一種大豆轉錄因子及其編碼基因與應用的製作方法
2023-07-06 09:43:26 1
專利名稱：一種大豆轉錄因子及其編碼基因與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及植物基因工程領域中的與耐逆性相關的EREBP/AP2類轉錄因子及其編碼基因與應用，特別涉及來源於大豆的與耐逆性相關的EREBP/AP2類轉錄因子及其編碼基因與應用。
背景技術：
環境中物理化學因素的變化，例如乾旱、鹽鹼、低溫等脅迫因素對植物的生長發育有重要影響，嚴重時會造成農作物大規模減產，培育耐逆性作物是種植業的主要目標之一。目前，應用基因工程育種已經成為增強作物耐逆性的重要方法之一。高等植物細胞有多種途徑應答環境中的各種逆境脅迫。其中轉錄因子起著調控耐逆相關效應基因表達的作用。
大豆是重要的油料作物，是植物蛋白質的主要來源，弄清其耐逆機理，進而改善其耐逆性，具有重要的理論及現實意義。
發明創造內容本發明的目的是提供與耐逆性相關的一種大豆轉錄調控因子及其編碼基因。
本發明所提供的大豆轉錄調控因子名稱為GmDREBa，是具有序列表中序列2胺基酸殘基序列的蛋白質，或者是將序列2的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的胺基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質。
序列表中序列2胺基酸殘基序列是由158個胺基酸殘基組成的蛋白質，是大豆中的EREBP/AP2類轉錄因子。序列2中自氮端到碳端第13-76位胺基酸殘基含有保守的AP2序列，是GmDREBa編碼基因的EREBP/AP2功能保守域。
GmDREBa的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)編碼序列表中序列2蛋白質序列的DNA序列；3)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。
序列表中序列1的DNA序列由846個鹼基組成，該基因的讀碼框為自5』端第140位到第616位鹼基，包含477個鹼基對，在3』端有230個鹼基對非翻譯區，其表達受ABA、低溫、高鹽和乾旱的誘導。
利用任何一種可以引導外源基因在植物中表達的載體，將本發明所提供的GmDREBa的編碼基因導入植物細胞，可獲得對逆境脅迫耐受力得到增強的轉基因細胞系及轉基因植株。使用本發明的基因構建植物表達載體時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強啟動子或誘導型啟動子。為了便於對轉基因植物細胞或植物進行鑑定及篩選，可對所使用的載體進行加工，如加入植物可選擇性標記(GUS基因、螢光素酶基因等)或具有抗性的抗生素標記物(慶大黴素，卡那黴素等)。從轉基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接以逆境篩選轉化植株。攜帶有本發明GmDREBa的表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、微注射、電導、農桿菌介導等常規生物學方法轉化植物細胞或組織，並將轉化的植物組織培育成植株。被轉化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物，如水稻、小麥、玉米、黃瓜、番茄、楊樹、草坪草、苜宿等。本發明的基因對培育耐逆植物品種特別是耐逆大豆品種，提高農作物特別是大豆產量具有重要意義。
下面結合附圖及實施例對本發明做進一步說明。
圖1為GmDREBa蛋白與其它植物同類蛋白的相似性比較圖2為Northern雜交結果具體實施方式
實施例1、大豆GmDREBa編碼基因的篩選及其cDNA的克隆在大豆EST資料庫中進行BLAST檢索，篩選到3個DREB類基因，這些基因均不含內含子。以常規方法從大豆科豐1中提取總DNA，根據3個DREB基因的序列設計3對引物，分別經PCR方法擴增得到3個DNA片段，經序列分析表明它們均編碼含有EREBP/AP2保守結構的DREB類蛋白。GmDREBa是以5』-CCACAATAAGGGGGATGGAT和5』-CGGAACGTACTATCTACTGA為引物擴增得到的。GmDREBa由846個鹼基對組成，讀碼框為5』端第140至616位鹼基，編碼一個由158個胺基酸殘基組成的蛋白質，其中自氮端第13-76個胺基酸殘基保守結構域是該基因的EREBP/AP2功能保守域。
實施例2、GmDREBa與植物中同類蛋白的比較表1 GmDREBa與同類基因的相似性和多樣性百分數
將GmDREBa胺基酸序列與其它植物如水稻、擬南芥及大豆的同類蛋白OsDREB2、AtDREB2A、AtDREB2B和GmDREB1進行了比較，結果如圖1和表1所示，表明其相似性分別為42.1、45.3、39.6、和28.3％。
實施例3、GmDREBa在逆境脅迫下的表達特徵將大豆晉豆23種子種在盆中，生長2個星期後取幼苗分別進行下述各種脅迫處理鹽處理將大豆幼苗移入250mM NaCl溶液中。
ABA處理將大豆幼苗移入100uM ABA溶液中。
滲透脅迫處理將大豆幼苗移入20％PEG溶液中。
低溫處理將大豆幼苗移入4℃水溶液中。
光照培養，並分別在各種處理後0、0.5、1、3、6、12和24小時取樣。收集新鮮葉片1g在液氮中研碎，懸於4mol/L硫氫酸胍中，混合物用酸性苯酚、氯仿抽提，上清中加入無水乙醇沉澱總RNA，之後，溶於水，得到總RNA。分別以GmDREBa DNA為探針按常規方法進行Northern分析。結果如圖2所示，表明GmDREB1明顯受100uM ABA、250mM NaCl、低溫(4℃)以及滲透脅迫誘導。圖2中A為250mM NaCl處理；B為滲透脅迫處理；C為低溫處理；D為100uMABA處理。
序列表16022101211846212DNA213大豆屬大豆(Glycine max(L.)Merrill)4001ccacaataag ggggatggat ctaagtccct ggccgataca ctggcgaaat ggaaagaata 60taatgcctgg ctggagtcta acaatgaagc tgagaagccg gttaggaagg tccctgccaa120gggatcaaag aagggatgta tgaaaggcaa aggaggacct gagaacttgc gctgtaatta180cagaggagtt aggcaaagga catggggaaa atgggttgct gaaatccgag agccaaacag240aggaagtagg ctctggttgg gtacttttcc tactgccatt agcgctgctc ttgcttatga300tgaagcagcg atggcaatgt atggtttctg tgcacgcctc aactttccca atgttcaagt360ttcaactttt tccgaggaac cgtctagaaa ttctccagct gctgcttacc agtcaagaaa420ttctccatct gctaaagaat ccggttctgc gttggtgata ttagagaggt ctgagtgcat480gatgttgtgg aacaattctg gtggagatgc agcagaggat gatggcatgg aagacctttc540cttatcctta agtgtgaaac atgaggaagg ggaggatgaa tcagggacca gttcttccta600tctttcattg tcttgatgta tggtttgcat actctgattt ggccgtggct ggaaatcata660gccttcatag aggtggatga ttagcttagg atgaacgaat cttgatatta gtacctggag720attagctgtt gtaaaattga cttggttgag aagtgttcca ttcttcagga attgacctaa780tgcaatctgg atatccagtc aagttgtaag atgtgaaatg tattttgcct tgcatgatag840atgact 8462102211158212PRT213大豆屬大豆(Glycine max(L.)Merrill)4002
Met Lys Gly Lys Gly Gly Pro Glu Asn Leu Arg Cys Asn Tyr Arg Gly1 5 10 15Val Arg Gln Arg Thr Trp Gly Lys Trp Val Ala Glu Ile Arg Glu Pro20 25 30Asn Arg Gly Ser Arg Leu Trp Leu Gly Thr Phe Pro Thr Ala Ile Ser35 40 45Ala Ala Leu Ala Tyr Asp Glu Ala Ala Met Ala Met Tyr Gly Phe Cys50 55 60Ala Arg Leu Asn Phe Pro Asn Val Gln Val Ser Thr Phe Ser Glu Glu65 70 75 80Pro Ser Arg Asn Ser Pro Ala Ala Ala Tyr Gln Ser Arg Asn Ser Pro85 90 95Ser Ala Lys Glu Ser Gly Ser Ala Leu Val Ile Leu Glu Arg Ser Glu100 105 110Cys Met Met Leu Trp Asn Asn Ser Gly Gly Asp Ala Ala Glu Asp Asp115 120 125Gly Met Glu Asp Leu Ser Leu Ser Leu Ser Val Lys His Glu Glu Gly130 135 140Glu Asp Glu Ser Gly Thr Ser Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Ser145 150 15權利要求
1.大豆轉錄調控因子GmDREBa，是具有序列表中序列2胺基酸殘基序列的蛋白質，或者是將序列2的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的胺基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質。
2.根據權利要求1所述的大豆轉錄調控因子GmDREBa，其特徵在於它是具有序列表中序列2胺基酸殘基序列的蛋白質。
3.根據權利要求2所述的大豆轉錄調控因子GmDREBa，其特徵在於所述序列2中，自氮端第13位到第76位胺基酸殘基保守結構域是所述GmDREBa編碼基因的EREBP/AP2功能保守域。
4.GmDREBa的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)編碼序列表中序列2蛋白質序列的DNA序列；3)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。
5.根據權利要求4所述的基因，其特徵在於所述GmDREBa的編碼基因是序列表中序列1的DNA序列。
6.根據權利要求5所述的基因，其特徵在於所述DNA序列的讀碼框為自5』端第140位到第616位鹼基。
7.含有權利要求4所述基因的表達載體。
8.含有權利要求4所述基因的細胞系。
9.權利要求4所述基因在培育耐逆植物品種中的應用。
10.根據權利要求9所述的應用，其特徵在於所述基因在培育耐逆大豆品種中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種大豆轉錄調控因子及其編碼蛋白與應用，本發明所提供的大豆轉錄調控因子GmDREBa，是具有序列表中序列2胺基酸殘基序列的蛋白質，或者是將序列2的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的胺基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質。本發明還提供了大豆轉錄調控因子GmDREBa的編碼基因。大豆轉錄調控因子GmDREBa的編碼基因對培育耐逆植物品種特別是耐逆大豆品種，提高農作物特別是大豆產量具有重要意義。
文檔編號C12N15/63GK1583789SQ0315394
公開日2005年2月23日 申請日期2003年8月21日 優先權日2003年8月21日
發明者陳受宜, 鞏自忠, 李雪平, 張勁松 申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所