cultures:SMCs)的誘導率。認為麥芽糖在減
少褐變組織方面具有效果，硫酸銅在促進苗條分裂組織培養被誘導時的小苗
發育方面具有效果。此外，在通過將未成熟胚在含有硫酸銅的培養基中培養
而得的愈傷組織中，再分化率和每個愈傷組織的再分化植物數增大，這在大
麥(例如參考Dahleen， L.S.， (1995), Plant Cell,Tissue and Organ Culture, Vol. 43,p.267-269;以及Cho， M-J,等，(1998)， Plant Science, Vo1.138， p.229-244)和水 稻(例如參考Sah畫at， A.K.和Chand, S., (1999), J. Plant Physiol" Vol. 154, p.517-522)中有報告。而且，用含有硫酸銅的培養基誘導的具有綠色再分化 能力的組織，被認為是適合作為轉化材料(例如參考Visser， R.G.F., (1991), Plant Tissue Culture Manual, B5:l-9, Kluwer Academic Publishers; 以及 McCormick, S.， (1991)， Plant Tissue Culture Manual, B6:l-9， Kluwer Academic Publishers)。
Ishida們(參考Ishida,Y.，等,(2003)，Plant Biotechnology，Vol.l4，p.57-66)將接
種了土壤桿菌、進行了共存培養的玉米(品種是H99)未成熟胚，在含有1~ 100nM硫酸銅的培養基中培養，考察從未成熟胚形成的愈傷組織。用含有 1 ~ 10 p M硫酸銅的培養基，愈傷組織形成率提高，但其效果很微弱。
象上述那樣通過在培養基中添加高濃度的硫酸銅，在單子葉植物的組織 培養中可見種種效果的情況有所報導。然而，添加含銅離子的金屬鹽對基因
導入效率以及/或轉化效率帶來的效果的調查報告，現在還沒有。 專利文獻l:特許第2，649,287號乂>淨艮 專利文獻2:特許第3,329,819號公報 專利文獻3:國際公開第02/12520號小冊子 專利文獻4:特開2000-342256 專利文獻5:特開2000-342255 專利文獻6:特開2000-342253 專利文獻7:美國專利第6,235,529號說明書 專利文獻8:美國專利第6,541,257號說明書 專利文獻9:國際公開第95/06722號小冊子
非專利文獻l: Hiei，Y.,等，(1994)， The Plant Journal, Vol.6， p.271-282. 非專利文獻2: Ishida, Y.,等，(1996), Nature Biotechnology, Vol. 4， p.745-750.
非專利文獻3: Cheng, M.,等，(1997), Plant Physiol.， Vol.115, p.971-980. 非專利文獻4: Tingay, S"等，(1997), Plant J" Vol.11, p.1369-1376. 非專利文獻5: Zhao， Z-Y.，等，(2000)， Plant Mol. Biol" Vol. 44, p.789-798. 非專利文獻6: Rogers, S, G"等，(19S8), Method for Plant MolecularBiology, p.423-436, CA:Academic Press Inc.
非專利文獻7: Vlsser，R.G.R，(1991),Plant Tissue Culture Manual,B5:l-9, Kluwer Academic Publishers.
非專利丈獻8: McCormick,S.,(1991)， Plant Tissue Culture Manual,B6:I誦9， Kluwer Academic Publishers.
非專利文獻9: Lindsey，K.，等(1991), Plant Tissue Culture Manual,B7:l-13， Kluwer Academic Publishers.
非專利文獻10: Potrykus，I.，等,(1998),Agricultural Biotechnology, NY: Mercel Dekker Inc.,p. 119-159.
非專利文獻11: Negrotto，D.，等,(2000),Plant Cell Reports, Vol. 19，p.798-803.
Zhao,Z-Y"等，(2001), Mol.Breed.， Vol.8，p.323-333. Frame,B.R.,等，(2002), Plant Physiol.,Vol.l29，p. 13-22. Ishida,Y.,等,(2003),Plant Biotechnology, VoU4,p.57-66. Ghaemi,M.，等,(1994)，Plant Cell,Tissue and Organ Culture,
非專利文獻12: 非專利文獻13: 非專利文獻14: 非專利文獻15: Vol.36,p.355-359.
非專利文獻16: Zhang，S"等,(1999),Plant Cell Reports，Vol.l8,p.959-966.
非專利文獻17: Dahleen,L.S"(1995), Plant Cell,Tissue and Organ Culture, Vol.43，p,267-269.
非專利文獻18: Cho,M-J,等,(1998),Plant Science,Vol.l38,p.229-244.
非專利文獻19: Sahrawat,A.K.和Chand,S.,(1999)，J.Plant Physiol., Vol.l54， p.517-522.
非專利文獻20: Trick，H.N.和Finer,J丄,(1997)，Transgenic Research, Vol.6, p.329-336.
非專利文獻21: Amoah，B.，等，(2001), Journal of Experimental Botany, Vol.52，p.ll35-1142.
非專利文獻22: Hoekema,A,等,(1983),Nature，Vo1.303, p.179-180.
非專利文獻23: Komari,T.和Kubo T.,(1999)， Methods of Genetic Transformation:Agrobacteriuni tumefaciens. In Vasil, I.K.(ed.)Molecular improvement of cereal crops.,Kluwer Academic Publishers,Dordrecht,p.43-82.

發明內容
發明所要解決的課題
本發明所要解決的課題在於，開發與現有的通過土壤桿菌屬細菌向植物 中導入基因的方法中的植物基因導入效率相比，更高效率地進行基因導入的 方法。還有，開發與現有的通過土壤桿菌屬細菌向植物中導入基因的方法中 的由植物受試組織的轉化細胞增殖率相比，更高效率地進行轉化細胞增殖的 方法。還有，本發明所要解決的課題在於開發使用前述方法製作出轉化植物 的方法。
解決課題的手段
本發明者們為解決上述問題銳意研究努力的結果是，發現通過使用提高 了金屬鹽濃度的培養基以土壤桿菌屬細菌向植物進行基因導入，與使用含有 通常濃度的金屬鹽的培養基時相比，獲得穩定高效率的基因導入，以及由基 因導入的組織的穩定高效率的細胞增殖。而且，發現使用提高了金屬鹽濃度 的培養基進行基因導入，再加上在使土壤桿菌屬細菌感染植物材料之前，進 行加熱、離心處理的話，獲得穩定更高效率的基因導入。此外，就基因導入 了的植物材料，進一步進行轉化體的篩選，發現使用提高了金屬鹽濃度的培 養基進行基因導入了的植物材料，與使用含有通常濃度的金屬鹽的培養基時 相比，轉化效率飛躍性地提高。
因此，本發明是關於下述方法，其包括
1) 將植物材料進行處理，
2) 使土壤桿菌感染植物材料，
通過土壤桿菌屬細菌來進行將基因導入到植物材料中的方法，其特徵在
於，在上述1)以及/或2)的工序中，使用提高了含銅離子的金屬鹽濃度的培 養基。
在本發明方法中，在培養基中高濃度添加的金屬鹽是含銅離子的金屬 鹽。在本發明中使用的優選金屬鹽是硫酸銅或葡糖酸銅，最優選疏酸銅。闢u 酸銅中包括無水鹽以及含水鹽，不限定於任何一種。
在本發明方法中，所說提高了金屬鹽濃度的培養基是指與作為本領域普 通技術人員熟知的N6基本培養基、MS(LS)基本培養基、B5基本培養基、NN基本培養基、NT基本培養基、Kao的基本培養基、White的基本培養基 等基本培養基中含有的金屬鹽的濃度相比，含有高濃度的金屬鹽的培養基。 所說高濃度是指，比該基本培養基中含有的金屬鹽濃度還要高。
具體地，各基本培養基的金屬鹽濃度例如CuS04 5H20濃度是N6基 本培養基中為0mg/1， MS(LS)基本培養基中為0.025 mg/1， B5基本培養基中 為0.025 mg/1， NN基本培養基中為0.025 mg/1， NT基本培養基中為0.025 mg/1, Kao的基本培養基中為0.025 mg/1, White的基本培養基中為0mg/1， 在以這些基本培養基為基礎製備的培養基中，含有與該培養基中含有的硫酸 銅濃度相比更高濃度的硫酸銅時，該培養基就是提高了金屬鹽濃度的培養 基。
本發明中的所謂含銅離子的金屬鹽是指，在所例舉的基本培養基中，一 般不含有具有銅離子的金屬鹽，或者是含有微量的銅離子的金屬鹽。
列舉優選濃度的例子的話，硫酸銅以及葡糖酸銅是1 ~ 100 nM,優選1 -50 juM，更優選1 ~ IOmM。
在本發明的方法中，使用提高了金屬鹽濃度的培養基的工序是l)製備植 物材料的工序，以及/或2)使土壤桿菌感染植物材料的工序中的任何工序。 優選至少在2)使土壤桿菌感染植物材料的工序中使用提高了金屬鹽濃度的 培養基。更優選至少在2)使土壤桿菌感染植物材料的工序中包含，在共存培 養階段使用提高了金屬鹽濃度的培養基。
在本發明的方法中，為了進一步提高基因導入效率，在製備植物材料的 工序1)、以及/或在使土壤桿菌感染植物材料的工序2)中，也可以還包括對 植物材料進行選自加壓處理、熱處理、離心處理、以及超聲波處理的至少l 種處理。植物材料的加壓處理是將該植物在液體培養基中以1.7 ~ 10atm進行 加壓0.1秒~ 4小時，優選以2.4 ~ 8atm進4亍加壓1秒~ 30分4t。才直物才才津牛 的熱處理可以根據文獻(特開2000-342255;以及特開2000-342253)所述的方 法將植物材料進行處理，例如在33 60。C加熱5秒~24小時，優選在46°C 加熱3分鐘來進行。植物材料的離心處理，可以根據Hiei們的方法(國際公 開第02/12520號小冊子；以及特開2000-342256)將植物材料進行處理，例如 以100G ~ 25萬G離心1秒-4小時，優選以2萬G離心10分鐘來進4亍。 關於超聲波處理，可以根據文獻(例如Trick， H.N.和Finer, J丄，(1997),Transgenic Research, Vol.6, p.329-336; 以及Amoah, B.,等，(2001)， Journal of Experimental Botany, Vol.52, p.ll35-1142.)所述的方法來進行處理。
這些加壓處理、熱處理、離心處理、以及超聲波處理可以任意進行l種， 或者也可以多種組合進行。
本發明的方法，在使土壤桿菌感染植物材料的工序2)之後，還可以包括 以下工序
3) 篩選轉化細胞，
4) 根據期望，將篩選的轉化體進行再分化。
此外，本發明的方法，在使土壤桿菌感染植物材料的工序2)之後，還可 以包括以下工序，而且在以下的至少1個工序中使用提高了含銅離子的金屬 鹽濃度的培養基
3) 篩選轉化細胞，
4) 根據期望，將篩選的轉化體進行再分化。'
本發明的基因導入方法，在提高基因導入效率的同時，提高轉化效率， 其結果是可以高效地得到轉化植物。因此，本發明是關於以使用本發明基因 導入方法為特徵的轉化植物的製造方法。
進一步，本發明者們就轉化植物材料方面發現，通過使用提高了含銅離 子的金屬鹽濃度的培養基使轉化體進行再分化，與使用通常濃度的含銅離子 的金屬鹽的培養基時相比，促進再分化植物的生長。
因此，本發明是關於下述方法，它是進一步包括
1) 製備植物材料，
2) 使土壤桿菌感染植物材料，
3) 篩選轉化細胞，
4) 將篩選的轉化體進行再分化，
以土壤桿菌屬細菌來進行植物材料轉化從而得到轉化植物的製備方法， 其特徵在於，在上述4)的工序中使用提高了含銅離子的金屬鹽濃度的培養 基。
此外，本發明是關於促進再分化植物生長的方法，其特徵在於，在由脫
分化的植物細胞使植物體再分化的工序中，使用提高了含銅離子的金屬鹽濃
度的培養基。在這種情況下，脫分化的植物細胞，是不是轉化細胞都可以，此外，如果是轉牝細胞的情況下，是不是通過土壤桿菌法轉化的都可以。
使用土^a桿菌屬細菌進行的基因導入以及轉化方法
使用土壤桿菌屬細菌進行的基因導入， 一般地包括以下工序
a) 製備植物材料的工序；
b) 製備含有具有期望導入基因的載體的土壤桿菌屬細菌的工序；
c) 使b)製備的土壤桿菌屬細菌感染工程a)製備的植物材料的工序； 進一步，為了得到轉化體，在上述工序c)之後也可以實施
d) 篩選轉化細胞的工序；以及
e) 根據期望，將篩選的轉化體進行再分化的工序。
具體地，在單子葉植物中，可以採用如文獻(特許第2,649,287號公報) 所述的那樣，特徵在於，如下的方法上述a)工序中用含有植物生長激素(例 如2，4-D2,4-(二氯苯氧基乙酸))或者細胞分裂素等的培養基培養，將植物材料 弄成脫分化的狀態或者在脫分化過程中的狀態，在上述c)工序中，使土壤杆 菌感染植物材料；或者是採用如文獻(特許第3,329,819號公報)所述的那樣， 特徵在於如下的方法以該植物的未成熟胚作為植物材料，在上述a)工序中 不對未成熟胚進行脫分化處理，在上述c)工序中用含有才直物生長激素(例如 2,4-D)或者細胞分裂素等的培養基培養。
關於工序a)
在本說明書中，供基因導入的"植物，，是單子葉植物以及雙子葉植物都 包括。在單子葉植物中包括水稻、玉米、大麥、小麥、石刁柏(7 7,，力' 只)、高梁和其他，但並不限於這些。雙子葉植物中包括菸草、大豆、馬鈴 薯、棉花、向日葵和其他，但並不限於這些。優選植物是單子葉植物，最優 選是玉米。
此外，所說"植物材料"非限定性的包括為以土壤桿菌法進行的轉化而 提供的該植物的細胞、葉、根、莖、果實、及其他的任何部位的植物組織， 未成熟胚，愈傷組織或者不定胚樣組織(以下在本說明書中稱作愈傷組織等， 或者簡稱為愈傷組織)，或者整個植物體等植物所有的形態。
作為本發明方法中使用的植物形態，優選未成熟胚和愈傷組織，最優選未成熟胚。在本說明書中，所說的植物的細胞、組織、整個植物體採用的是 在本技術領域中一般採用的意義。在本說明書中，所謂的未成熟胚是受粉後 處於成熟過程的未成熟種子的胚。此外，供本發明方法所用的未成熟胚的階 段(熟期)，沒有特別的限制，在受粉後的任何時期採摘的都可以。最優選受 粉後2天以後的未成熟胚。後述的轉化之後，以後述的方法，脫分化，優選 使用能夠誘導具有再長生成正常個體能力的愈傷組織的未成熟胚胚盤。此 外，未成熟胚優選近親交配、近親交配之間的Fl、近親交配與自然受粉品
種之間的F1、市售F1品種的未成熟胚。在本說明書中，所謂愈傷組織是指 無秩序增殖的未分化狀態的細胞塊。為了得到愈傷組織，可以將植物組織分 化的細胞置於含有植物生長激素(例如2,4-D)或者細胞分裂素等植物生長調 節物質的培養基(叫做脫分化培養基)中培養得到。該為得到愈傷組織而做的 處理叫做脫分化處理，該過程叫做脫分化過程。
在工序a)中，根據需要，將植物組織、未成熟胚等從植物體、種子等中 取出，製備成轉化的適合材料。此外，根據期望，也可以將植物材料在用土 壤桿菌感染之前培養。
本發明中，在工序a)中的植物材料製備過程以及/或工序c)中的使土i裹 桿菌感染過程中，以使用提高了含銅離子的金屬鹽濃度的培養基為特徵。此 外，在工序a)中的植物材料製備過程中也可以進行加壓處理。
關於工序b)
4艮久以前就已知土壤細菌的土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)引起S艮 多雙子葉植物的冠癭病(crown gall disease),在二十世紀70年代，發現Ti質 粒與病原性相關，而且作為Ti質粒的一部分的T-DNA糹皮重組到植物染色體 組。之後明白了該T-DNA上存在與合成誘發腫瘤所必要的荷爾蒙(細胞分裂 素和植物生長激素)相關的基因，儘管是細菌基因卻在植物中發現了。在切 割T-DNA與向植物的傳遞中，在Ti質粒上的病毒結構域(vir結構域)中存在 的基因組是必要的，此外為了將T-DNA切出得到，T-DNA兩端上存在的邊 界序列(水-夕、、-配列)是必要的。作為其他的土壤桿菌屬細菌的毛根土壤桿菌 (Agrobacterium rhizogenes)也具有根據Ri質粒的同樣的系統(例如特開 2000-342256的圖3和圖4)。因為由於土壤桿菌的感染，T-DNA可以重組才直物染色體組中，因此在 T-DNA上插入期望的基因的話，期望能將該基因重組到植物染色體中。然而， 因為Ti質粒是190kb或190kb以上非常大，用標準的基因工程方法在質粒 上的T-DNA上插入基因是困難的。因此，開發了為在T-DNA上插入外源基 因的方法。
首先，製備了從胂瘤性Ti質粒的T-DNA上去除了荷爾蒙合成基因的解 除型菌系(disarmed strains) LBA4404 (參考Hoekema， A.，等，(1983)， Nature, Vol. 303,p.l79-180)、 C58Cl(pGV3850)、 GV3TillSE等。通過使用這些，開 發了2種方法將期望的基因導入到土壤桿菌的Ti質粒T-DNA中，或者將 具有期望基因的T-DNA導入到土壤桿菌中。其中的一種是進行容易的基因 操作就可能插入期望的基因方法，該方法通過三系雜交法(triparental mating),通過同源重組，將在大腸桿菌中能夠複製的中間載體導入到土壤杆 菌的解除型Ti質粒的T-DNA結構域中，稱作中間載體法。
還有一種是稱作雙元載體(binary vector)法，該法是基於在將T-DNA重 組到植物中時，需要有病毒(vir)結構域，但沒有必要為了機能而存在於同一 質粒上。在該vir結構域中存在有virA、 virB、 virC、 virD、 virE以及virG, (植物生物技術事典(工乂夕7° ， 4 X抹式會社發行(1989)))，所謂vir結構域， 是指包含全部virA、 virB、 virC、 virD、 virE以及virG。因此，雙元載體是 將T-DNA重組到可在土壤桿菌和大腸菌雙方中複製的小質粒中的東西，將 其導入到具有解除型Ti質粒的土壤桿菌中來使用。
在向土壤桿菌導入雙元載體時，可以通過電穿孔法和三系雜交法等公知 的方法進行。在雙元載體中，有pBIN19、 pBI121、 pGA482等，以這些為基 礎，構建了大量的新型雙元載體用於轉化。此外，在Ri質粒系統中，也構 建了同樣的載體用於轉化。
土壤桿菌A281是強病原性(super-virulent)菌系，其宿主範圍廣，轉化效 率比其他菌系高。該特性是由於A281具有的Ti質粒的pTiBo542。 ^使用 pTiBo542到目前開發了 2種新系統。 一種是使用了具有pTiBo542解除型Ti 質粒的菌系EHA101以及EHA105,由於適用於上述雙元載體系統，這些作 為轉化能力高的系統而在各種植物的轉化中被利用。
還有一種是超級雙元載體("super-binary"vector)(參考Hiei, Y.,等，(1994)，The Plant Journal, Vol.6， p.271-282; Ishida， Y"等，(1996)， Nature Biotechnology, Vol.4, p.745-750 ; Komari, T.和Kubo T.,(1999), Methods of Genetic Transformation: Agrobacterium tumefaciens. In Vasil， I.K. (ed.) Molecular improvement of cereal crops" Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, p,43-82; 以及國際公開第95/06722號小冊子)系統(例如特開2000-342256的圖4)。由 於該系統是由具有vir結構域(virA、 virB、 virC、 virD、 virE以及virG(以下 也將這些各叫做"vir片斷結構域"))的解除型Ti質粒以及具有T-DNA的質 粒組成，因此是雙元載體系統的一種。但在使用超級雙元載體這點上是不同 的，超級雙元載體是在具有T-DNA的端的質粒上，即在雙元載體上，重組 了基本上去除了 vir片斷結構域中至少一種vir片斷結構域的vir結構域片斷 (其中優選至少含有virB或virG的片斷，更優選含有virB和virG的片斷)。 此外，在具有超級雙元載體的土壤桿菌中導入重組了期望基因的T-DNA結 構域時，通過三系雜交法的同源重組可作為容易的手法來利用。
在本發明方法中，作為成為宿主的的土壤桿菌屬細菌，沒有特別的限制， 可以優選使用土 i裡桿菌(Agrobacterium tumefaciens)(例如上述的土 i裡桿菌 LBA4404(參考Hoekema, A,等，(1983)， Nature, Vol. 303, p.l79-180)以及 EHAIOI。
根據本發明的方法，只要是基於土壤桿菌屬細菌中病原性(vir)結構域的 基因組的表達的基因導入系，可以沒有特別的限制就得到有意義的效果。因 此，對於上述的中間載體、雙元載體、強病原性雙元載體、超級雙元載體等 中的任何載體系統都可以使用，可以取得本發明的效果。在使用將這些載體 改變的不同載體系統時，也是同樣的(例如將土壤桿菌屬細菌vir結構域的一 部分或者全部切除，然後重組到質粒中，將vir結構域的一部分或者全部切 除，作為新的質粒的一部分導入到土壤桿菌中等)。此外，根據本發明的方 法，在野生型的土壤桿菌屬細菌中，也可以提高野生型T-DNA結構域向植 物的導入效率，事實上提高感染效率。
期望向植物中導入的基因可以基於以下適當的選擇標準來選擇可以通 過常規方法重組到上述質粒的T-DNA結構域中的限制酶部位中，對在該質 粒上同時或者是以別的途徑重組的卡那黴素、巴龍黴素等藥物具有耐藥性的 基因等。由於體積大，具有多數限制部位的，以通常亞克隆手法將期望的DNA導入到T-DNA結構域內不是都容易。在這樣的情況下，可以通過三系 雜交法，利用土壤桿菌屬細菌細胞內的同源重組，將目的DNA導入。儘管 沒有限定，但被導入的基因的大小優選是大約lOObp-200kbp。
此外，將質粒導入到Agrobactorium tumefaciens等土壤桿菌屬細菌中的 操作可以通過現有方法進行，舉例的話包括上述的三系雜交法和電穿孔法、 電子注射法、PEG等化學處理的方法。
要導入到植物中的基因，與現有技術一樣，基本上是配置在T-DNA的 左右邊界序列之間的。然而，因為質粒是環狀的，邊界序列的數可以是l， 在要將多個的基因配置在不同部位上時，邊界序列也可以是3個或3個以上。
此外，在土壤桿菌屬細菌中，可以配置在Ti和Ri質粒上，或者也可以配置 在其他質粒上。甚至，也可以配置在多種類的質粒上。
關於工序c)
通過土壤桿菌屬細菌進行基因導入的方法，可以通過使植物材料與土壤 桿菌屬細菌單獨的接觸來進行。例如，可以通過製備大約106~ 10"細胞/ml 程度的細胞濃度的土壤桿菌屬細菌懸濁液，將植物材料在該懸濁液中浸漬 3-10分鐘左右，在固體培養基上進行數日的共存培養來進行。
優選在使土壤桿菌感染植物材料的同時，或者感染之後除去土i裡桿菌之 前，將植物材料與土壤桿菌共存培養。在共存培養中使用公知的培養基。例 如，在實施例中使用的LS-AS培養基、nN6-As培養基、或者其他、N6S3-AS 培養基、2N6-AS培養基(參考Hiei，Y.,等，(1994),The Plant Journal, Vol.6，p.271 -282)等培養基是已知的。
在本發明中，在使土壤桿菌感染植物材料的工序c)之前或者進行中時， 也可以對植物材料進行選自以下的至少一種處理加壓處理、熱處理、離心 處理、以及超聲波處理。已知這些處理在通過土壤桿菌屬細菌向植物材料導 入基因的方法中也會提高基因的導入效率。例如，關於離心處理，在文獻(例 如國際公開第02/12520號小冊子；以及特開2000-342256)中被記載，優選以 100G-25萬G、進行離心1秒~4小時。關於熱處理，在文獻(例如特開 2000-342255)中被記載，優選在33°C ~ 60。C的溫度範圍內，進行熱處理5秒-24小時。進 一 步，關於超聲波處理，在文獻(例如Trick,H.N.和Finer,J丄，(1997),Transgenic Research, Vol.6， p.329-336 ; 以及Amoah,B., 等,(2001), Journal of Experimental Botany, Vol.52, p.ll35-1142)中4皮記載。
這些加壓、加熱、離心、以及超聲波處理，可以進行任意l種，也可以 多種組合來進行。例如Rogers,S,G"等,(1988),Method for Plant Molecular Biology, p.423-436,CA:Academic Press Inc.記載了關於將熱處理和離心處理 組合來進行。
關於工序d)以及e)
進一步根據期望，為了得到轉化體，在上述工序c)之後，必需進行
d) 篩選轉化細胞的工序；以及
e) 根據期望，將篩選的轉化體進行再分化的工序
即， 一般地，為了進行植物的轉化，在將外源基因導入到植物細胞後，篩選 外源基因穩定地重組到染色體上的植物細胞是必要的。
在本發明中，在工序d)中的篩選轉化細胞的工序，以及/或在工序e)中 的根據期望將篩選的轉化體進行再分化的工序中，也可以使用提高了含銅離 子的金屬鹽濃度的培養基。
篩選被轉化細胞的工序是指,通過表型的數據以及/或者物理數據，篩選 具有目的性狀的細胞。
表型的數據例如轉化效率可以通過進行以下評價來得到與期望導入到 植物中的基因一起，導入標記基因以及/和選擇標記基因，評價其表達。作為 標記基因以及/和選擇標記基因，可以使用例如GUS( |3 -葡糖醛酸酶)基因， 以及/或耐抗生素基因(例如耐PPT(7才,74乂7，^f少乂)基因，耐卡那黴 素基因)等。作為標記基因使用GUS時，轉化的評價可以通過由X-gulc(5-溴-4-氯-3-吲咮基-(3-D-葡糖醛酸)的GUS的切割而伴隨的顯色來評價。作為 選擇標記基因使用耐抗生素基因時，在轉化後，可以由在加有抗生素的選擇 培養基上生長的情況來評價。
進一步，為了確認外源基因穩定地重組到染色體上，也可以得到 等的DNA印跡物理數據。此外，也可以進行向有性生殖後代的傳遞的工序、 以及基於向後代基團的遺傳性以及分子性分析的選擇的工序。
也可以根據期望進行篩選的轉化體的再分化，培育再分化個體，然後得到完整的植物體。在由篩選的轉化細胞再生長成完整的植物體中，可以根據
公知的方法(例如Hiei,Y.,等,(1994),The Plant Journal, Vol.6, p.271-282;以及 Ishida,Y.，等，(1996), Nature Biotechnology,Vol.4,p.745畫750)進行。
本發明方法，與使用含有通常濃度金屬鹽的培養基的情況相比較，提高 了基因導入效率以及/或轉化效率，以及/或促進再分化植物的生長。基因導 入效率可以通過例如評價導入到基因的暫時性表達(一過的発現)範圍來進 行評價。在後面的實施例中，將未成熟胚的胚盤中的GUS基因的暫時性表 達評價為l(分散地看到點狀的表達)~ 5(整個胚盤均見表達)的5個階段指數。 或者，在全體的表達量較低的情況下，也可以通過數所有的點數來評價。
轉化效率可以通過例如將由接種的未成熟胚得到的再分化植物中顯示 了 GUS基因表達的作為轉化體來計數，以接種的未成熟胚的數除其總數來 算出。或者也可以通過將再分化植物中對於篩選壓力顯示出抵抗性的作為轉 化體來計數，以接種的未成熟胚的數除其總數來算出。
再分化植物的生長促進可以通過例如在使用含有通常濃度金屬鹽的培 養基的情況與使用提高了金屬鹽濃度的培養基的情況時，比較其再分化植物 的葉長、葉面積、以^/或重量來評價。
以下通過實施例具體地說明本發明，但本發明不被這些實施例所限制。 本領域普通技術人員基於本說明書的描述可以容易的在本發明上追加修飾、 變更，這些也包含在本發明的技術範圍內。
附圖的簡單說明


圖1為顯示通過向共存培養基中添加硫酸銅，對玉米(A188)的GUS基 因的暫時性表達方面帶來的效果圖。縱軸是將顯示出GUS基因暫時性表達 的部位的範圍進行數值化了的值，在O(沒有表達)~ 4(幾乎全部的胚盤都表達) 的範圍內進行數值化。圖的橫軸中顯示的"Cu x"(此處，x表示數字)，是 表示共存培養基中的硫酸銅濃度是x juM。
圖2為顯示對共存培養後玉米(H99)的愈傷組織形成方面，共存培養基 中的硫酸銅濃度帶來的效果圖。在圖的橫軸中的"Agx"以及"Cux，，(此處， x表示數字)，是分別表示共存培養基中硝酸銀以及硫酸銅的濃度是x pM。
圖3為顯示對共存培養後玉米(A188)的抗:7才只74乂7，4、〉>(PPT)的愈傷組織形成方面，共存培養基中的硫酸銅濃度帶來的效果圖。縱 軸是將愈傷組織形成進行數值化了的值，在O(沒有愈傷組織形成)~ 3(整個胚
盤都愈傷組織化)階段進行數值化。圖的橫軸中顯示的"Cu x"(此處，x表 示數字)，是表示共存培養基中的硫酸銅濃度是x nM。
圖4為顯示通過向共存培養基中添加硫酸銅，對水稻(IR64)的GUS基因 的暫時性表達方面帶來的效果圖。縱軸是將顯示出GUS基因暫時性表達的 部位的範圍進行數值化了的值，在0(沒有表達) 4(幾乎整個胚盤都表達)範 圍內進行數值化。圖的橫軸中顯示的"Cu5"是表示共存培養基中的硫酸銅 濃度是5 jLJ M。
圖5為顯示通過向共存培養基中添加葡糖酸銅，對玉米(A188)的GUS 基因的暫時性表達方面帶來的效果圖。縱軸是將顯示出GUS基因暫時性表 達的部位的範圍進行數值化了的值，在O(沒有表達)~ 4(幾乎整個胚盤都有表 達)內進行數值化。
圖6為顯示通過向共存培養基中添加葡糖酸銅，對玉米(A188)形成愈傷 組織方面帶來的效果圖。縱軸是將愈傷組織形成進行數值化了的值，在O(沒 有愈傷組織形成)~ 3(胚盤全部都愈傷組織化)的階段進行數值化。
圖7為顯示通過向共存培養基中添加葡糖酸銅，對水稻"雪光，，品種的 未成熟胚的增殖方面帶來的效果圖。縱軸是愈傷組織化的未成熟胚的重量， 為每1個未成熟胚的平均值。橫軸的實驗l、 2、 3是顯示各自獨立進行的實 驗。cont.表示不含硫酸銅或葡糖酸銅的對照、Cu表示硫酸銅、CG表示葡糖 酸銅。Cu以及CG後面的數值表示各自共存培養基中的濃度(M M)。
圖8為顯示通過向再分化培養基中添加硫酸銅或者葡糖酸銅，對從玉米 (A188)轉化愈傷組織再分化生長成轉化植物方面帶來的效果圖。縱軸是再分 化植物的葉長平均值。橫軸cont.表示不含硫酸銅或葡糖酸銅的對照、Cu表 示硫酸銅、CG表示葡糖酸銅。硫酸銅以及葡糖酸銅在各自共存培養基中的 濃度中以10pM添加。
圖9為顯示通過向再分化培養基中添加硫酸銅或者葡糖酸銅，對從水稻 "雪光"品種轉化愈傷組織再分化生長成轉化植物方面帶來的效果圖。縱軸 是再分化植物的葉長平均值。橫軸cont.表示不含硫酸銅或葡糖酸銅的對照、 Cu表示硫酸銅、CG表示葡糖酸銅。硫酸銅以及葡糖酸銅在各自共存培養基中的濃度中以10juM添加。 實施例
實施例1向共存培養基中添加硫酸銅對玉米的轉化帶來的效果 才才泮牛禾。方法
無菌方式摘取受粉後第7天-第14天的玉米(品種A188、 H99)的未成 熟胚(大小為1.0 1.5mm)，用LS-inf液體培養基(LS無機鹽、0.5mg/L煙酸、 0.5mg/L鹽酸吡哆醇、lmg/L鹽酸硫胺素、100mg/L肌醇、lg/L酪蛋白水解 物、1.5mg/L2,4-D、 68.5g/L蔗糖、36g/L葡萄糖、pH5.2;參考Ishida，Y.,等， (1996), Nature Biotechnology,Vol.4，p.745-750)洗淨1次。在一部分的未成熟 胚中進行為了提高基因導入效率的前處理(46。C、 3分鐘的熱處理以及 15，000rpm、 IO分鐘的離心處理)。在含有lOOpM乙醯丁香酚(7七卜少卩> :3、、乂)的LS-inf液體培養基中，混懸入大約1.0 x 109cfo/mL的Agrobacterium tumefaciens LBA4404(pSB131)(具有在T-DNA結構域中以菜花花葉病毒35S 啟動子驅使的PPT(7才只:74乂久，4* 7)耐性基因，以及在菜花花葉病 毒35S啟動子上結合有蓖麻過氧化氫酶內含子的GUS基因；參考Ishida，Y., 等,(1996), Nature Biotechnology，Vol.4,p.745-750)作為接種源。向摘取、洗淨 的未成熟胚以及熱、離心處理的未成熟胚中加入接種源，攪拌30秒後，於 室溫靜置5分鐘。在含有5pM的AgN03的LS-AS培養基(LS無機鹽、0.5mg/L 煙酸、0.5mg/L鹽酸吡口多醇、lmg/L鹽酸石克胺素、100mg/L肌醇、700mg/LL-脯氨酸、1.5mg/L2,4-D、 20g/L蔗糖、10g/L葡萄糖、500mg/LMES、 100(iM 乙醯丁香酚、8g/L瓊脂、pH5.8;參考Ishida,Y.,等,(1996), Nature Biotechnology, Vol. 4, p.745-750，固化劑是8g/L瓊月旨)中添加了 0 - 10|iM濃度CuS04.5H20 的共存培養基中，使接種了土壤桿菌的未成熟胚胚盤朝上地接種。
於25。C黑暗下培養3天後，將一部分的未成熟胚於含有0.1 %的Triton X-100的0.1M磷酸緩衝液(pH6.8)中浸漬，37。C靜止1小時。用磷酸緩衝液 除去土壤桿菌後，添加含有l.OmM 5-溴-4-氯-3-口引咮基-(3-D-葡糖醛酸(X-gluc)
以及20%曱醇的磷酸緩沖液。於37。C處理24小時後，於顯孩i鏡下觀察，考 察呈藍色的組織的範圍。
將在共存培養基上培養3天的未成熟胚於LSD1.5培養基(LS無機鹽、L鹽酸硫胺素、100mg/L肌醇 700mg/L L-脯氨酸、1.5mg/L2,4-D、 20g/L蔗糖、500mg/LMES、 8g/L瓊脂、 pH5.8;參考Ishida,Y.，等,(1996), Nature Biotechnology,Vol.4,p.745-750)上接種，
於25。C黑暗下培養大約4周後，測定增殖的愈傷組織的直徑。另外，將在共 存培養基上培養了7天的未成熟胚在含有5mg/L的:7才X:7 4 乂 7 ， O > (PPT)的LSD1.5培養基上接種，於25。C黑暗下培養1周後，於顯微鏡下觀察， 考察愈傷組織形成的程度。進一步，將這些愈傷組織在含有10mg/L PPT的 同樣培養基中，以同樣的條件培養6周。將增殖的抗PPT的愈傷組織在LSZ 再分化培養基(從LSD1.5培養基中除去2,4-D,添加5mg/L玉米素)上接種， 於25。C照明下培養2 3周。切取再分化的植物葉片，通過X-gluc考察GUS 基因表達。 結果
將在各種培養基中培養了 3天的未成熟胚(品種A188)通過X-gluc染色， 將顯示GUS基因的暫時性表達的部位(呈藍色的部位)的範圍以O(沒有表 達)~ 4(幾乎全部胚盤都有表達)5個階段來評價。
在含有1、 5以及10pM的硫酸銅的共存培養基上培養了 3天的未成熟 胚，與在對照培養基上培養的未成熟胚相比，在胚盤的大部分範圍內顯示出 GUS基因的一過性發現。認為由於在共存培養基中添加硫酸銅而顯示GUS 基因的一過性發現的範圍的增大是與有沒有熱、離心的前處理無關(圖1)。 由這些可知，通過在共存培養基中添加硫酸銅可提高基因導入效率。
將在各種培養基中培養了 3天的未成熟胚(品種H99)在不含選擇壓力的 培養基上培養大約4周後，考察形成的愈傷組織的直徑。在含有5pM硝酸 銀的共存培養基中培養的未成熟胚，顯示與在對照培養基中培養的幾乎同樣 的愈傷組織增殖。與此相對比的，在添加了 10pM硫酸酮以及5|_iM硝酸銀 的共存培養基中培養的未成熟胚顯示，直徑的平均值比在對照共存培養基中 培養的未成熟胚的大2mm或2mm以上，通過添加硫酸銅促進愈傷組織的增 殖(圖2)。
在共存培養i周后，將在含有PPT的選擇培養基中培養了 1周的未成熟 胚(品種A188)以0(沒有愈傷組織形成)-3(胚盤全部都愈傷組織化)4個階段 來評價增殖的愈傷組織。在添加了硫酸銅的培養基中培養的未成熟胚，與在對照培養基中培養的未成熟胚相比，顯示高的愈傷組織形成，可知通過添加 硫酸銅可提高轉化愈傷組織形成的效率(圖3)。進一步，通過將在含有PPT
的培養基中進行選擇得到的愈傷組織，在含有PPT的再分化培養基中培養， 得到抗PPT性植物。切取這些植物的葉片，研究GUS基因的表達。其結果 為，在含有5以及10pM硫酸酮的共存培養基中培養的未成熟胚中，與在不 含硫酸銅的共存培養基中培養的未成熟胚相比較，顯示2-3倍高的轉化效 率。
_表l在共存培養基中添加硫酸銅對轉化效率帶來的效果_
CuS04 接種的未成熟胚數再分化植 GUS陽性植物數 轉化效率
丄M)_^}_^__(B/A,%)
0 13 2 2 15.4
1 13 2 2 15.4 5 13 6 6 46.2 10 14 6 5 35.7
如上所示，向共存培養基中添加硫酸銅，具有提高通過土壤桿菌法的基 因導入效率、促進愈傷組織形成以及增殖、提高轉化效率的效果。
實施例2 向共存培養基中添加硫酸銅對向水稻導入基因帶來的效果 材料及方法
將在含有50mg/L潮黴素(乂、 4 / 口 7 ^ 、〉 >)和50mg/L壯觀黴素(X 、 夕f 乂 t <少7)的AB培養基(3g/L KH2P04、 lg/L NaH2P04、 lg/L NH4C1、 300 mg/LMgS04.7H20、 150 mg/LKCl、 10 mg/L CaCl2、 2.5 mg/LFeS04.7H20、 5g/L葡萄糖、15g/L瓊脂、pH7.0;參考Chilton,M.-D.,等，(1974), Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.，71: 3672-3676)上培養了 3 ~ ^天的Agrobacterium tumefaciens超級雙元載體LBA4404(pSB134)(具有在T-DNA結構域上結合 有玉米泛激素啟動子驅使的泛激素(工匕'《千乂)內含子的HPT基因(潮黴素 耐性基因)，以及具有結合了以菜花花葉病毒35S啟動子驅使的蓖麻過氧化 氬酶內含子的GUS基因；pSB134的製備是在pKY205(參考WO 03/027290)上，通過將作為表達標記的由pSB32得來的35S-intron GUS-nos片斷插入到 HindIII部位中來進行的)以白金接種環挑取，混懸於含有lOOpM乙醯丁香酚 的大約109cfU/ml濃度的AA1液體培養基(AA主要無機鹽、LS微量無機鹽、 MS維生素、AA胺基酸、0.2g/L酪蛋白水解物、4g/L蔗糖、2g/L葡萄糖， pH5.2) lml中。向放入了無菌摘取的未成熟胚(品種IR64)的埃彭道夫管中加 入土壤桿菌懸濁液lml,用旋渦混合器攪拌30秒後，於室溫靜置5分鐘。 將未成熟胚在nN6-As培養基(N6無機鹽、N6維生素、0.5g/L酪蛋白水解物、 0.5g/LL-脯氨酸、lmg/L2,4-D、 0.5 mg/L NAA、 0.1mg/L6BA、 20g/L蔗糖、 10g/L葡萄糖、10pM AgN03、 lOO(iM乙醯丁香酚、8g/L瓊脂糖、pH5.2)以 及含有5pM的CuS04.5H20的nN6-As培養基上接種，於黑暗下在25。C培 養1周。 結果
將共存培養後的未成熟胚通過X-gluc染色，將顯示GUS基因的一過性 發現的部位(呈藍色的部位)的範圍以O(沒有表達)-4(幾乎全部胚盤都有表 達)5個階段來評價。
在含有5pM的硫酸銅的共存培養基中培養了 l周的未成熟胚，與在對 照培養基上培養的未成熟胚相比，在胚盤的大部分範圍內顯示出GUS基因
的一過性發現(圖4)。由這些可知，通過向共存培養基中添加硫酸銅提高基 因導入效率，不僅是在玉米中而且在水稻中也可見。
實施例3 向共存培養基中添加葡糖酸銅對向玉米導入基因帶來的影響 材料及方法
無菌方式摘取受粉後第7天-第14天的玉米(品種A188)的未成熟胚 大小1.0 1.5mm,用LS-inf液體培養基洗淨1次。進行為了提高基因導入 效率的前處理(46。C、 3分鐘的熱處理以及15,000rpm、 IO分鐘的離心處理)。 在含有100pM乙醯丁香酚的LS-inf液體培養基中，混懸入大約1.0 x 109cfu/mL的Agrobacterium tumefaciens LBA4404(pSB13 l)作為接種源。向熱、 離心處理的未成熟胚中加入接種源，攪拌30秒後，於室溫靜置5分鐘。在 含有5pM的AgN03的LS-AS培養差、中添加了 0 ~ 10pM濃度葡糖酸酮的共 存培養基中，使接種了 土壤桿菌的未成熟胚胚盤向上接種。於25。C黑暗下培養3天後，將一部分的未成熟胚於含有0.1 %的Triton X-100的0.1M磷酸緩衝液(pH6.8)中浸漬，於37。C靜置1小時。在磷酸緩衝 液中除去土壤桿菌後，添加含有l.OmM 5-溴-4-氯-3-吲咮基-(3-D-葡糖醛酸 (X-gluc)以及20%曱醇的磷酸緩沖液。於37。C處理24小時後，於顯微鏡下 7見察，考察呈藍色的組織的範圍。
另外，將在共存培養基上培養了 7天的未成熟胚中的愈傷組織形成，以 O(無愈傷組織形成)、l(胚盤的一部分愈傷組織化)、2(胚盤的大約一半愈傷組 織化)、3(胚盤的3/4以上愈傷組織化)的指數進行評價。
結果
將在各種培養基中培養了 3天的未成熟胚(品種A188)通過X-gluc染色， 將顯示GUS基因的一過性發現的部位(呈藍色的部位)的範圍以O(沒有表 達)-4(在胚盤的幾乎全部都有表達)5個階段來評價。在含有1、 5以及10nM 的葡糖酸酮的共存培養基上培養了 3天的未成熟胚，與在對照培養基上培養 的未成熟胚相比，在胚盤的大部分範圍內顯示出GUS基因的暫時性表達(圖 5)。
考察了在共存培養基上培養了 1周的未成熟胚的愈傷組織形成。在含有 1、 5以及10^M的葡糖酸酮的共存培養基上培養的未成熟胚，與在不含葡糖 酸銅的培養基共同培養的未成熟胚相比，每種都顯示高愈傷組織形成。尤其 是在含5以及10)jM的葡糖酸酮的共存培養基中的，與對照相比，顯示有意 義的高愈傷組織形成(圖6)。
由這些可知，通過在共存培養基中添加葡糖酸S同，與添加硫酸銅時一樣， 可提高基因導入效率以及愈傷組織形成率。
實施例4 向接種源液體培養基中添加硫酸銅以及葡糖酸銅對向水稻導 入基因帶來的影響 材料及方法
將在含有50mg/L潮黴素和50mg/L壯觀黴素的AB培養基上培養了 3 ~ 4天的Agrobacterium tumefaciens超級雙元載體LBA4404(pSB134)以白金接 種環挑取，混懸於含有100pM乙醯丁香酚以及0 ~ 50pM的CuS04.5H20或 者葡糖酸銅的大約109cfWml濃度的AA1液體培^1^T^7 T放入了無菌摘取的未成熟胚(品種"雪光")的埃彭道夫管中加入土壤桿菌懸濁液lml,
用旋渦混合器攪拌30秒後，於室溫靜置5分鐘。將未成熟胚在nN6-As培養 基上接種，於黑暗下在25。C培養1周。 結果
測定了共存培養後未成熟胚的重量。儘管進行了 3次試驗，但在每個試 驗中，當在接種源液體培養基中加入硫酸銅或者葡糖酸銅的情況下，與沒有 添加的對照未成熟胚相比，顯示出旺盛的增殖(圖7)。可知，通過添加^e克酸 銅以及葡糖酸銅對愈傷組織增殖的促進，不只是在共存培養基而且是在接種 源的液體培養基中添加時也同樣可見。
實施例5 向再分化培養基中添加硫酸銅、葡糖酸銅對玉米轉化植物的 生長帶來的影響 材津十和方法
在玉米(品種A188)的未成熟胚(大小1.0- 1.5mm)上4妾種Agrobacterium tumefaciens LBA4404(pSB131),通過在含有PPT的LSD1.5培養基中培養得 到轉化愈傷組織。將轉化愈傷組織切碎為大約2mm的大小，於含有10pM 的CuS04.5H20或者葡糖酸銅以及PPT的LSZ再分化培養基上接種。在照明 下，於25。C培養3周，測定再分化植物的葉長。
結果
在含有硫酸銅或者葡糖酸銅的再分化培養基中再分化的植物的葉長，與 在對照再分化培養基中再分化的植物相比，顯示有意義的加長，硫酸銅或者 葡糖酸銅顯示促進再分化植物生長的效果(圖8)。
實施例6 向再分化培養基中添加硫酸銅、葡糖酸銅對水稻轉化植物的 生長帶來的影響 材j^和方法
在水稻(品種"雪光，，)的未成熟胚上接種Agrobacterium tumefaciens LBA4404(pSB134)，通過在含有潮黴素的nN6CC培養基(N6無機鹽、N6維 生素、0.5g/ L酪蛋白水解物、0.5g/ L L-脯氨酸、lmg/L 2,4-D、 0.5 mg/L NAA、 0.1mg/L6BA、 20g/L蔗糖、55g/L山梨醇、250mg/L頭孢噻肟(七7才夕^夕厶)、250 mg/L羧卡西林、5g/L凝膠劑(少VL，4卜)、pH5.8)中培養得到 轉化愈傷組織。將轉化愈傷組織切碎為大約2mm的大小，於含有lO(iM的 CuS04.5H20或者葡糖酸銅以及潮黴素的N6R再分化培養基(主要無機鹽減 到1/2的N6無機鹽、N6維生素、AA胺基酸、lg/L酪蛋白水解物、0.5 mg/L 激動素、20g/L蔗糖、30g/L山梨糖醇、4g/L凝膠劑(y》，4卜)、pH5.8) 上接種。在照明下，於25。C培養3周，測定再分化植物的葉子長度。 結果
在含有硫酸銅或者葡糖酸銅的再分化培養基中再分化的植物的葉長，與 在對照再分化培養基中再分化的植物相比，顯示有意義的加長，硫酸銅或者 葡糖酸銅具有促進再分化植物生長的效果，在水稻中也顯示出來(圖9)。
產業上的利用性
本發明開發了比現有土壤桿菌法更高效率地進行基因導入的廉價簡單 的方法。此外，提供對認為用現有土壤桿菌法進行基因導入困難的植物種以 及品種也適用的方法。本發明的方法，與使用含有通常濃度的金屬鹽的培養 基的情況相比，可提高基因導入效率以及/或轉化效率，以及/或可促進再分 化植物的生長。
如圖l顯示的，通過使用含有高濃度硫酸銅的共存培養基，關於單子葉 植物玉米的基因導入效率，與使用不含硫酸銅的培養基相比較，提高了2-2.5倍。此外，還由於增加了加熱、離心處理，與使用不含硫酸銅的培養基 以及未處理的植物材料時相比，基因導入效率提高了 1.5 ~ 3倍。
根據本發明，從提高植物土壤桿菌法的基因導入效率這點，對以下估文出 了貢獻可以高效地得到多種轉化植物，容易地有效地培育導入有實用基因 的品種。尤其，單子葉植物其中有玉米，由於用現有土壤桿菌法轉化效率低， 通過本發明方法提高了轉化效率，意義很大。
權利要求
1. 一種以土壤桿菌屬細菌來進行植物材料轉化從而得到轉化植物的製備方法，包含1)製備植物材料，2)使土壤桿菌感染植物材料，3)篩選轉化細胞，且4)將篩選的轉化體進行再分化，其特徵在於，在上述4)的工序中使用含銅離子的金屬鹽濃度為1-100μM的培養基。
2. 權利要求l所述的方法，其中金屬鹽是^L酸銅或葡糖酸銅。
3. 權利要求1或2所述的方法，其中金屬鹽濃度是1 ~ 50pM。
4. 權利要求3所述的方法，其中金屬鹽濃度是1 ~ 10|iM。
5. 權利要求1或2所述的方法，其中植物是單子葉植物。
6，權利要求1或2所述的方法，其中植物是玉米。
7. 權利要求1或2所述的方法，其中植物是水稻。
8. 權利要求1或2所述的方法，其中植物材料是未成熟胚。
9. 一種促進再分化植物生長的方法，其特徵在於，在由脫分化植物細 胞再分化成植物體的工序中，使用含銅離子的金屬鹽濃度為l-lOOpM的培養 基。
10. —種通過土壤桿菌屬細菌來進行將基因導入到植物材料中的方法， 該方法包括(1) 製備植物材料，(2) 使土壤桿菌感染植物材料，(3) 篩選轉化細胞，且(4) 將篩選的轉化體進行再分化，其特徵在於，在上述2)和4)的工序中使用提高了含銅離子的金屬鹽濃度的培養基。
11. 一種通過土壤桿菌屬細菌來進行將基因導入到植物材料中的方法， 該方法包括1) 製備植物材料，2) 使土壤桿菌感染植物材料，3) 篩選轉化細胞，且4) 將篩選的轉化體進行再分化，其特徵在於，在上述2)的工序中使用提高了含銅離子的金屬鹽濃度的培養基。
全文摘要
本發明提供一種通過添加銅離子來使植物轉化效率提高的方法，包含1)將植物材料進行處理，然後2)使土壤桿菌感染植物材料，通過土壤桿菌屬細菌來進行將基因導入到植物材料中的方法，其特徵在於在上述1)以及/或2)的工序中，使用提高了含銅離子的金屬鹽濃度的培養基。本發明還提供以採用基因導入法為特徵的轉化植物的製造方法。
文檔編號C12N5/14GK101429522SQ20081018183
公開日2009年5月13日 申請日期2004年8月12日 優先權日2003年8月13日
發明者石田佑二 申請人:日本菸草產業株式會社