三疣梭子蟹ptssr17微衛星DNA標記的檢測技術的製作方法

2023-07-05 21:23:36

專利名稱：三疣梭子蟹ptssr17微衛星DNA標記的檢測技術的製作方法
技術領域：
本發明屬於三疣梭子蟹微衛星DNA分子遺傳標記技術，具體說是一種三疣 才炎子蟹ptssrl7孩i衛星DNA標記的衝全測技術。
技術背景本發明做出之前，國內外在其他蟹類中有相關的研究報導，Pamela C. Jensen等在對鄧傑內斯蟹(^/7cer鵬^Wer)的研究中，設計了 99個孩吏衛星 引物，並對其中的9個進行了合成。在進一步的研究中，依據其擴增產物的多 態性情況、等位基因大小和是否易於計數等特點選取了 6個引物應用於進一步 的研究。利用尼龍膜雜交法，Masatsugu takhano等在鋸緣青蟹(正蟮，Sc///a "rra&)中發現5個具有可變性的微衛星位點。David Gopurenko等在鋸緣青 蟹(沙蟮，W"/Z7，0^3//7)的研究中篩選到5個微衛星位點。利用常規 方法，E. S Yap等在遠海梭子蟹(A""/7i^ /7e/^/c^)中篩選到7個含有二 核苷酸重複單元、1個含有四核苷酸重複單元的微衛星位點。0. Puebla等在蛛 雪蟹(C力/^7oece&s 中篩選出5個孩支衛星標記。H. S. AN等利用PCR篩選法，在中華絨螯蟹(fr/oc力e/r ^// e/^h)基因組富集文庫中篩選出9個 新的微衛星位點。B.貼nfling等在中華絨螯蟹中篩選到12個具有高度多態性 的微衛星位點。這些重要經濟蟹類的微衛星DNA標記的開發，已應用於親緣關 系鑑定、種群多樣性研究中。目前在國內，除常玉梅等報導了中華絨螯蟹微衛星 DNA的篩選情況外，很少有蟹類微衛星方面的研究報導。至今為止，尚未見有 三疣梭子蟹微衛星DNA4企測技術方面的報導。4鼓衛星(microsatellites) 或稱簡單序歹寸重複(s imple sequence repeats ， SSR)是指由1~6個核苷酸組成的筒單串聯重複DNA序列。迄今研究過的所有 生物種類中都發現了它的存在，並且分布密度很大。由於微衛星廣泛分布於基因 組中，具有密度大、多態性豐富、高度雜合且穩定性好、遵循孟德爾分離定律 共顯性遺傳、易於PCR擴增等特點，已成為近年來最引人注目的新型DNA標記， 並廣泛應用於生物資源的家系譜系認證、基因連鎖分析、遺傳圖譜構建、種質 鑑定、種群遺傳多樣性等許多研究領域。 發明內容本發明的目的是提出一種三疣梭子蟹ptssrl7微衛星DM標記的檢測技術， 主要利用建立的三疣梭子蟹部分基因組文庫中的ptssrl7的孩t衛星DNA序列， 使用Oligo (Version 6. 31)和Primer Premier (Version 5.00)軟體在其核心 序列的兩端設計相應的PCR引物，將引物序列合成後對三疣梭子蟹的個體進行 PCR檢測，從而快速地檢測三疣梭子蟹每個個體在此微衛星區的遺傳變異，獲 得該引物對三疣梭子蟹在p t s s r 17序列區的遺傳變異圖譜，通過該圖譜直觀地 表現出每個個體的基因型。本發明的目的是通過以下技術方案實現的 一種三疣梭子蟹ptssrl7微衛星DNA標記的檢測技術，其特徵在於其技術操作程序為首先提取三疣梭子蟹 基因組DNA並稀釋備用；再利用三疣梭子蟹基因組文庫中的ptssrl7微衛星核 心序列，在其序列兩端設計特異性引物；然後使用該引物對三疣梭子蟹不同地 理群或三疣梭子蟹群內個體的基因組DNA進行PCR擴增，對PCR產物進行變性 聚丙烯醯胺凝膠檢測；利用產物出現的條帶進行分析，確定每個個體的基因型， 從而獲得三疣梭子蟹在ptssrl7核心序列區高度遺傳變異的多態性圖譜。提取三疣梭子蟹基因組DNA，將其稀釋為50ng/ jli 1,每個PCR反應中加入 2ja 1，反應總體積為25 m 1。ptssrl7微衛星核心序列的特異性引物序列分別為正鏈5，-CCGAGTAATCAGCAAGTGTCT—3，，負鏈3， —ATCCTGTTTCTGTCCTCCCT—5' , 4吏用該 引物時的退火溫度為54°C。PCR擴增的加樣參數為每個PCR反應總體積為25 m 1,包括lOOng三疣梭 子蟹基因組DNA; 10X PCR Buffer, 2. 5jul; Mg + + 2. Ommol/L; Tag酶lu; dNTP各0. lmmol/L ;本發明的引物各0. 2 y mol/L;力a ddH20至25 n 1。使用該 引物時設置PCR儀的程序參數為94。C變性2min; 94°C40 sec, 54。Clmin, 72 °C， lmin， 25個循環；72。C延伸5 min, 4。CM呆存。PCR產物的檢測將PCR產物在6°/。的變性聚丙烯醯胺凝膠，12W恆功率電 泳1 ~ 1. 5h進行分離。將膠板通過10°/。的水醋酸溶液20min —蒸餾水6min — 0. 1% 的硝酸銀溶液25min-3%的碳酸鈉溶液顯色數分鐘，終止反應即可得到三疣梭 子蟹在ptssrl7基因座位高度遺傳變異的多態性圖鐠。應用該引物和所述的4支術方法，可以檢測三疣4炎子蟹的每個個體在ptssr 17 微衛星核心區的遺傳變異，通過聚丙烯醯胺凝膠電泳圖鐠即可讀出基因型，方 便、快捷、準確。其次，相對於其它分子遺傳標記技術而言微衛星標記符合孟 德爾遺傳模式，呈共顯性遺傳，因此，可以區分個體是純合子和雜合子狀態。本發明適用於三疣梭子蟹群體遺傳標記、系譜認證、遺傳圖譜構建等應用。 ptssrl7的PCR引物是本發明的核心，可在三疣梭子蟹總群檢測中呈現高度遺 傳變異的多態性。本發明技術具有以下優點(1)本發明可快捷的獲得三疣梭子蟹的ptssrl7遺傳標記基因座位呈現 高度遺傳變異的多態性圖譜，方法簡便，所得結果可直觀地檢測出三疣梭子蟹 在此位點的每個個體的基因型；(2 )本發明主要應用於三疣梭子蟹群體間遺傳標記、系譜認證和遺傳圖譜 的構建等。


圖1本發明的ptssrl7引物對三疣梭子蟹20個個體的^全測圖譜，編號1-20 是三疣梭子蟹的20個個體，M是DL2GG0標準分子量。
具體實施方式
下面通過實施例詳細名又述本發明在三疣一麥子蟹ptssrl7孩史衛星核心序列 DNA分子遺傳標記技術方法。首先提取三疣衝復子蟹基因組DNA並稀釋備用；再4利用三疣梭子蟹基因組文庫中的含有ptssrl7微衛星核心序列，在其序列兩端 設計特異性引物；然後使用該51物對三疣梭子蟹不同地理群或三疣梭子蟹群內 個體的基因組DNA進行PCR擴增，對PCR產物進行聚丙烯醯胺凝膠電泳;險測； 利用產物出現的條帶進行分析，確定每個個體的基因型，並獲得三疣梭子蟹在 ptssrl7核心序列區高度遺傳變異的多態性圖譜。
1、 三疣梭子蟹基因組DNA的提取取肌肉組織100mg,剪碎後iOv 1. 5ml 離心管中，加入pH8. 0的TE溶液(10mmol/L Tris-CI， 10畫1/L EDTA ) 500 p 1,用研磨棒研磨。加入10 % SDS溶液25 ja 1 ，混勻。加入20mg/ml蛋白酶K 4jal，混勾，55。C消化2. 5 ~ 3h。重蒸酚i由^是兩次，每次10min， 12000轉/min 離心5min，耳又上清；酚氯仿(l: 1 )抽提一次，10min， 12000轉/min離心 5min，取上清；氯仿抽提一次5min， 5000g離心5min,取上清。力口入1/25體 積的5mol/L NaCl溶液，混勻後再加入兩倍體積的-20°C的無水乙醇沉澱DNA 15min;挑出的DNA,用70%的乙醇洗滌數十分鐘，^f吏DNA乾燥，用滅菌水500 M 1充分溶解後，定量將其稀釋成50ng/ ja 1的濃度備用。
2、 微衛星引物的設計在三疣梭子蟹基因組文庫基礎上，利用微衛星DNA 兩側的序列在同一物種相對於核心序列的高度^f呆守性，在ptssrl7核心序列的 兩端設計特異性引物，用其擴增出該位點的微衛星DNA片段。由於微衛星核心 序列突變率相對較高，造成微衛星DNA核心序列重複次數的增加或減少，即微 衛星DNA序列長度的變化，這是檢測微衛星多態性的主要依據。本發明的 ptssrl7微衛星核心序列區域兩端的特異性引物序列為正鏈5，-CCGAGTAATCAGCAAGTGTCT-3，，負鏈3， -ATCCTGTTTCTGTCCTCCCT-5，，使用該引 物時，其退火溫度是54。C。
3、 PCR擴增
首先加樣，加樣量如下三疣^f麥子蟹基因組DNA (50ng/jjl) ， 2|il; 10X PCR Buffer, 2. 5jil; Mg + + (25mmol/L) , 2|il; Tag酶 (5u/y 1 ) ， 0.2 pl; dNTP (各2. 5mmol/L) ， 2 ju 1 ;本4支術的引物(各10Pmo1/ja 1) ， 2pl; 加滅菌水至25 iu 1。其次，進行PCR反應，其PCR擴增儀程序參數為94。C變 性2min; 94。C40sec， 54。Clmin, 72。Clmin, 25個循環；72。C延伸5min， 4°C 保存。
4、 PCR產物的檢測PCR反應結束後，將產物在8°/。的變性聚丙烯醯氨的凝 膠中進行電泳，電泳儀的功率為12瓦，電泳的時間在1 ~ 1. 5h左右，即可終止。 將膠板通過10%的水醋酸溶液20min —蒸餾水6min —0. 1%的硝酸銀溶液25min —3%的碳酸鈉溶液顯色數分鐘，終止反應即得到如圖l所示的多態性圖譜。
權利要求
1、一種三疣梭子蟹ptssr17微衛星DNA標記的檢測技術，其特徵在於其技術操作程序為首先提取三疣梭子蟹基因組DNA並稀釋備用；再利用三疣梭子蟹基因組文庫中的ptssr17微衛星核心序列，在其序列兩端設計特異性引物；然後使用該引物對三疣梭子蟹不同地理群或三疣梭子蟹群內個體的基因組DNA進行PCR擴增，對PCR產物進行變性聚丙烯醯胺凝膠檢測；利用產物出現的條帶進行分析，確定每個個體的基因型，從而獲得三疣梭子蟹在ptssr17核心序列區高度遺傳變異的多態性圖譜。
2、 按照權利要求1所述的三疣梭子蟹ptssrl7微衛星DNA標記的4全測技術， 其特徵在於提取三疣梭子蟹基因組DM,將其稀釋為50ng/ m 1 ，每個PCR反應 中力口入2jul，反應總體積為25 ill 1。
3、 按照權利要求1所述的三疣梭子蟹pt ssr 17微衛星DNA標記的檢測技術， 其特徵在於其ptssrl7微衛星核心序列的特異性引物序列分別為正鏈5，-CCGAGTAATCAGCAAGTGTCT-3，，負《連3， -ATCCTGTTTCTGTCCTCCCT-5'，使用該 引物時的退火溫度為54°C。
4 、按照權利要求1所述的三疣梭子蟹pt s s r 17微衛星DNA標記的檢測技術， 其特徵在於其PCR擴增的加樣參數為每個PCR反應總體積為25 ju 1,包括100ng 三疣一炎子蟹基因組DNA; 10X pcr Buffer, 2. 5 m 1; Mg + + 2. Ommol/L; Tag 酶lu; dNTP各0. lmmol/L ;本技術的引物各0. 2 jumol/L;加ddH20至25 jj 1; 使用該引物時設置PCR儀的程序參數為94 °C變性2min; 94 °C 40 sec, 54 °C 1 min, 72°C， lmin, 25個循環；72。C延伸5 min， 4。C保存。
5、按照權利要求1所述的三疣梭子蟹ptssrl7微衛星DNA標記的檢測技術， 其特徵在於對PCR產物的檢測將PCR產物在6%的變性聚丙烯醯胺凝膠，12W 恆功率電泳1 ~ 1. 5h進行分離；將膠板通過10°/。的冰醋酸溶液20min —蒸餾水 6min—0. 1%的硝酸4艮溶液25min—3%的碳酸鈉溶液顯色數分鐘，終止反應即可 得到三疣梭子蟹在ptssrl7基因座位高度遺傳變異的多態性圖譜。
全文摘要
一種三疣梭子蟹ptssr17微衛星DNA標記的檢測技術，其特點是首先提取三疣梭子蟹基因組DNA並稀釋備用；再利用三疣梭子蟹基因組文庫中的ptssr17微衛星核心序列，在其序列兩端設計特異性引物；然後使用該引物對三疣梭子蟹不同地理群或三疣梭子蟹群內個體的基因組DNA進行PCR擴增，對PCR產物進行變性聚丙烯醯胺凝膠檢測；利用產物出現的條帶進行分析，確定每個個體的基因型，從而獲得三疣梭子蟹在ptssr17核心序列區高度遺傳變異的多態性圖譜。可快捷的獲得三疣梭子蟹的ptssr17遺傳標記基因座位呈現高度遺傳變異的多態性圖譜，方法簡便，所得結果可直觀地檢測出三疣梭子蟹在此位點的每個個體的基因型。主要應用於三疣梭子蟹群體間遺傳標記、系譜認證和遺傳圖譜的構建等。
文檔編號C12Q1/68GK101294217SQ200810017118
公開日2008年10月29日 申請日期2008年6月20日 優先權日2008年6月20日
發明者萍 劉, 宋來鵬, 健 李, 高保全 申請人:中國水產科學研究院黃海水產研究所