番茄植酸酶基因的製作方法
2023-07-06 01:27:56 2
專利名稱：番茄植酸酶基因的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種生物技術，特別涉及一種植物植酸酶基因。
植酸鹽(Phytin)是一種肌醇六磷酸的複合鹽，是磷、糖和各種金屬離子的重要貯藏形態，大量存在於植物種子及花粉粒中。植物種子或花粉發芽時，在植酸酶的作用下將其水解為肌醇和無機磷酸及其鹽類，作為新生命萌芽時的磷供給，為種子萌發和幼苗生長所利用。最初人們對植酸酶研究的興趣來自飼料工業，因植酸是一種強抗營養劑，常與食物中人和動物所必須的鈣、鐵、鋅、鎂等鏊合形成難溶性植酸鹽，降低其生物利用率，植酸酶能有效降解植酸鹽，提高食物和土壤中磷和其他微量元素的生物利用率。目前植酸酶製劑主要用於飼料加工業中的添加劑。最近歐共體推出了三種植酸酶製劑，即荷蘭Gise-rocades公司的「自然磷」(Natuphos)，美國Allzyme公司的「奧吉美」植酸酶(Allzyme Phytase)和芬蘭AIKO Biotechnology公司推出的豬多酶系列產品(如多酶SP、TP、SF等)。這些製劑仍是一種黑麴黴發酵產物，雖可節省磷，但酶製劑加工成本高、價格昂貴，實用推廣難度較大，而且容易產生過敏反應，不能用作食品添加劑。
隨著世界人口增加，磷礦資源短缺日見突出。日本作為磷礦石主要進口國，首先意識到磷資源短缺的威脅，率先把目光轉向運用基因工程方法探索高效利用土壤有機磷(土壤有機磷主要以植酸態、核酸、磷脂態等植物不能直接吸收利用的形態存在)的新途徑。最近，日本北海道大學分離了分泌性磷酸酶基因，試圖用轉基因方法培育高效分泌磷酸酶的作物，作為應付磷資源危機的對策之一。然而，酸性磷酸酶雖然分解核酸態和磷脂態有機磷活性較強，但對土壤中有機磷的主要形態——植酸態有機磷的分解能力極低。因此，酸性磷酸酶轉基因作物實用性和推廣價值很低。
自植酸酶由日本學者Suzuki等(1902年)在米糠中發現以來。科學家對植酸酶進行了長期研究。植酸酶能有效降解植酸鹽，提高食物和土壤中磷和其它微量元素的生物利用率，由此植酸酶的開發利用，引起人類和動物營養學家關注。隨著分子克隆技術的迅速發展，80年代後期，對植酸酶基因克隆的研究也逐漸興起。目前，國內外有關曲酶植酸酶基因克隆研究較多，但對植物植酸酶基因克隆研究較少，聯網檢索(1970-1999年)查出關於植酸酶基因克隆研究的文獻16篇，其中有15篇是關於麴黴(A.niger)植酸酶基因克隆的研究報導。已經克隆的麴黴(A.niger)植酸酶基因有PhyA,PhyB和熱穩定三種類型。麴黴(A.niger)植酸酶基因已獲得歐洲專利(EP0420358-A 40 03-APR-1991)。但是，從微生物分離的植酸酶基因用於食品開發，容易引起過敏反應和人們心理恐懼，不易被消費者接受。因此，麴黴植酸酶基因不能用於開發人類的食品添加劑。此外，將麴黴植酸酶基因導入植物培育轉基因作物，同樣會帶給人們過敏危害和心理恐懼。為此科學家一直期望能夠從植物中分離並克隆植物植酸酶基因。法國的S.Maugenest等(1997)雖然從玉米幼苗中克隆了植酸酶基因，遺憾的是該基因在大腸桿菌中未表達出有活性的植酸酶，無產品開發和實用價值。
目前國內外尚未見番茄植酸酶基因的報導。
本發明的目的是分離一種可用作開發且易於消費者接受，無過敏反應的植酸酶高效分泌型酵母食品添加劑，緩解磷資源短缺，培育土壤有機磷高效利用型農作物新品種的番茄植酸酶基因。
本發明的內容是番茄植酸酶基因含1356鹼基對，蛋白質編碼區包括完整的閱讀框，編碼為452個胺基酸蛋白質，該基因的鹼基順序及編碼蛋白如
圖10所示。
番茄植酸酶基因與麴黴植酸酶基因PhyA有30個胺基酸相似(
圖10中畫底線部分)，與玉米植酸酶基因有63％同源率，但屬不同的植酸酶基因。
番茄植酸酶基因，通過轉基因技術可研製土壤有機磷高效利用型作物新品種轉基因大豆、食品添加劑和保健食品、植酸酶分泌型酵母飼料添加劑。
本發明的番茄植酸酶基因分離方法是採用異硫氰酸胍法從發芽3-4天的番茄幼苗中提取出總RNA，用Oligo(dT)纖維素親和層析分離純化mRNA。以mRNA為模板，Oligo(dT)為引物用逆轉錄法合成雙鏈cDNA。將cDNA與EcoRⅠ接頭連接後克隆到表達載體λgtll的單一EcoRⅠ位點，經體外包裝後感染宿主菌Y1090，構建了番茄幼苗cDNA文庫。用顏色篩選法篩選重組子，然後用植酸酶抗體做探針進行免疫篩選，得到兩個陽性克隆。挑取陽性克隆噬菌斑擴增後純化DNA，切出插入片段，獲得全長cDNA克隆Phyt1，將該cDNA克隆到大腸桿菌後表達出有活性的植酸酶蛋白。
下面結合附圖和實施例對本發明作進一步詳細描述。實施例1番茄植酸酶基因分離方法及過程
1．總RNA提取
圖1是番茄幼苗總RNA電泳圖譜。泳道12.8μg，泳道27.5μg，泳道315.0μg。採用異硫氰酸胍法從發芽3-4天的番茄幼苗中提取出總RNA。
2．mRNA的分離與純化圖2是mRNA親和層析洗脫圖譜。用Oligo(dT)纖維素親和層析法分離純化mRNA。
圖3是mRNA電泳圖譜。泳道1mRNA 2μg，泳道2-33μg，泳道4上過柱的總RNA。
3．cDNA合成圖4是cDNA合成的條件和基本過程。以mRNA為模板，Oligo(dT)為引物用逆轉錄法合成雙鏈cDNA。
圖5是cDNA鹼變性凝膠電泳放射性自顯影結果。泳道1為樣品第一鏈cDNA，泳道2為對照第一鏈cDNA(1.2kb)，泳道3為樣品雙鏈cDNA，泳道4為對照雙鏈cDNA(1.2kb)。
4．cDNA文庫構建圖6是cDNA與EcoR Ⅰ接頭連接、DNA的磷酸化過程及反應條件。將cDNA EcoRⅠ接頭連接後克隆到表達載體λgtll的單一EcoRⅠ位點，經體外包裝後感染宿主菌Y1090，構建了番茄幼苗cDNA文庫。
圖7是cDNA插入片斷與λgtll載體的連接過程。
5．植酸酶基因克隆的篩選。
圖8是目的克隆的免疫探針篩選結果。箭頭所指目的克隆噬菌斑。用顏色篩選法篩選重組子，然後用植酸酶抗體做探針進行免疫篩選，從1.5×105個克隆中篩選出兩個陽性目的克隆，命名為Phyt1和Phyt2。
6．目的基因DNA片段的回收與檢測圖9是含目的插入片斷的λgtll DNA克隆(Phyt1)電泳結果。泳道1為λgtll DNA，泳道2為λgtll NDA經EcoRⅠ酶切；泳道3為重組λgtll NDA經EcoRⅠ酶切。
挑取陽性克隆噬菌斑擴增後純化DNA，切出插入片段，採用瓊脂糖電泳檢測，證明cDNA克隆Phyt1為全長，cDNA克隆Phyt2為非全長片段。
7．Phyt cDNA測序
圖10是番茄植酸酶基因的鹼基序列和編碼蛋白圖中奇數行表示基因的鹼基序列(A、C、G、T)，偶數行表示翻譯為蛋白質的胺基酸序列。
採用雙脫氧末端終止法和核酸序列自動分析儀對該cDNA克隆Phyt1進行測序，結果表明，該cDNA包括完整的閱讀框，含1356鹼基對，番茄植酸酶基因的蛋白質編碼區。如
圖10所示8．番茄植酸酶在大腸桿菌中的表達
圖11是番茄植酸敏基因表達載體結構圖譜。Phyt1為番茄植酸酶基因，Hc、Ps、Hp為限制性內切酶位點。番茄植酸酶基因表達載體構建、轉化及測試步驟如下①分泌性表達構建將植酸酶基因克隆到分泌性表達載體pINⅢ-(lppp-5)-ompA的EcoRⅠ位點，構建載體載體pINⅢ-Phyt1，如
圖11所示。
②轉化大腸桿菌用LE392製備感受態細胞，將含番茄植酸酶基因的重組載體導入大腸桿菌細胞，藉助lpp(脂蛋白基因啟動子)進行表達，通過Amp篩選出轉化菌落。
③植酸酶活性測定通過以植酸鈣為底物，用測定每分鐘無機磷釋放量的方法測定細胞內外植酸酶活性，結果顯示，重組體分泌性植酸酶活性比對照高10倍以上。
實施例2土壤有機磷高效利用型轉基因大豆開發
圖12是番茄植酸酶中間載體的構建過程
圖13是轉植酸酶基因大豆植株
圖14是轉植酸酶基因大豆植株的Southern和Northern檢測結果。SSouthern雜交結果，N Northern檢測結果(b,c為對照)。
轉基因大豆的分子檢測，用Southern和Northern印跡雜交鑑定外源基因存在和表達狀況。
土壤有機磷高效利用型轉基因大豆開發步驟如下①構建含植酸酶基因中間質粒載體，如
圖12所示。將番茄植酸酶基因Phyt1克隆到載體Co24的EcoRⅠ位點，構建含植酸酶的中間載體。
②將植酸酶基因轉移到土壤農桿菌(三親交配法)。
③用農桿菌介導法進行大豆遺傳轉化，選適當的外植體(如7-10天無菌苗子葉節等)，與含植酸酶基因的供體菌共培養，進行轉化，通過誘導培養、分化培養和生根培養等過程獲得轉基因大豆植株，如圖書館3所示。用Southern法進行分子雜交檢測結果，如
圖14所示。可見，植酸酶基因已整合到植物染色體上，並能表達高活性的植酸酶(比對照高3-5倍)。
實施例3植酸酶分泌型酵母飼料及食品添加劑開發
圖15是番茄植酸酶基因分泌性酵母表達載體構建過程。運用轉基因技術在番茄植酸酶基因上遊添加酵母α-因子前導序列，構建分泌性表達載體，導入麵包酵母菌，篩選出能大量分泌植酸酶的酵母工程菌，開發高效植酸酶分泌型酵母飼料和食品添加劑。可按下列步驟實施合成①合成45個鹼基對的酵母α-因子前導序列。
②將酵母α-因子分泌前導序列DNA片段與植酸酶基因Phy t1連接與擴增。
③表達載體構建將含酵母α-因子分泌前導序列和植酸酶基因Phy t1的全基因片段克隆到酵母表達載體pYX212，構建重組表達載體pXPh1。如
圖15所示。
④酵母細胞轉化將重組質粒表達載體pXPh1引入酵母細胞，得到攜帶酵母α-因子分泌前導序列和植酸酶Phy t1的全基因克隆。
⑤植酸酶表達與分泌活性鑑定對攜帶植酸酶基因的酵母工程菌進行培養，測定不同時間培養液(分泌到細胞外的)和細胞內植酸酶活性(用植酸鈣為底物，測定無機磷釋放量)，鑑定植酸酶表達與分泌效果。
⑥試製酵母工程菌乾粉食品和飼料添加劑樣品，進行動物實驗，對營養促進效果和食用安全性進行研究。
本發明的優點和積極效果是我們分離的番茄植酸酶來源於植物，編碼植物植酸酶蛋白，表達活性高，不會引起人類過敏反應，可通過轉基因技術在番茄植酸酶基因上遊添加酵母α-因子前導序列，構建分泌性表達載體，導入麵包酵母菌，篩選出能大量分泌植酸酶的酵母工程菌，開發高效植酸酶分泌型酵母飼料和食品添加劑。酵母營養豐富無毒無害、本身富含蛋白質和維生素等營養成分，再導入來源於植物的植酸酶基因，開發植酸酶高效分泌型酵母食品和飼料添加劑，既能補充營養，又能增加食物和飼料中礦質元素的營養有效性和蛋白質消化率，提高其能量利用效率。既無過敏之憂，易於被消費者接受，又省去植酸酶分離和製劑加工過程，成本低廉，具有很大的經濟效益和社會效益。本發明可直接用於開發新型保健食品和高效飼料添加劑，適應人們對健康食品的新需求，對推動畜牧養殖業的發展有重要意義。番茄植酸酶基因也可通過轉基因技術開發土壤有機磷高效利用型作物新品種，有效循環利用土壤「再生磷」，緩解磷資源短缺，保證農業持續穩定發展，具有深遠意義。
權利要求
1．一種番茄植酸酶基因，其特徵在於該基因含1356鹼基對，蛋白質編碼區包括完整的閱讀框，編碼為452個胺基酸蛋白質，該基因的鹼基順序及編碼蛋白如下1 ATGGACGTCTCTGCTGTAGCAGCAAAGGTGTGGGGTCAAACTACTAAATCCGGACTGGCAGTCCCCGCCGAGAGCAAGGCC1 M D V S A V A A K V W G Q T T K S G L A V P A E S K A82 CCGGCAAGCCAAGAAGACGGCGTCGATCAGGGGGGGATGACTGATCTGTGGGGTCAATACGACAAGGCAAACGAACAGGCG28 P A S Q E D G V D Q G G M T D L W G Q Y D K A N E Q A163 CTAGCGATGCATGGAGCGCGGAACGAGGAGCTCATGATGTACTCCGCTCTCAAGTCGGAGACGCAGAACGCGACCTACCTC55 L A M H G A R N E E L M M Y S A L K S E T Q N A T Y L244 TATGCCTTCAGCGACTGCTACACGTACAGCTTGGGTCTTGACGACTCCCAGAACGTCCGCATCACGTACGAGCGTTCGGAC82 Y A F S D C Y T Y S L G L D D S Q N V R I T Y E R S D325 GGCGAATCGCTAACACTCGTCGCCAAGTTCTACCAGGACTACGTCGTCTACGGCCTCAACGCGTGCTTGCAGAACGTCCGC109 G E S L T L V A K F Y Q D Y V V Y G L N A C L Q N V R406 AACTGCTGCATCGCCTCCGGCGCCATCGACAAGATCGAGGGCTTCTACGACGCCCTCAAGGATCCTCGTGCCGAATCCGCC136 N C C I A S G A I D K I E G F Y D A L K D P R A E S A487 GCCAACCTCGACCCAGGCGCCGCGGAGGCGTCCGATACCGTCGAAGCCATGTGGCAGACGTTCGTCCCCCAGCGGAGCCTC163 A N L D P G A A E A S D T V E A M W Q T F V P Q R S L568 TCCCTCCAGAACGACTCCCGCGCCCTCACAGACACACTCAAGCTGGAGAAGATCGACTTCGCCGAGCTTGTGCGGAGGCAC190 S L E N D S R A L T D T L K L E K I D F A E L V R R H649 CAGCTCCGGCTCGGGTACGGCAGCAAGGGCGAGGAGTTCGAGGACCTGGACGACACCCAGAAGCTGGAGGTGTACAACGAT217 Q L R L G Y G S K G E E F E D L D D T Q K L E V Y N D730 ATCTGCTCCTTCGACGGGCGGGCGGGGCTAACCAAGCTGTCCTTCTCATCGGGCACCCATGACGAAGGCCCTCCAATTGCA244 I C S F D G R A G L T K L S F S S G T H D E G P P I A811 GCCACGACGTGGGCGCAGGCGGTGAGCGTCTTCATCATGGGCCCGACCCAGCTGGCGTGGCGTCTGACCCACACGGGCCAC271 A T T W A Q A V S V F I M G P T Q L A W R L T H T G H892 GAGGTGGAGGCCATCCTCAGCCCGGCTACCAACCTCCTGGCGGGGTCCATTCTCTTTGCCGTGGAGGCCGTCAAGGGCGCG298 E V E A I L S P A T N L L A G S I L F A V E A V K G A973 GCGACCGTGGAGGCGGTCGCAAACATGCAGTGTCTCGTCTTTGCTTGCTTGGTTAATGATTTCATTGTGGGCGCCATCCAG325 T T V E A V A N M Q C L V F A C L V N D F I V G A I Q1054 GGGCTGATCTTCGTCGGCGTCAGCGGCCTCCTCATTAACCTCATCATCGGCTCCCCTAGGAAGGTGCCTGACATGAGCAAG352 G L I F V G V S G L L I N L I I G S P R K V P D M S K1135 CTCATGGGGTGTTGGGTTGTCATGACCGTCGATAGCGCCCTTCATGACAACGGCTCTGCCTTGGGGTCCTGTACCTTCGAT379 L M G C W V V M T V D S A L H D N G S A L G S C T F D1216 ACTATCGACACGAGCCCGTTTACCAACCCGCTCCAGTCTACTCACTACGCGGGTTGGTCGGATTGGCTGGAGACCTTTGCT406 T I D T S P F T N P L Q S T H Y A V W S D W L E T F A1297 ACTTGGATCTCGACCCCGGACACCCATCCGCTCAACGTCACTCTCCCGGCGGACGCGGAG 1356433 T L I S T P D T H P L N V T L P A D A E452
2．一種應用權利要求1所述的番茄植酸酶基因，其特徵在於通過轉基因技術可用於研製土壤有機磷高效利用型作物新品種轉基因大豆、食品添加劑和保健食品、植酸酶分泌型酵母飼料添加劑。
全文摘要
本發明公開了一種番茄植酸酶基因。現有的植酸酶基因來源微生物,易產生過敏反應,不能作食品添加劑。本發明提供了含1356鹼基對的番茄植酸酶基因,452個胺基酸蛋白質;其編碼包括完整的閱讀框,因來源於植物植酸酶,無過敏反應,用轉基因技術可研製有機磷高效利用型作物新品種、食品添加劑和保健食品、飼料添加劑。以適應現代人對健康的需求、促進「再生磷」的有效循環利用,並可推動農業、畜牧養殖業持續穩定發展。
文檔編號A23L1/30GK1313392SQ0010297
公開日2001年9月19日 申請日期2000年3月13日 優先權日2000年3月13日
發明者李明剛, 劉訊, 姬生鍵, 張敏, 郝亞桓, 龔雪琴 申請人:李明剛