一株陰溝腸桿菌及其應用的製作方法

2023-07-05 19:43:21

專利名稱：一株陰溝腸桿菌及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一株微生物及其應用，屬於生物技術領域。
背景技術：
腐胺的化學名稱為1，4-丁二胺，生物化學試劑和藥物中間體。也是尼龍-46、尼 龍_6及尼龍-66的原料，尤其是尼龍-46廣泛用於汽車、摩託車的零部件材料，以代替金 屬；尼龍-66用於電子產品的材料；酸性氣體吸收劑。目前，製備方法有四種(l)丙烯腈與 氰化氫反應，生成乙二氰，在催化劑作用下加氫而得；(2)以吡咯為原料，在碳酸鈉存在下 與鹽酸羥胺反應，生成丁二肟，再在鈉汞齊作用下，在無水乙醇中加熱而得；(3)以2，5_二 氨基戊酸為原料，加熱催化脫羧而得。由此可見，目前腐胺的生產方式能源消耗量大，對環 境也有汙染。我國腐胺需求量大，但國內企業生產能力和產品質量有限，從國外進口價格很 高。 通過微生物代謝產生腐胺(鳥氨酸在微生物產生的鳥氨酸脫羧酶的作用下，脫羧 產生腐胺)，獲得高濃度腐胺液，然後分離腐胺，可降低腐胺的生產成本和能源消耗，也成為 研究的主要課題。

發明內容
本發明的目的在於針對目前腐胺生產存在的問題，提供一種微生物並通過該微 生物代謝產生腐胺，獲得高濃度腐胺液。 本發明的目的是這樣實現的 一 株陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae) xlcad001，其特徵在於保藏號為CGMCC No. 3162，菌落在VRBDA瓊脂培養基上，30°C培養 24h，紅白色菌落，1.0-1. 5X0. 3-0.6ym，短杆，革蘭氏陰性，發酵葡萄糖產酸，該菌株在普 通顯微鏡下呈杆狀，該菌株16SrDNA的Genbank登陸號為GQ890353。 在本發明中，VRBDA培養基為酵母浸膏3g，蛋白腖7g，膽鹽1. 5g，氯化鈉5g，乳糖 10g，中性紅0. 03g，結晶紫0. 002g，瓊脂15g，蒸餾水1000ml， PH值7. 3-7. 5。
—株保藏號為CGMCC No. 3162的陰溝腸桿菌的應用，其特徵在於從斜面挑取菌 落接種於裝有A培養基的試管中，37t:靜置培養24小時，試管中的接種量為105cfu/ml。在 相同培養基反覆活化五次後；將最後活化後的菌液接種到B培養基中37t:靜止培養4天， 接種量為106cfu/ml ;將培養後的菌液10000轉離心10分鐘，取上清液，獲得高濃度腐胺液， 高濃度腐胺液的腐胺含量為4452. 74ii g/ml ; 所述的A培養基為加入O. 1% L-鳥氨酸的腸細菌增菌肉湯培養基；所述的B液體 培養基為加入0. 005%磷酸吡哆醛和0. 1% L-鳥氨酸的腸細菌增菌肉湯培養基。
在本發明中，腸細菌增菌肉湯培養基為蛋白腖10g，葡萄糖5g，磷酸氫二鉀2g，磷 酸二氫鈉8g，蒸餾水1000mL，在115。C滅菌15min， pH值7. 2 7. 4。 本發明的優點在於由於陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)xlcad001產腐胺 能力強，在上述方法製得的培養液中，腐胺含量可達到4452. 74ii g/ml，用此方法生產腐胺將極大降低生產成本和減少汙染。


圖1是陰溝腸桿菌在普通顯微鏡下的照片；
圖2是標樣的高效液相色譜圖； 圖3是高效液相檢測陰溝腸桿菌培養液的色譜圖；
圖4是高效液相檢測腐胺的標準曲線圖。
具體實施例方式
實施例1 菌株的篩選和保藏 培養基 腸道菌增菌肉湯培養基蛋白腖10g，葡萄糖5g，磷酸氫二鉀2g，磷酸二氫鈉8g，蒸 餾水1000mL，在115。C滅菌15min， pH值7. 2 7. 4。 下層培養基蛋白腖5g，酵母膏5g，牛肉膏5g，氯化鈉2. 5g，葡萄糖0. 5g，吐溫lg， 硫酸鎂0. 4g，硫酸錳0. 03g，磷酸氫二鉀2g，擰檬酸三銨2g，碳酸*丐0. lg，硫酸亞鐵0. 04g， 維生素BA Olg，磷酸吡哆醛0. 05g，瓊脂18克，鳥氨酸(115。C滅菌15min) ;5克，1000ml蒸 餾水，pH5. O，在115。C高壓滅菌15分鐘; 上層培養基溴甲酚紫0.06g，瓊脂20g，1000ml蒸餾水，pH5. 0，在121°C滅菌 10min j VRBDA瓊脂培養基為酵母浸膏3g，蛋白腖7g，膽鹽1. 5g，氯化鈉5g，乳糖10g，中 性紅0. 03g，結晶紫0. 002g，瓊脂15g，蒸餾水1000ml， PH值7. 3_7. 5。 在無菌條件下取20克傳統中式香腸，無菌條件下剪碎後置於裝有180ml已滅菌生 理鹽水的三角瓶中，室溫230轉搖床搖10分鐘，取lml接種於腸道菌增菌肉湯培養基中， 37t:培養24小時，取lml培養液用9ml生理鹽水逐級稀釋到10-100cfu/ml濃度，塗布於產 腐胺檢測下層培養基上，37t:培養48小時。緩慢傾入一薄層上層培養基，10分鐘內結果記 錄完畢，顯紫色的菌落為陽性，顯黃色為陰性，其中，陽性為能產生腐胺的菌株，陰性為不能 產生腐胺的菌株。 挑取陽性菌株，在VRBDA固體培養基純化三次以上，用腸細菌增生肉湯培養基 37。C培養24小時，離心後獲得陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)xlcadOOl菌株。
該菌株的菌落在VRBDA瓊脂培養基上，30 °C培養24h，紅白色菌落， 1.0-1.5X0. 3-0.6ym，短杆，革蘭氏陰性，發酵葡萄糖產酸，該菌株在普通顯微鏡下呈杆 狀。 該菌株根據Gen bank比對結果，命名陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae) xlcad001，2009年7月6日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保 藏號為CGMCC No. 3162。該菌株16SrDNA的Genbank登陸號為GQ890353。
該菌株加入無菌甘油，在-8(TC冰箱保存。
實施例2 高濃度腐胺培養液製備方法3/4頁 培養基 腸道菌增菌肉湯培養基(同實施例1);
製備方法 從斜面挑取菌落接種於裝有A培養基的試管中，37t:靜置培養24小時，試管中的 接種量為105cfu/ml。在相同培養基反覆活化五次後；將最後活化後的菌液接種到B培養基 中37t:靜止培養4天，接種量為106cfu/ml ;將培養後的菌液10000轉離心IO分鐘，取上清 液，獲得高濃度腐胺液. 所述的A培養基為加入O. 1%鳥氨酸的腸細菌增菌肉湯培養基；所述的B液體培 養基為加入O. 005%磷酸吡哆醛和0. 1%鳥氨酸的腸細菌增菌肉湯培養基。
實施例3 腐胺含量檢測方法(高效液相檢測)
1 、生物胺標準溶液的配製 準確稱取色胺、苯乙胺、酪胺、屍胺、腐胺、亞精胺和精胺50mg，用0. 4mol/L的高氯 酸(HC104)定容至50mL，製成lmg/ml儲備液備用。分別取以上標準品儲備液，用0. 4mol/L HC104配製成終濃度分別為5. 0、10、20、30、40、50ii g/ml的標準溶液，避光、4t:冰箱保存。
2、樣品溶液的衍生化 取實施例2的樣品lmL於5ml容量瓶中，加入200 ii L的2N NaOH使之呈鹼性，然 後加入300iiL的飽和碳酸氫鈉溶液進行緩衝，再加入2ml的丹磺醯氯(dansyl chloride) 溶液(濃度為10mg/mL，溶劑為丙酮)，然後放置於4(TC水浴黑暗中反應處理40min。反應 結束後加入100 ii L的氨水中止反應，去除殘留的丹磺醯氯溶液。最後用乙腈定容到5mL。 衍生處理後用0. 22 ii m的有機濾膜過濾後，獲得樣品溶液的衍生物。
3、標準溶液標樣的衍生化 分別取5. 0、10、20、30、40、50iig/ml的標準溶液樣品lmL於5ml容量瓶中，加入
200 ii L的2N NaOH使之呈鹼性，然後加入300 y L的飽和碳酸氫鈉溶液進行緩衝，再加入2ml
的丹磺醯氯(dansyl chloride)溶液(濃度為10mg/mL，溶劑為丙酮)，然後放置於4(TC水
浴黑暗中反應處理40min。反應結束後加入100 ii L的氨水中止反應，去除殘留的丹磺醯氯
溶液。最後用乙腈定容到5mL。衍生處理後用0. 22ym的有機濾膜過濾後，獲得六組樣品溶
液的衍生物。 4、檢測方法為 Agilent 1100檢測系統，AgilentZORBAX XDB-C18 (4. 6 X 250mm， 2， 5 ii m)，流速為 lmL *min-l，紫外檢測波長為254nm，進樣量20 y L，柱溫30°C ，流動相A為水，流動相B為乙
腈，採用梯度洗脫，洗脫程序見表1。
表1梯度洗脫程序
洗脫時間/min流動相A/%流動相B/先
Elution timeMobile phase AMobile phase B
0.035.065. 0
5.030.070. 0
20.00.0100.0
24. 00.0100.0
25. 035.065.0
30.035.065.0 在圖2的生物胺標樣的高效液相圖中1為色胺，2為苯乙胺，3為腐胺，4為屍胺， 5為組胺，6為酪胺，7為亞精胺，8為精胺。本發明的樣品溶液高效液相檢測結果如圖3所 示。由圖3可見，樣品溶液中含有腐胺。 利用上述的檢測方法檢測，響應值為24296892. 9 (參見圖4)，根據標準曲線計算 得到結果為445. 274p g/mg，但由於在檢測過程中把原樣稀釋了 10倍，所以最終腐胺含量 為4452.74ug/mg。 以上各實施例不是對本發明的具體限定。
權利要求
一株陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)，其特徵在於保藏號為CGMCC No.3162，菌落在VRBDA瓊脂培養基上，30℃培養24h，紅白色菌落，1.0-1.5×0.3-0.6μm，短杆，革蘭氏陰性，發酵葡萄糖產酸，該菌株在普通顯微鏡下呈杆狀，該菌株16S rDNA的Genbank登陸號為GQ890353。
2. 根據權利要求1所述的一株陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)，其特徵在於 VRBDA瓊脂培養基為酵母浸膏3g，蛋白腖7g，膽鹽1. 5g，氯化鈉5g，乳糖10g，中性紅 0. 03g，結晶紫0. 002g，瓊脂15g，蒸餾水1000ml， PH值7. 3-7. 5。
3. —株保藏號為CGMCC No.3162的陰溝腸桿菌的應用，其特徵在於從斜面挑取菌落 接種於裝有A培養基的試管中，37t:靜置培養24小時，試管中的接種量為105cfu/ml。在相 同培養基反覆活化五次後；將最後活化後的菌液接種到B培養基中37t:靜止培養4天，接 種量為106cfu/ml ;將培養後的菌液10000轉離心10分鐘，取上清液，獲得高濃度腐胺液，高 濃度腐胺液的腐胺含量為4452. 74ii g/ml ;所述的A培養基為加入O. 1% L-鳥氨酸的腸細菌增菌肉湯培養基；所述的B液體培養 基為加入0. 005%磷酸吡哆醛和0. 1% L-鳥氨酸的腸細菌增菌肉湯培養基。
4. 根據權利要求3所述的一株保藏號為CGMCC No.3162的陰溝腸桿菌的應用，其特徵 在於所述的腸細菌增菌肉湯培養基為蛋白腖10g，葡萄糖5g，磷酸氫二鉀2g，磷酸二氫鈉 8g，蒸餾水1000mL， pH值7. 2 7. 4， 115。C滅菌15min。
全文摘要
本發明涉及保藏號為CGMCC No.3162的一株陰溝腸桿菌，菌落在VRBDA瓊脂培養基上，30℃培養24h，紅白色菌落，1.0-1.5×0.3-0.6μm，短杆，革蘭氏陰性，發酵葡萄糖產酸，該菌株在普通顯微鏡下呈杆狀。應用時，菌落接種於裝有A培養基的試管中，37℃靜置培養24小時，反覆活化五次後，菌液接種到B培養基中37℃靜止培養4天，將菌液10000轉離心10分鐘，取上清液，獲得高濃度腐胺液，其中，A培養基為加入0.1％鳥氨酸的腸細菌增菌肉湯培養基；B液體培養基為加入0.005％磷酸吡哆醛+0.1％鳥氨酸的腸細菌增菌肉湯培養基。
文檔編號C12P13/00GK101701200SQ200910232710
公開日2010年5月5日 申請日期2009年11月27日 優先權日2009年11月27日
發明者劉登勇, 盧士玲, 周光宏, 徐幸蓮, 舒蕊華 申請人:南京農業大學