普羅布考單酯在治療心血管疾病和炎性疾病中的應用的製作方法

2023-07-05 23:40:31 1

專利名稱：普羅布考單酯在治療心血管疾病和炎性疾病中的應用的製作方法
技術領域：
本申請是中國專利申請98807171.1(申請日1998年5月14日，發明名稱普羅布考單酯在治療心血管疾病和炎性疾病中的應用)的分案申請。
本發明涉及抑制VCAM-1的組合物及方法，特別是治療包括動脈粥樣硬化的心血管疾病或炎性疾病的組合物和方法，包括給藥有效量的普羅布考酯。
背景技術：
目前，心血管疾病在美國是主要的死亡原因。現在約90％的心血管疾病診斷為動脈粥樣硬化。心血管疾病與若干致病因素有關，包括高膽固醇血症、高脂血症和VCAM-1在血管內皮細胞中的表達。
高膽固醇血症和高脂血症高膽固醇血症是引起心血管疾病的一種重要的危險因素。血清脂蛋白是脂類循環的載體。根據其密度，脂蛋白分成四類乳糜微粒、極低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)。乳靡微粒主要參與飲食中甘油三酯和膽固醇從小腸到脂肪組織和肝的運輸。VLDL把內源性合成的甘油三酯從肝轉運到脂肪和其它組織。LDL把膽固醇運輸到周圍組織並調節這些組織中內源性膽固醇的含量。HDL把膽固醇從周圍組織轉運到肝。動脈壁膽固醇幾乎完全來自LDL。Brown和Goldstein，生物化學年評(Ann.Rev.Biochem).52期，223頁(1983)；Miller，醫學年評(Ann.Rev.Med).31期，97頁(1980)。對於LDL含量低的患者，極少發展成動脈粥樣硬化。
高膽固醇水平與許多疾病有關，包括心瓣再狹窄、心絞痛、腦動脈粥樣硬化和黃瘤。因此希望提供一種方法來降低患者血漿膽固醇水平，或者降低發展成與高膽固醇水平有關的心瓣再狹窄、心絞痛、腦動脈粥樣硬化、黃瘤以及其它疾病的危險性。
如果已經確定高膽固醇血症是由高含量LDL(高脂血症)引起的，則可嘗試飲食療法來降低LDL的含量。通常用於降低LDL含量的幾類藥物包括膽汁酸螯合劑、煙酸(尼克酸)和3-羥基-3-甲基戊二酸單醯輔酶A(HMG CoA)還原酶抑制劑。普羅布考及貝特類(fibrate)衍生物有時用作輔助治療，通常與其它藥物一起聯合用藥。HMG CoA還原酶抑制劑被稱之為他汀類(statins)或伐他汀類(vastatins)。他汀類是目前用於治療高膽固醇血症的最有效的上市藥物，其包括普伐他汀(Pravchol，Bristol Myers Squibb)、阿託伐他汀(atrovastatin)(Warner Lambert/Pfizer)、辛伐他汀(zocor，Merck)、洛伐他汀(Mevacor，Merck)和氟伐他汀(Lescol)。
對於許多患者，注意飲食以及應用一種降血脂試劑就足夠了。然而，對於LDL膽固醇的起始含量高於200mg/dl的患者來說，需要通過治療將LDL含量降低50％或更多。雖然應用單一試劑也可能偶爾把LDL降低到此程度，但更通常地只降低了20-30％。因此，對於LDL膽固醇含量為200-400mg/dl的雜合家族性高膽固醇血症患者，為了達到LDL膽固醇含量低於100mg/ml，需要聯合應用兩種或有時甚至是三種降血脂藥物。膽汁酸螯合劑樹脂和煙酸聯合應用，可以將LDL含量降低45-55％；膽汁螯合劑樹脂和他汀聯合，可以降低約50-60％；煙酸和他汀聯合，可以降低約50％；聯合應用膽汁酸螯合劑樹脂、他汀和煙酸三種藥物治療，可以降低多達70％。
有證據表明低密度脂蛋白(LDL)的致動脈粥樣硬化作用部分是通過其氧化修飾作用引起。普羅布考顯示有強烈的抗氧化特性，並可以阻斷LDL的氧化修飾。與這些發現一致，在LDL受體缺乏的兔中，普羅布考顯示事實上減慢了動脈粥樣硬化進程，這些論述參見Carew等，美國國家科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A)847725-7729(1987)。非常相似地，由於普羅布考的高脂溶性並通過脂蛋白轉運，因此它是有效的，可以保護脂蛋白免受氧化損害。
普羅布考在化學上與廣泛應用的食品添加劑2，[3]-叔丁基-4-羥基苯甲醚(BHA)和2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)有關。其化學全名為4，4′-(異亞丙基二硫)雙(2，6-二叔丁基苯酚)。
目前，普羅布考主要用於降低高膽固醇血症患者的血清膽固醇含量。普羅布考通常以片劑形式給藥，以商標LofelcoTM獲得。不幸的是，普羅布考幾乎不溶於水，因此不能靜脈注射。事實上，由於普羅布考與用於細胞培養的緩衝液和基質混溶性差，在體外，細胞很難吸收普羅布考。固體普羅布考很難吸收到血液中，並且以基本上未加改變的形式排洩。並且，對於不同的病人，普羅布考片劑的吸收速率有顯著差異，吸收量也不同。在一項研究中(Heeg等，單次和多次口服劑量後人血漿中普羅布考的濃度，La Nouvelle Presse Medicale，92990-2994(1980))，發現病人與病人之間，普羅布考的血清峰值濃度的差異因子多達20個。在另一項研究中，Kazuya等，脂類研究雜誌(J.Lipid.Res)32；197-204(1991)發現當內皮細胞用50μM普羅布考培養24小時後，只有低於約1μg普羅布考/106細胞混合。
Parthasarathy的美國5,262,439號專利公開了可溶性普羅布考類似物，其中用酯基替換普羅布考的一個或兩個羥基從而賦予該化合物水溶性。在一個實施方案中，該水溶性衍生物選自普羅布考的琥珀酸酯、戊二酸酯、己二酸酯、辛二酸酯、癸二酸酯、壬二酸酯或者順丁烯二酸酯的單酯或雙酯。在另一個實施方案中，普羅布考衍生物為單酯或雙酯，其中的酯含有烷基或烯基，這些烷基或烯基含有的官能團選自羧酸基、氨基、氨基鹽、醯胺、醯胺和醛基。
一系列法國專利公開了某些普羅布考衍生物是降膽固醇試劑和降血脂試劑Fr2168137(雙4-羥基苯基硫代烷基酯)；Fr2140771(普羅布考的1，2，3，4-四氫化萘基苯氧基烷酸酯)；Fr2140769(普羅布考的苯並呋喃基氧烷酸衍生物)；Fr2134810(雙-(3-烷基-5-叔烷基-4-噻唑-5-羧基)苯硫基)烷；FR2133024(雙-(4-煙醯氧基苯硫基))丙烷；和Fr2130975(雙(4-苯氧基烷醯氧基)-苯硫基)烷)。
美國5,155,250號專利公開了2，6-二烷基-4-甲矽烷苯酚是抗動脈粥樣硬化試劑。在1995年6月15日公開的WO95/15760號PCT出版物中公開了同樣的化合物作為降血清膽固醇試劑。美國5,608,095號專利公開了烷基化的4-甲矽烷基苯酚可抑制LDL的過氧化，降低血漿膽固醇含量和抑制VCAM-1的表達，因此用於治療動脈粥樣硬化。
VCAM-1的表達對於心血管疾病以及各種炎性疾病包括自身免疫障礙和細菌及病毒感染來說，內皮上附著白細胞是基本的早期事件。當內皮細胞表面的誘導粘附分子受體與免疫細胞表面的反受體相互作用時，內皮上開始募集白細胞。通過選擇性表達特異性粘附分子例如血管細胞粘附分子-1(VCAM-1)、細胞間粘附分子-1(ICAM-1)和E-選擇蛋白(ELAM)，血管內皮細胞可以確定募集哪種類型的白細胞(單核細胞、淋巴細胞和嗜中性白細胞)。動脈粥樣硬化損害的最早期階段，存在局部的VCAM-1的內皮表達以及表達整聯蛋白反受體VLA-4的單核白細胞的選擇性募集。由於VLA-4在單核細胞和淋巴細胞表面而不是在嗜中性白細胞表面的選擇性表達，因此對於介導單核白細胞的選擇性粘附來說，VCAM-1是非常重要的。VCAM-1作為介體參與慢性炎症，其中的慢性炎症如哮喘、類風溼性關節炎和自身免疫性糖尿病。例如，哮喘病人的VCAM-1和ICAM-1的表達增加。Pilewski，J.M.，等，美國呼吸細胞分子生物學雜誌(Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.)12，1-3(1995)；Ohkawara，Y.，等，美國呼吸細胞分子生物學雜誌(Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.)12，4-12(1995)。另外，在卵白蛋白敏感的過敏性氣道反應大鼠模型中，阻滯VCAM-1和ICAM-1的整聯蛋白受體(分別為VLA-4和LFA-1)抑制了早期和晚期反應。Rabb，11.A.，等，美國呼吸護理醫學雜誌(Am.J.Respir.Care Med.)149，1186-1191(1994)。在類風溼性滑膜的微脈管系統中，內皮粘附分子包括VCAM-1的表達也增加了。Koch，A.E.等，實驗研究(Lab.Invest.)64，313-322(1991)；Morales-Ducret，J等，免疫學(Immunol).149，1421-1431(1992)。指向VCAM-1或其反受體VIA-4的中性抗體可以延遲自發地發展成糖尿病小鼠模型(NOD小鼠)的糖尿病的發生。Yang，X.D.等，美國國家科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)90，10494-10498(1993)；Burkly，L.C.等，糖尿病(Diabetes)43，523-534(1994)；Baron，J.L.等，臨床研究雜誌(J.Clin.Invest)93，1700-1708(1994)。在同種異體移植排斥的動物模型中，VCAM-1的單克隆抗體也具有有益的效果，這表明抑制VCAM-1的表達可能具有防止移植排斥的用途。Oroez，C.G.等，免疫學快報(Immunol Lett.)32，7-12(1992)。
細胞以膜結合形式和可溶性形式表達VCAM-1。VCAM-1的可溶性形式顯示在體外誘導血管內皮細胞的趨化性，在鼠角膜中可刺激血管生成反應。Koch，A.F.等，自然(Nature)，376，517-519(1995)。可溶性VCAM-1的表達的抑制製劑具有潛在的治療價值，可以用於治療具有強烈血管生成成分的疾病包括腫瘤生長和轉移。Folkman，J.，和Shing，Y.，生物化學(Biol.Chem.)10931-10934(1992)。
經脂多糖(LPS)和細胞因子如白介素-1(IL-1)和腫瘤壞死因子(TNF-α)活化後，VCAM-1在培養的人血管內皮細胞中表達。這些因子是非選擇性地活化細胞粘附分子的表達。
白細胞接著轉變成泡沫巨噬細胞(foamy macrophages)，這導致各種各樣的炎症細胞因子、生長因子和化學引誘劑的合成，從而助長了白細胞繁殖和血小板募集、平滑肌細胞增生、內皮細胞活化和成熟的動脈粥樣硬化斑所特有的細胞外基質合成。
控制表達的人VCAM-1基因表面調節元件的分子分析表明轉錄調節因子核因子-kB(NF-kB)或NF-kB樣結合蛋白對於VCAM-1基因表達的氧化還原敏感性調節有重要作用。轉錄因子是蛋白質，這些蛋白質通過與稱作「增強子元件」的特異性DNA序列結合來活化(或抑制)細胞核中的基因表達，其中所述的增強子元件通常在該基因區域附近，該基因稱為「啟動子」，在此RNA的合成開始啟動。
已經克隆出VCAM-1和ICAM-1的啟動子並描繪了其特性。例如，這兩種啟動子均含有多種可與轉錄因子NF-kB結合的DNA序列元件。Iademarco，M.F.等，生物化學雜誌(J.Biol.Chem)267，16323-16329(1992)。
核因子-kB是一種普遍表達的多亞單位轉錄因子，其通過一大組不同種類的炎症試劑在若干細胞類型中活化，所述的炎症試劑例如TNFa、IL-1B、細菌內毒素和RNA病毒。在將炎症或其它應激信號傳遞到核調節器方面，該因子起關鍵作用。儘管活化NF-kB的精確的生物化學信號是未知的，但該轉錄因子可能把許多動脈粥樣硬化的危險因子和「病原」信號例如高血脂症、吸菸、高血壓和糖尿病併入通常的分子途徑。
多種信號對血管內皮細胞中NF-kB的活化可以被抗氧化劑特異性地抑制，其中的抗氧化劑例如N-乙醯基半胱氨酸和吡咯烷二硫氨基甲酸酯。這樣得到一個假說即通過不明確的氧化還原機理活化NF-kB，氧自由基起重要作用。由於NF-kB樣增強子元件也通過氧化還原敏感性方式調節VCAM-1啟動子的轉錄，因此假想認為動脈粥樣硬化損害的氧化應激可能對於通過這種氧化還原敏感性轉錄調節蛋白來調節VCAM-1基因表達起重要作用。美國5,380,747號專利(PCT/US93/10496)首次公開了通過給藥一組二硫氨基甲酸酯(包括吡咯烷二硫氨基甲酸酯)可以抑制血管內皮細胞中VCAM-1的表達。因此，這些二硫氨基甲酸酯可以用於治療心血管疾病，並且顯示能明顯地降低動脈粥樣硬化損害在高膽固醇血症兔中的存在。
已經有假說認為活性氧物質把低密度脂蛋白(LDL)修飾成LDL氧化修飾物(ox-LDL)，這是啟動和傳播動脈粥樣硬化的中心事件。Steinberg等，新英格蘭醫學雜誌(N.Engl.J.Med.)1989；320915-924。LDL氧化物是一種複雜的結構，至少由若干化學上不同的氧化物質組成，單獨每一種物質或它們聯合可以調節細胞因子活化的粘附分子基因表達。脂肪酸氫過氧化物例如亞油酸氫過氧化物(13-HPODE)通過脂肪氧合酶從游離脂肪酸中產生，其是LDL氧化物的一個重要成分。
已經提出通過細胞脂肪氧合酶系統的作用產生一代氧化脂類，該氧化脂類再接著轉變成LDL。然後通過過渡金屬和/或氫硫基化合物的催化，基質中LDL發生鏈增長反應。以前的研究指出培養的內皮細胞的脂肪酸修飾可改變它們對氧化劑損傷的敏感性。PCT/US95/05880公開了多不飽和脂肪酸及其氫過氧化物誘導人主動脈內皮細胞中VCAM-1的表達，但不誘導ICAM-1或E-選擇蛋白的表達，其機理並不是細胞因子或其它非細胞因子信號介導的。這是對於VCAM-1介導的免疫反應的重要且以前未知的生物學途徑的一個基本發現。PCT/US95/05880還報導了二硫氨基甲酸酯(包括吡咯烷二硫氨基甲酸酯)能抑制多不飽和脂肪酸及其氫過氧化物對VCAM-1的誘導。
由於心血管疾病目前是美國主要的死亡原因，因此需要提供治療這類疾病的新療法。一個目標就是提供一種新的試劑，它可以同時治療高膽固醇血症、高脂血症和抑制血管內皮細胞中VCAM-1的表達。
因此，本發明的一個目的是提供一種方法和組合物用於抑制VCAM-1的表達，特別是用於治療心血管疾病的方法。
本發明的另一個目的是提供一種治療心血管疾病的方法和組合物，它可以同時治療高膽固醇血症、高脂血症以及抑制血管內皮細胞中VCAM-1的表達。

發明內容
據發現普羅布考的單酯能夠有效地同時降低膽固醇、降低LDL和抑制VCAM-1的表達，因此這些化合物可以用作複合心血管試劑。由於該化合物同時顯示三種重要的心血管保護活性，病人可以服用一種藥物而不是服用多種藥物來達到同樣的效果。這可以提高治療和病人順應的一致性。
令人驚奇地發現雖然已知強效的抗氧化劑普羅布考本身並不顯著地影響VCAM-1的表達，普羅布考的二酯和他汀類也並不顯著地影響VCAM-1的表達，但是普羅布考單酯抑制VCAM-1的表達，普羅布考單酯抑制VCAM-1的表達。
另外還發現普羅布考的單琥珀酸酯只在較小程度上降低兔的HDL，但不影響小鼠和猴的HDL。相反，普羅布考只是在較小程度上降低LDL，但顯著降低HDL。他汀類降低LDL，可能影響或不影響HDL。
另外還發現普羅布考的單酯，特別是普羅布考的單琥珀酸酯(此後稱之為「MSE」)選擇性地抑制人主動脈內皮細胞中TNF誘導的VCAM-1和MCP-1的基因表達，但對ICAM-1的基因表達沒有影響。MSE不影響NF-kB的活化。本文中用MSE作為普羅布考單酯的例子。用MSE作為例子僅僅是為了討論方便，其並不能限制本發明的範圍。
由於發現普羅布考單酯特別是普羅布考單琥珀酸酯能阻滯內皮細胞表面粘附分子VCAM-1的誘導表達，因此它們可以用於治療由VCAM-1介導的任何疾病，包括動脈粥樣硬化、血管成形術後再狹窄、冠狀動脈疾病、心絞痛和其它心血管疾病，以及由VCAM-1介導的非心血管炎性疾病。這些化合物還可以用於治療心臟移植排斥反應。
此處記載的化合物即可用於心血管疾病的主要藥物治療，又可用於輔助藥物治療。這些化合物用於例如冠狀疾病包括動脈粥樣硬化、血管成形術後再狹窄、冠狀動脈疾病和心絞痛的主要治療。可以給藥這些化合物以治療外科手術或血管成形術治療的小血管疾病，或者不能選擇外科手術治療的其它血管性疾病。這些化合物還可以在血管再造治療之前用於穩定病人。
當適當應用時，此處描述的本發明還可能通過形成和引起已有的損害的消退而防止新損害，從而在醫學上「治癒」動脈粥樣硬化。
在一個供選擇的實施方案中，此處公開的化合物可用於治療VCAM-1介導的炎性皮膚疾病，特別是VCAM-1介導的人內皮細胞疾病，其包括但不限於哮喘、牛皮癬、溼疹性皮炎、卡波濟氏肉瘤、多發性硬化以及平滑肌細胞的增生性疾病。
在另一個實施方案中，可選擇此處公開的化合物來治療由單核白細胞介導的抗炎性疾病。


圖1是普羅布考單琥珀酸酯和普羅布考在濃度為2.5μM、5μM、10μM和100μM時對HAEC細胞中VCAM-1表達的作用進行比較的柱形圖。
圖2是普羅布考單琥珀酸酯和普羅布考在濃度為2.5μM、5μM、10μM和100μM時對HAEC細胞中ICAM-1表達的作用進行比較的柱形圖。
圖3是10μM的普羅布考單琥珀酸酯、50μM的普羅布考和TNF對人主動脈內皮細胞(HAEC)中MCP-1表達的作用進行比較的柱形圖。
圖4表示普羅布考單琥珀酸酯(10和25μM)和普羅布考(50μM)對HAEC中基因表達的作用。
圖5是普羅布考單琥珀酸酯和普羅布考對脂類餵食兔血漿中膽固醇含量的作用的柱形圖。
圖6是經三星期服藥後，兔血漿中普羅布考和普羅布考單琥珀酸酯濃度進行比較的柱形圖。
圖7表示在六星期期間，普羅布考單琥珀酸酯對高膽固醇血症兔模型中總血清膽固醇的作用圖。
圖8是六星期後普羅布考單琥珀酸酯對脂類餵食兔中總膽固醇、LDLc、VLDLc，ILDLc，HDLc和TG的作用柱形圖。
圖9是未處理的脂類餵食兔和用普羅布考單琥珀酸酯處理的脂類餵食兔中損害覆蓋的主動脈表面積百分比圖。
圖10是普羅布考單琥珀酸酯的血漿含量(微摩爾)作為治療天數的函數圖。
圖11是口服普羅布考單琥珀酸酯的ApoE-KO小鼠和對照組中兩星期後總膽固醇、VLDL、IDL、LDL、HDL和甘油三酯進行對比的柱形圖，單位mg/ml。
圖12是在服用普羅布考單琥珀酸酯期間及服用後高膽固醇血症猴子LDL血清含量隨時間天數的降低圖。
圖13是高膽固醇血症猴子中普羅布考單琥珀酸酯對血清LDL的作用的柱形圖。
圖14表示大鼠兩星期口服普羅布考單琥珀酸酯1000mg/kg/d對總蛋白、鈣、磷酸酯、葡萄糖、血液尿素氮和膽固醇的影響和對照組相比較的柱形圖(以任意單位)。
圖15表示大鼠兩星期口服普羅布考單琥珀酸酯1000mg/kg/d對白蛋白、肌酸酐、尿酸和總膽紅素的影響和對照組相比較的柱形圖(以任意單位)。
具體實施例方式
I定義此處所用的術語「普羅布考單酯」包括(i)美國5,262,439號專利記載的任何一種普羅布考單酯，例如，羧酸酯和二羧酸酯及其鹽；(ii)比普羅布考具有更高水溶性並且能降低血漿膽固醇、降低LDL以及抑制VCAM-1表達的任意一種普羅布考單酯，此處將詳細描述。在一個實施方案中，普羅布考單酯包括普羅布考的二羧酸酯，包括但不限於琥珀酸、戊二酸、己二酸、辛二酸、癸二酸、壬二酸和順丁烯二酸的酯類。在另一個實施方案中，酯基包括能使該化合物比普羅布考水溶性增加的官能團，包括但不限於飽和及不飽和二羧酸及其鹽、氨基羧酸及其鹽、含醛的羧酸及其鹽、氨基、氨基鹽、醯胺、醛基及其鹽。還有一個實施方案中，酯基具有的官能團選自磺酸、磺酸酯、磷酸、磷酸酯、環磷酸酯、多羥基烷基、糖基、C(O)-間隔基-SO3H，其中間隔基為-(CH2)n-、-(CH2)n-CO-、-(CH2)n-N-、-(CH2)n-O-、(CH2)n-S-、-(CH2O)-、-(OCH2)-、-(SCH2)-、-(CH2S-)、-(芳基-O-)-、-(O-芳基)-、-(烷基-O)-、-(O-烷基)-；n為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；C(O)-間隔基-SO3M，其中M為金屬，用於形成可藥用鹽，例如鈉或鉀，C(O)-間隔基-PO3H2，C(O)-間隔基PO3M2，C(O)-間隔基-PO3HM、C(O)-間隔基-PO4H、C(O)-間隔基-PO4M、SO3M、-PO3H2、-PO3M2、-PO3HM、環磷酸酯、多羥基烷基、糖基、C(O)-間隔基-[O(C1-3烷基)p]n，其中n定義如上，p為1、2或3，-[O(C1-3烷基)p]n、羧基低級烷基、低級烷基羰基低級烷基、N，N-二烷基氨基低級烷基、吡咯基低級烷基、咪唑基低級烷基、嗎啉基低級烷基、吡啶烷基低級烷基、噻唑啉基低級烷基、哌啶基低級烷基、嗎啉基低級羥烷基、N-吡咯基、哌嗪基低級烷基、N-烷基哌嗪基低級烷基、三唑基低級烷基、四唑基低級烷基、四唑基氨基低級烷基或噻唑基低級烷基。
術語「可藥用衍生物」指活性化合物的衍生物，其給藥至受藥者後能夠直接或間接提供母體化合物或者它本身顯示活性。
術語「生理學上可裂解的離去基團」指在體內能夠從所連分子裂解的基團，包括但不限於有機或無機陰離子、可藥用陽離子、醯基(包括但不限於(烷基)C(O))，包括乙醯基、丙醯基和丁醯基)、烷基、磷酸酯、硫酸酯和磺酸酯。
應該選擇具有適當親脂性的普羅布考單酯以定位於作用部位用於治療動脈粥樣硬化和其它心血管及炎症性疾病。該化合物不應該劃分在低翻轉的區域例如脂肪沉積區域。在治療心血管疾病一個優選的實施方案中，充血性心力衰竭或腎機能不全不應該顯著影響該化合物的藥代動力學。
可以通過任何合適方式給藥該活性化合物或這些化合物的混合物，這些給藥方式包括但不限於系統給藥包括口服或靜脈給藥，或者局部給藥包括透皮給藥。通常的劑量範圍為0.1-500mg/kg體重，給藥方案從每兩天一次到每天兩次至數次。給藥時間在每日劑量只給藥1-2次時為2-6個月。
在心血管治療中，還可以應用灌注罐導管沿著或代替冠狀動脈或其它動脈成形術直接將這些化合物給藥至血管壁。作為一個實施例，2-5mL含有約1-500mM該化合物或化合物混合物的可藥用溶液在1-5個大氣壓下給藥。此後，在接一來的六個月期間，在心狹窄的最大危險期間，活性化合物通過其它合適途徑和給藥方案給藥。
用活性化合物進行相對短期治療在不能用血管成形術或外科手術治療的冠狀動脈疾病損害中用於引起受損血管「皺縮」。短期治療的非限制性實施例為2-6個月，劑量範圍是0.5-500mg/kg體重(如果給藥間隔時間為每兩天一次至每天三次)。
可以應用長期治療以防止高危病人中早期損害的發展。長期治療可以延續數年，劑量範圍是0.5-500mg/kg體重，給藥間隔為每兩天一次至每天三次。
活性化合物還可以剛好在冠狀動脈成形術之前和成形術之後立即給藥，用於減少或消除那些導致臨床上顯著再狹窄的異常增生及炎症反應。
活性化合物可以與其它用於治療心血管疾病的藥物聯合給藥，聯合的藥物包括血小板聚集抑制劑例如阿斯匹林，抗血栓試劑例如苄丙酮香豆素鈉，鈣通道拮抗劑例如維拉帕米、地爾硫卓和硝苯地平；血管緊張素轉化酶(ACE)抑制劑例如卡託普利和恩那普利，和β-阻滯劑例如普奈洛爾、特布洛爾(terbutalol)和拉貝洛爾。本發明的化合物還可以與非甾體抗炎藥聯合用藥例如布洛芬、吲哚美鋅、非諾洛芬、甲酚那酸、氟芬那酸、舒林酸。本發明化合物還可以與皮質類固醇聯合給藥。
在小鼠模型中，經皮下植入丸劑給藥的MSE(150mg/kg/天釋放丸劑)阻滯肺中LPS-誘導的VCAM-1和MCP-1的基因表達。
在紐西蘭白兔模型中，口服MSE(150mg/kg/天)6星期可降低總血漿、含ApO-B的和HDL膽固醇含量。對血漿膽固醇的影響還伴隨明顯抑制動脈粥樣硬化損害形成、巨噬細胞聚集以及VCAM-1的表達。
在膽固醇餵食C57黑色和apoE-剔除的小鼠模型中，口服MSE兩星期可選擇性降低含apoB的脂蛋白，但對HDL沒有影響。在高膽固醇血症獼猴模型中，口服MSE兩星期可降低總血漿和LDL膽固醇，而不影響HDL。
在細菌埃姆斯試驗中，MSE不是誘變劑。大鼠以1000mg/kg/天劑量口服MSE兩星期後並不導致死亡，對血清電解質和血細胞比容值也沒有影響。可以觀測到血清LDH、鹼性磷酸酯酶、SGOT和SGPT有升高，但與未處理組沒有統計學差異，也不伴隨肝形態學或組織學變化。
如果是局部用藥用於治療皮膚炎症疾病，所選擇的化合物應該製成皮膚能吸收的形式，從而有足夠的量在病變部位提供治療作用。普羅布考單酯必須是生理學上可接受的。通常來說，治療指數至少為2優選至少5或10的化合物是可以接受的。治療指數定義為EC50/IC50，其中EC50是抑制VCAM-1表達50％時的化合物濃度，IC50為對靶細胞50％毒性時的化合物濃度。可以通過直接細胞計數、錐蟲藍排斥或各種代謝活性研究如加入3H-胸腺嘧啶核甙來測定細胞毒性，這些是本領域技術人員已知的技術。
下面通過實施例進一步闡明本發明，這些實施例用MSE作為模型化合物。這僅僅是用於舉例說明，並不能限制本發明的範圍。通過與此基本上相類似的方式，此處定義的任何其它普羅布考單酯均可用來治療心血管疾病和炎症性疾病。
實施例1人主動脈內皮細胞中VCAM-1的表達圖1是普羅布考單琥珀酸酯和普羅布考在濃度為2.5μM、5μM、10μM和100μM時在體外對人主動脈內皮細胞中VCAM-1表達的作用以單獨TNF誘導的VCAM-1表達百分比形式進行比較的柱形圖。在組織培養孵育箱中，這些細胞在37℃下在細胞培養基中培養16小時。培養16小時後，洗滌細胞，用VCAM-1的抗體孵化。應用VCAM-1抗體的辣根過氧化物酶綴合抗體進行比色ELISA分析來確定結合到細胞的抗體量。結果顯示，在這些條件下，MSE抑制VCAM-1的表達，而沒有觀測到普羅布考對VCAM有作用。
實施例2人主動脈內皮細胞中ICAM-1的表達圖2是普羅布考單琥珀酸酯和普羅布考在濃度為2.5μM、5μM、10μM和100μM時在體外對人主動脈內皮細胞中ICAM-1表達的作用以單獨TNF誘導的ICAM-1表達的百分比形式進行比較的柱形圖。在組織培養孵化箱中，這些細胞在37℃下在細胞培養基中培養16小時。培養16小時後，洗滌細胞，用ICAM-1的抗體孵化。應用ICAM-1抗體的辣根過氧化物酶綴合抗體進行比色ELISA分析來確定結合到細胞的抗體量。結果顯示，在這些條件下，MSE只對ICAM表達有微弱作用，且該作用的濃度依賴性不強；而普羅布考對ICAM表達沒有作用。
實施例3人主動脈內皮細胞中MCP-1的表達圖3是10μM的普羅布考單琥珀酸酯、50μM的普羅布考和TNF對人主動脈內皮細胞(HAEC)中MCP-1表達的作用進行比較的柱形圖。這些細胞單獨用TNF或者用TNF和10微摩爾普羅布考單琥珀酸酯聯合處理四小時。收集細胞培養基，應用基於顏色的ELISA分析來定量MCP-1的含量。結果顯示普羅布考單酯比普羅布考本身在更大程度上抑制MCP-1的表達。MCP-1是一種化學引誘蛋白，能在動脈粥樣硬化損害部位募集單核細胞。
實施例4體外人主動脈內皮細胞中普羅布考單琥珀酸酯對基因表達的影響圖4表示RNA中VCAM-1和MCP-1基因表達的RNA印跡分析，其中的RNA是從LPS-攻擊的ApoE剔除小鼠肺中分離得到。小鼠皮下給藥MSE、普羅布考和安慰劑400mg，為90天釋放丸劑。1星期後，這些動物腹膜內注射1mg/kgLPS。兩小時後處死這些動物，冷凍肺用於RNA分離。通過變性1.0％瓊脂糖膠電泳對該RNA按照大小進行分級分離，將其轉移到尼龍膜，用小鼠JE-特異性32P標記的cDNA探針進行雜交，然後脫膜，先用小鼠VCAM-1特異性cDNA再用雞β-肌動蛋白特異性cDNA探針進行雜交。
實施例5脂類餵食兔中普羅布考單琥珀酸酯對血漿膽固醇的影響圖5是普羅布考單琥珀酸酯和普羅布考對脂類餵食兔中血漿總膽固醇和脂蛋白膽固醇含量的作用的柱形圖。用含有0.5％重量比的MSE或普羅布考的高脂食物(0.5％膽固醇和3％椰子油)餵食兔三星期。對照組用不含藥物的同樣食物餵食。用快速液相色譜從總血漿中分離脂蛋白部分，並分析膽固醇含量。MSE導致所有類型脂蛋白有統計學上明顯的降低，而普羅布考只導致HDL膽固醇的降低(p＜0.05)。
實施例6兔餵食高膽固醇3星期後，MSE和普羅布考血藥濃度的比較在高脂類食物(0.5％膽固醇和3％椰子油)中，MSE或普羅布考以0.5％重量比濃度對兔給藥3星期。用乙醚從血漿中提取出藥物，用高壓液相色譜進行分析。結果顯示MSE和普羅布考的血漿含量類似，儘管如上面實施例所示，這些化合物對血漿膽固醇和脂蛋白含量的作用有顯著性差異。
實施例7MSE對NF-kB活化的影響單獨用TNF或者用TNF組合25微摩爾MSE或PDTC處理人主動脈內皮細胞1小時、2小時或4小時。洗滌細胞，製備細胞核提取物，通過VCAM-1啟動子探針進行凝膠移位分析。結果證明MSE不影響NF-kB的活化，而PDTC抑制NF-kB的活化。
實施例8用膽固醇餵食兔6星期後，MSE對膽固醇含量的影響用高脂肪高膽固醇(0.5％)食物或者用該食物結合0.5重量/重量(約150mg/kg/天)的AGE-3或普羅布考餵食紐西蘭白兔6星期。圖8是六星期後普羅布考單琥珀酸酯對脂類餵食兔的總膽固醇、LDLc、VLDLc，ILDLc，HDLc和甘油三酯(TG)的作用柱形圖。6星期後，用快速液相色譜從總血漿中分離出脂蛋白，分析膽固醇和甘油三酯的含量。如實施例8所示，與用普羅布考處理時相比，用AGE-3處理時總膽固醇以及VLDL和IDL中的膽固醇降低得更多。
實施例9高膽固醇血症中AGE-3對動脈粥樣硬化進程的影響處死如實施例8中描述的兔，獲得主動脈。主動脈用蘇丹IV著色，分析著色的程度。圖9是未處理的脂類餵食兔和用MSE處理的脂類餵食兔的損害覆蓋的主動脈表面積百分比圖。接受AGE-3的兔的主動脈染色較輕，這表明用普羅布考單琥珀酸酯處理的兔中動脈粥樣硬化降低。
用VCAM-1或Ram-11抗原對對這些主動脈切片進行免疫染色用於VCAM-1表達或巨噬細胞聚集。用AGE-3處理明顯降低VCAM-1的表達和巨嗜細胞聚集(即約大於75％)。在類似的實驗中，對於降低VCAM-1的表達和巨嗜細胞的聚集方面，同樣劑量普羅布考的效果差得多(小於25％)。
實施例10高膽固醇血症猴中AGE-3可逆地降低LDL通過餵食高脂類膽固醇食物使獼猴患有高膽固醇血症，然後再給藥AGE-3。然後用AGE-3對猴口服給藥2星期(100mg/kg/天)。在此期間，猴血清LDL膽固醇降低的百分比範圍為4-60％。然後終止給藥，在第29天時檢查血清膽固醇含量。膽固醇含量恢復到處理前的水平，並維持在該水平。
實施例10圖10是普羅布考單琥珀酸酯(微摩爾)的血漿含量作為治療天數的函數圖。如圖所示，MSE的血漿含量基本上維持恆定。
實施例11圖11是口服普羅布考單琥珀酸酯(150mg/kg/天)兩星期後的ApoE-KO小鼠和對照組中總膽固醇、VLDL、IDL、LDL、HDL和甘油三酯(單位mg/ml)進行對比的柱形圖。
實施例12圖12是在服用普羅布考單琥珀酸酯期間及服用該藥物後高膽固醇血症猴子LDL血漿含量隨時間天數的可逆性降低圖。
實施例13圖13是高膽固醇血症猴中普羅布考單琥珀酸酯對血清LDL的作用的柱形圖。
實施例14圖14表示大鼠兩星期口服普羅布考單琥珀酸酯1000mg/kg/d對總蛋白、鈣、磷酸酯、葡萄糖、血液尿素氮和膽固醇的影響和對照組相比較的柱形圖(以任意單位)。
實施例15圖15表示大鼠兩星期口服普羅布考單琥珀酸酯1000mg/kg/d對白蛋白、肌酸酐、尿酸和總膽紅素的影響和對照組相比較的柱形圖(以任意單位)。
應該注意關於對總膽固醇和LDL的影響，小鼠和兔以及猴相比，MSE和普羅布考的作用是有區別的。MSE降低膽固醇和LDL的作用，在兔和猴中比在小鼠中的效果明顯強得多。在小鼠中，MSE與普羅布考具有相同的效果，即如果對這兩個因素有作用的話也只有很小的作用。然而，在所有測試的動物種類中，MSE可以抑制VCAM-1的表達。
III藥物組合物人、馬、犬、牛和其它動物尤其是哺乳動物，只要其患有此處所述的任意-種疾病包括VCAM-1介導的心血管疾病和炎性疾病，就可以通過對患者給藥在可藥用載體或稀釋劑中有效量的一種或多種上面確定的化合物或者其可藥用衍生物或鹽來進行治療。這些活性物質可以通過任何合適的途徑給藥，例如口服、非腸道給藥、靜脈給藥、真皮內給藥、皮下或局部給藥。
此處所用的術語可藥用鹽或配合物是指能保持所需生物學活性的上述已確定化合物的鹽或配合物，它們顯示最小量的不需要的毒理學效應。這些鹽的非限制性實施例為(a)無機酸(例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸和硝酸等)的酸加成鹽，有機酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、蘋果酸、抗壞血酸、苯甲酸、鞣酸、雙羥萘酸、海藻酸、聚穀氨酸、萘磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸)的加成鹽；(b)與多價金屬陽離子(例如鋅離子、鈣離子、鉍離子、鋇離子、鎂離子、鋁離子、銅離子、鈷離子、鎳離子、鎘離子、鈉離子和鉀離子等)形成的鹼加成鹽；或者與有機陽離子形成的鹼加成鹽，其中的有機陽離子為N，N-二苄基乙二胺、D-氨基葡萄糖、銨、四乙基銨或乙二胺；或(c)(a)和(b)的組合物；例如鞣酸鋅鹽等。
活性化合物包含在可藥用載體或稀釋劑中，其量足以對患者給藥治療上的有效量而不引起治療病人嚴重的毒性效應。對於所有上面提出的疾病，優選的活性化合物劑量範圍約0.1-500mg/kg，優選1-100mg/kg/天。根據母體化合物的給藥劑量，可以計算出可藥用衍生物的有效劑量範圍。如果衍生物本身顯示活性，可以應用衍生物的重量按照上面方法估算出有效劑量，或者通過本領域熟練技術人員已知的其它方式估算出有效量。
對於全身給藥，該化合物可以以任意適合的單位劑型合宜地給藥，包括但不限於含1-3000mg、優選5-500mg活性成分/單位劑型。通常25-250mg的口服劑量是適宜的。給藥活性成分應該使活性化合物的峰值血漿濃度達到約0.1-100mM、優選約1-10mM。這是可以達到的，例如通過靜脈注射任選地在生理鹽水中或水介質中的活性成分溶液或製劑，或者以活性成分的大丸劑給藥。
藥物組合物中活性化合物的濃度將依據藥物的吸收、分布、失活和排洩速率以及本領域熟練技術人員已知的其它因素而定。應該注意根據所需減輕疾病的嚴重性的不同，劑量值也可以發生變化。還應該理解對於任何具體的對象，根據個體需要和給藥人員或監督給藥人員的職業判斷，應該隨時調整具體的劑量範圍，此處舉出的濃度範圍僅僅是舉例性的，並不能限制所要求保護組合物的範圍或實踐。活性成分可以一次性給藥，也可以分成若干小劑量在不同時間間隔給藥。
口服組合物通常含有惰性稀釋劑或可食用載體。它們可以裝入明膠膠囊中或壓成片劑。為了口服治療給藥的目的，活性化合物可以與輔料混合，用作片劑、錠劑或膠囊。還可以含有藥學上相容的粘合劑和/或輔藥作為組合物的一部分。
片劑、丸劑、膠囊和錠劑等可以含有任意的下列成分或與之類似的化合物粘合劑如微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；輔料例如澱粉或乳糖；崩解劑例如海藻酸、初生凝膠(Primogel)或玉米澱粉；潤滑劑例如硬脂酸鎂或氫化植物油；助流劑例如膠體二氧化矽；甜味劑例如蔗糖或糖精；或者矯味劑例如薄荷油、水楊酸甲酯或橙味調味劑(orange flavoring)。當劑量單位形式為膠囊時，除了含有上面所述物質外，它還可以含有液體載體例如脂肪油。另外，劑量單位形式可以含有其它各種能改變劑量單位物理形式的物質例如糖、蟲膠或其它腸溶試劑的包衣。
活性化合物或其可藥用鹽或衍生物可以作為酏劑、混懸劑、糖漿劑、糯米紙囊劑或口香糖劑等形式給藥。除含有活性成分外，糖漿劑還可以含有作為甜味劑的蔗糖以及某些防腐劑、染料、著色劑和調味劑。
該活性化合物或其可藥用衍生物或其鹽還可以與不能削弱其所需要作用的其它活性成分聯合給藥，或者與增強其所需要作用的物質聯合給藥，例如抗生素、抗真菌劑、抗炎藥或抗病毒化合物。活性化合物還可以聯合的試劑有降血酯試劑例如普羅布考和煙酸；血小板聚集抑制劑例如阿斯匹林；抗血栓試劑例如苄丙酮香豆素鈉；鈣通道阻滯劑例如維拉帕米、地爾硫卓和硝苯地平；血管緊張素轉化酶(ACE)抑制劑例如卡拖普利和恩那普利，和β-阻滯劑例如普萘洛爾、特布洛爾(terbutalol)和拉貝洛爾。這些化合物還可以與非甾體抗炎藥聯合給藥例如布洛酚、吲哚鎂辛、阿斯匹林、非諾洛酚、甲滅酸、氟滅酸、舒林酸。該化合物還可以與皮質類固醇聯合給藥。
非腸道給藥、真皮內給藥、皮下或局部給藥用的溶液或混懸液可以包括下列成分無菌的稀釋劑例如注射用水、生理鹽水溶液、不揮髮油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抗菌劑例如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑例如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑例如乙二胺四乙酸；緩衝劑例如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；還有用來調整緊張性的試劑例如氯化鈉或葡萄糖。非腸道給藥製劑可以裝入安瓿、一次性注射器或者由玻璃或塑料製成的多劑量小瓶中。
局部用藥的合適賦形劑或載體是已知的，包括洗劑、混懸劑、軟膏、膏霜、凝膠、酊劑、噴霧劑、粉劑、糊劑、緩釋透皮片、用於哮喘的氣霧劑和用藥於直腸、陰道、鼻或口腔黏膜的栓劑。
可以應用增稠劑、軟化劑和穩定劑來製備局部用藥組合物。增稠劑的例子包括凡士林、蜂蠟、黃原膠或聚乙二醇，溼潤劑例如山梨醇；軟化劑例如礦物油、羊毛脂及其衍生物或角鯊烯。許多溶液劑和軟膏劑可以從市場上購到。
可加入天然或人工矯味劑或甜味劑以增強對黏膜表面產生局部作用的局部用藥製劑的氣味。可以加入惰性染料或顏料，特別是設計用藥於口腔黏膜表面的製劑時可以這樣做。
活性化合物可與載體一起製備，所述載體可以保護化合物不致於快速釋放，例如控釋製劑，包括植入劑和微膠囊給藥系統。可以應用生物降解性、生物相容性聚合物例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。這些製劑的許多製備方法已被專利公開或者是本領域熟練技術人員所熟知的。
如果靜脈給藥，優選的載體是生理鹽水或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。
該活性化合物還可以通過透皮片給藥。製備透皮片的方法對本領域熟練技術人員是已知的。例如參見Brown，L.，和Langer，R.，藥物的透皮釋放，醫學年評(Transdermal Delievery of Drugs，AnnualReview of Medicine)39221-229(1988)，在此引入作為參考。
在另一個實施方案中，活性化合物與載體一起製備，所述載體可以保護化合物不致於在體內快速消除，例如控釋製劑包括植入劑和微囊給藥系統。還可應用生物降解性、生物相容性聚合物例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。這些製劑的製備方法對本領域技術人員來說是顯而易見的。這些物質還可以購自Alza公司和Nova Pharmaceuticals Inc。脂質體混懸劑也可以作為可藥用載體。這些可以通過本領域熟練技術人員已知的方法製備，例如按照美國4,522,811號專利記載的方法(該專利全文在此引入作為參考)。例如脂質體製劑可以這樣製備把合適的脂類(例如硬脂醯磷脂醯基乙醇胺、硬脂醯基磷脂醯基膽鹼、二十烷醯基磷脂醯基膽鹼和膽固醇)溶於無機溶劑中，然後蒸發掉溶劑，在容器表面留下一層乾燥的脂類薄膜。然後把活性化合物或其單磷酸酯、雙磷酸酯和/或三磷酸酯衍生物的水溶液加入到該容器中。用手旋轉容器使脂類物質脫離容器壁以及分散脂類聚合體，這樣形成脂質體懸浮液。
本領域熟練技術人員根據前述的內容可以很明顯地對本發明作出修飾和改變。所有這些修飾和改變的方案均落入本發明的範圍之內。
權利要求
1.普羅布考單酯或其可藥用鹽在製備用於治療炎性疾病的藥物中的用途。。
2.權利要求1的用途，其中單酯的酯基團包括選自以下的官能團飽和及不飽和二羧酸及其鹽、氨基羧酸及其鹽、含醛的羧酸及其鹽。
3.權利要求1的用途，其中單酯是普羅布考單琥珀酸酯。
4.權利要求1的用途，其中單酯是普羅布考單戊二酸酯。
5.權利要求1的用途，其中單酯是普羅布考單己二酸酯。
6.權利要求1的用途，其中單酯是普羅布考單辛二酸酯。
7.權利要求1的用途，其中單酯是普羅布考單癸二酸酯。
8.權利要求1的用途，其中單酯是普羅布考單壬二酸酯。
9.權利要求1的用途，其中炎性疾病是類風溼性關節炎、骨關節炎、哮喘、皮膚炎、多發性硬化或牛皮癬。
10.權利要求1-9任一項的用途，其中藥物適於口服。
11.權利要求1-9任一項的用途，其中藥物適於局部給藥。
12.權利要求1-9任一項的用途，其中藥物適於靜脈給藥。
13.權利要求1-9任一項的用途，其中藥物適於皮下給藥。
14.權利要求1-9任一項的用途，其中藥物適於非腸道給藥。
15.權利要求1-9任一項的用途，其中藥物適於真皮內給藥。
16.權利要求1-9任一項的用途，其中藥物適於透皮給藥。
17.權利要求1-9任一項的用途，其中藥物為人用藥物。
全文摘要
本發明涉及抑制VCAM－1的組合物及方法，特別是治療包括動脈粥樣硬化的心血管疾病或炎性疾病的組合物和方法，包括給藥有效量的普羅布考酯。
文檔編號A01N37/02GK1496740SQ0315306
公開日2004年5月19日 申請日期1998年5月14日 優先權日1997年5月14日
發明者帕特利夏·K·索默斯, 帕特利夏 K 索默斯 申請人:阿特羅吉尼克斯公司, 帕特利夏·K·索默斯