紙基雙極性電極電化學發光分子開關系統用於快速靈敏基因檢測致病菌的方法與流程
2023-07-05 19:00:51 2
本發明屬於生物檢測技術領域，特別涉及一種紙基雙極性電極電化學發光分子開關系統用於快速靈敏基因檢測致病菌的方法。
背景技術：
基因檢測是檢測致病菌非常重要的一種方法。各種策略和技術，如實時定量聚合酶鏈式反應(RT-PCR)，基於核酸序列的擴增(NASBA)，和環介導等溫擴增(LAMP)法等，已開發用以檢測目標病原體的特徵基因，並已被用作中央研究實驗室的標準方法。然而，這些傳統的方法通常費力和耗時。隨著生物傳感技術的發展，某些光學分析方法，包括比色法，螢光光譜法，化學發光法和電化學發光(ECL)的發展已被開發來解決這些問題。電化學發光(ECL)是結合電化學和化學發光為一體的方法，它作為最靈敏的光學分析技術之一，因為其顯著的優點，其中包括高信噪比(SNR)，高靈敏度和空間可控性，吸引了研究者相當大的興趣。我們的團隊近十年來一直利用ECL進行基因檢測。不幸的是，我們發現，這樣的方法通常需要複雜的探針設計和有線電源，這限制了它在資源極其有限的環境中的床旁診斷(POCT)應用。
雙極性電極作為一種導體，一般置於溶液的微管道中，當微管道兩端施加電壓時，溶液和雙極性電極之間電勢的差別，使其一端成陽極，另一端為陰極，若外加電場足夠大，電活性物質會分別在陽極和陰極發生氧化和還原反應。在過去的十年中，雙極性電極無需導線連接的性質使得它與ECL相結合，已經催生了一個有前途的只需要用一個直流電源控制的新的檢測方法。一個典型的雙極型電極電化學發光(BPE-ECL)檢測系統通常使用三聯吡啶釕作為ECL發光體和三丙胺(TPrA)作為共反應劑。在這種策略中，其陽極發生氧化並發出較強的ECL信號，同時氧氣或其他電活性物質在陰極發生還原。與由一個工作電極，輔助電極，和參考電極構成的傳統的三電極ECL結構相比，BPE-ECL系統已被證明是靈敏度高，並且雙極性電極和外加電源之間無需導線相連，故該檢測裝置的構建更簡便。此外，該系統可以提供一種潛在適於小型化應用的方法。
然而，傳統的BPE-ECL檢測系統通常使用複雜和相當昂貴的微流控技術，將檢測腔室集成為微流控晶片。此外，這些技術需要昂貴的儀器或熟練的技術人員，這限制了它在床旁診斷中的應用。
紙基微流控分析裝置(μPADs)滿足床旁診斷的ASSURED的標準(即，價格便宜，靈敏度高，特異性好，人性化，快速穩定，不需要昂貴的設備和終端用戶使用方便)，作為強大的工具在最近幾年受到了越來越多的關注。μPADs利用紙張提供的毛細作用達到定量和空間控制生物流體的目的，而不需要外部開關或泵，並且可以使用噴墨列印，蠟印或絲網印刷技術製作μPADs。簡單地說，紙基微流控裝置可以被視為常規微流控晶片的變種或經典側向流動試紙條的升級版本。
但是，在紙上標記探針面臨一些挑戰，如需要昂貴探針標記物和難以去除非特異性結合的探針，從而導致相對高的背景信號。此外，大多數紙基檢測通常基於比色法，而當分析物的濃度較低，所使用的定量或半定量分析達不到高靈敏度檢測的要求。由於這些原因，紙基ECL基因檢測方法的應用較少。為了克服這些挑戰，必須開發一種更靈敏的，便宜的，定量和無標記的基因檢測致病微生物的方法。
技術實現要素：
為了克服現有技術的缺點與不足，本發明的目的在於提供一種紙基雙極性電極電化學發光分子開關系統用於快速靈敏基因檢測致病菌的方法。
本發明的目的通過下述技術方案實現：
一種紙基雙極性電極電化學發光分子開關系統用於快速靈敏基因檢測致病菌的方法，包括如下步驟：
將致病細菌的靶毒力基因的DNA分子片段與含有「光開關」分子和TPrA的PBS溶液進行混合，得到混合液；然後將混合液滴到紙基雙極性電極(pBPE)上；將pBPE正面朝向光電倍增管(PMT)，然後將該pBPE放置到暗盒裡；最後，將pBPE的一對驅動電極連接到一個直流電源上，施加驅動電壓；在pBPE的陽極獲得一個ECL信號，將在10s內觀察到的最大的可再現的發光信號作為有效的信號值，即可實現快速靈敏基因檢測致病菌的目的。
所述的致病細菌優選為致病性李斯特菌、致病性大腸桿菌、致病性沙門氏菌、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)、志賀氏桿菌(Shigella)、空腸彎曲菌(campylobacter jejuni)或金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus)(CMCC 26003)。
所述的致病性李斯特菌優選為單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)(CMCC 54007)；
所述的致病性大腸桿菌優選為大腸桿菌O157：H7(Escherichia coli O157:H7)(GW1.0202)；
所述的致病性沙門氏菌優選為鼠傷寒沙門氏菌(salmonella typhimurium)(CMCC 54007)；
所述的單增李斯特菌的靶毒力基因hlyA特異性的引物如下：
上遊引物：5'-AGGAATGACTAATCAAGACAAT-3'；
下遊引物：5'-GGAAGGTCTTGTAGGTTCAT-3'。
所述的「光開關」分子為[Ru(bpy)2dppz]2+或[Ru(phen)2dppz]2+，濃度優選為30μM～0.1mM；更優選為0.1mM；
所述的TPrA的濃度優選為10mM～50mM。更優選為50mM；
所述的PBS溶液為pH＝6.9、0.1M的PBS溶液；
所述的驅動電壓設定為850V。
所述的紙基雙極性電極電化學發光分子開關系統用於快速靈敏基因檢測致病菌的方法，具體包括如下步驟：
(1)細菌DNA提取和PCR擴增
將1mL菌種置於10mL LB培養基中過夜培養12h，然後按照TIANamp細菌DNA試劑盒的試劑和說明書的方法提取細菌DNA，最後重懸在50μL的TE緩衝液中備用；取1μL提取的細菌DNA和一對單增李斯特菌靶毒力基因hlyA特異性的引物加入反應體積為25μL的PCR擴增體系中，按照設定的PCR擴增程序，在熱循環PCR儀中進行擴增，擴增得到的產物的長度為179bp；PCR產物最後用pBPE-ECL系統進行分析。
(2)紙基雙極性電極的製作
絲網印刷的網板的圖案形狀用Adobe Illustrator CS6設計，然後製作成網板(鋁框200目尼龍網板)；網板的開口產生紙的疏水區域，而具有交聯光敏材料的部分，則得到親水性的區域；用蠟印的方法產生親水的通道，然後用絲網印刷的方法將導電碳油墨在紙通道上製作雙極性電極和驅動電極；紙基雙極性電極的製作過程如下：首先，將濾紙裁剪成合適的尺寸(100毫米×80毫米)，並在紙張上通過網板絲網印刷上碳電極，然後置於100℃的烘箱8分鐘，並將其冷卻到室溫；然後，將紙基電極置於紙張通道絲網膜的下方，將固體蠟通過絲網膜擦到紙張上；為了讓更多的固體蠟印到紙上，用光滑的勺狀的金屬器具進一步按壓絲網膜；紙被蠟印之後，和網板一起置於加熱板上，並加熱至80℃，約10秒，以將蠟熔化進紙，以形成疏水屏障。
(3)pBPE-ECL檢測
紙基雙極性電極製作完成後，將步驟(1)中的PCR產物進行pBPE-ECL檢測；首先，將所製備的pBPE裁剪成單個，置於一個3D列印的一對塑料襯底中組裝成晶片；然後，將含有5μL上述PCR擴增產物的溶液與在0.1M的PBS(pH為6.9)中製備的含有[Ru(phen)2dppz]2+和TPrA的混合液定容至25μL，將混合液滴到pBPE的中心。將滴加溶液後的pBPE翻轉，確保pBPE正面朝向PMT，然後將該pBPE晶片放置到暗盒裡。最後，將晶片的一對驅動電極連接到一個直流電源上通電之前，需要等待30～60s，以確保整個紙基晶片的通道被溶液浸潤。接著，施加適當的驅動電壓。之後約5s，在pBPE的陽極可以獲得一個ECL信號。
(4)數據採集和分析
由光電倍增管收集的pBPE陽極的ECL信號被PMT放大，模擬信號被電晶體-電晶體邏輯(TTL)識別，並使用由LabView軟體程序控制的多功能採集卡(PCI-1751，研華，臺灣)進行採集，最終用基於Labview的光子計數的電腦程式記錄，並用於進一步的分析；在實驗中觀察到的ECL信號不是一個穩定的數值，實際上隨著時間衰減，這種現象可是由於發光體的不可逆的分解造成的；實驗中，我們將在10s內觀察到的最大的可再現的發光信號作為有效的信號值。
步驟(1)中所述的PCR擴增體系包含：終濃度0.2U/μL的Taq DNA聚合酶，不同濃度的靶DNA(106copies/μL，105copies/μL，104copies/μL，103copies/μL，102copies/μL和10copies/μL)，0.2mM的dNTP，1×PCR緩衝液，和40nM的每種引物(即上遊引物和下遊引物)。空白對照則不包含DNA模板。
步驟(1)中所述的序列如下：
上遊引物：5'-AGGAATGACTAATCAAGACAAT-3'；
下遊引物：5'-GGAAGGTCTTGTAGGTTCAT-3'。
步驟(1)中所述的PCR擴增程序為：首先95℃下變性5分鐘；循環條件如下：變性95℃30秒，退火56℃30秒，和72℃延伸40秒，上述程序總共進行35個循環；最後延伸8分鐘。
步驟(3)中所述的[Ru(phen)2dppz]2+和TPrA的濃度分別優選為30μM～0.1mM和10mM～50mM。
步驟(4)中所述的光電倍增管的電壓設定為850V。
本發明的基本原理如圖1所示：
在這項研究中，我們首次利用紙質雙極性電極電化學發光(pBPE-ECL)結合「光開關」分子[Ru(phen)2dppz]2+(phen＝1,10-菲咯啉；dppz＝dipyridophenazine)開發了一種低成本，無線，靈敏度高和無標記的致病細菌DNA分析方法。[Ru(phen)2dppz]2+已經發現可以以高親和力插入DNA的鹼基對中，並通過三聯體金屬配體電荷轉換(MLCT)的三重激發態產生一個ECL信號。該方法的檢測原理是基於[Ru(phen)2dppz]2+同時具備「分子光開光」和能發生電化學發光的兩個性質，它在在溶液狀態下，水分子通過氫鍵與嵌入配位體的吩嗪氮原子連接，使得吩嗪氮原子質子化，導致三聯體金屬配體電荷轉換(triplet metal-to-ligand charge transfer，MLCT)激發態失活，從而使得[Ru(phen)2dppz]2+不發生電化學發光反應；然而當將DNA加入到該複合物的溶液中以後，平面的配位體嵌入雙螺旋DNA分子「大溝」部位的鹼基對之間，使吩嗪氮原子受到了保護，三聯體金屬配體處於激發態，可以和三丙胺(TPrA)發生氧化還原反應，並釋放出光子，從而可以觀察到顯著的電化學發光。這種pBPE-ECL裝置通過蠟印製作親水通道，通過絲網印刷製作碳墨BPE作為電子導體加上另外兩個碳墨電極作為驅動電極。一對李斯特菌特異性靶向hlyA毒力基因的引物被用於聚合酶鏈反應(PCR)，以產生雙鏈DNA(dsDNA)的擴增產物。「光開關」分子[Ru(phen)2dppz]2+被用來以插入PCR擴增產物雙鏈DNA的鹼基對中，然後將其直接滴加到pBPE-ECL上進行ECL檢測。在優化的實驗條件下，低至10copies/μL單增李斯特菌的基因組DNA的可以被檢測出來。該裝置也被用來從鼠傷寒沙門氏菌，大腸桿菌O157：H7和金黃色葡萄球菌中特異性區分單增李斯特菌。因為該設備構造簡單，一次性的，快速，低成本，無標記並具有靈敏度高的優勢，如果將來以電池作為電源和智慧型手機作為信號讀出，這種pBPE-ECL分子開關系統具有在發展中國家或者在資源有限的偏遠地區用於床旁基因檢測病原菌的巨大潛力。
本發明相對於現有技術，具有如下的優點及效果：
(1)該方法利用分子開關的性質，可以達到非標記檢測的目的；
(2)該紙基雙極性電極電化學發光系統靈敏度高；
(3)該紙基雙極性電極為一次性可拋棄晶片，成本低；
(4)雙極性電極和外加電源之間無需導線相連，故該檢測裝置的構建更簡便。
附圖說明
圖1是紙基雙極性電極電化學發光分子開關系統的檢測原理；
圖2是紙基雙極性電極的尺寸；
圖3是紙基雙極性電極的製作過程示意圖；
圖4是紙基雙極性電極電化學發光分子開關系統的靈敏度分析；
圖5是紙基雙極性電極電化學發光分子開關系統的特異性分析。
具體實施方式
下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。
實施例1
1.細菌DNA提取和PCR擴增
鼠傷寒沙門氏菌(CMCC 50040)，大腸桿菌(O157：H7GW1.0202)，單增李斯特菌(CMCC 54007)和金黃色葡萄球菌(CMCC 26003)購自微生物學(中國，廣州)廣州研究所。引物由上海生工(上海，中國)合成。PCR擴增試劑，包括10×PCR緩衝液(加Mg2+)，三磷酸脫氧核苷酸(的dNTP)混合物和Taq DNA聚合酶均從寶生物工程有限公司(大連，中國)購買。SYBR Green I染料從賽百盛基因有限責任公司(中國，北京)購買。DSTM 2000 DNA marker，其中包含2000-，1000-，750-，500-，250-和100bp的DNA片段，是由東勝生物科技有限公司(中國，廣州)提供。按照TIANamp細菌DNA試劑盒的試劑和說明書的方法提取細菌DNA，然後重懸在50μL的TE緩衝液。PCR擴增反應體積為25μL體系，包含：終濃度0.2U/μL的Taq DNA聚合酶，不同濃度的靶DNA(106copies/μL，105copies/μL，104copies/μL，103copies/μL，102copies/μL和10copies/μL)，0.2mM的dNTP，1×PCR緩衝液，和40nM的每種引物(即，上遊引物和下遊引物)。空白對照則不包含DNA模板。李斯特菌靶毒力基因hlyA的PCR擴增產物的長度為179鹼基對。所述序列如下：
上遊引物：5'-AGGAATGACTAATCAAGACAAT-3'；
下遊引物：5'-GGAAGGTCTTGTAGGTTCAT-3'。
PCR反應在熱循環PCR儀中進行，PCR擴增程序為：首先95℃下變性5分鐘。循環條件如下：變性95℃30秒，退火56℃30秒，和72℃延伸40秒。上述程序總共進行35個循環。最後延伸8分鐘。PCR產物最後用pBPE-ECL系統進行分析。
2.pBPE的製作
濾紙(Ф＝125.0毫米，纖維素濾紙)從杭州沃華濾紙有限公司(中國浙江)購買，適當裁剪以後使用。導電碳油墨購自徐州博匯新材料科技有限公司(中國徐州)(型號CNB-7，<60Ω/cm2)，將其用於驅動電極的製作材料)。固體蠟和光滑匙狀的金屬器皿購自當地百貨公司。用蠟印的方法產生親水的通道，然後用絲網印刷的方法將導電碳油墨在紙通道上製作雙極性電極和驅動電極。絲網印刷的圖案形狀用Adobe Illustrator CS6設計，然後交付給廣州聯昌印刷器材店製作網板(鋁框200目尼龍網板)。網板的開口產生紙的疏水區域，而具有交聯光敏材料的部分，則得到親水性的區域。pBPE晶片的製作過程(見圖3所示)如下：首先，將濾紙裁剪成合適的尺寸(100毫米×80毫米)，並在紙張上通過網板絲網印刷上碳電極，然後置於100℃的烘箱8分鐘，並將其冷卻到室溫。然後，將紙基電極置於紙張通道絲網膜的下方，將固體蠟通過絲網膜擦到紙張上。為了讓更多的固體蠟印到紙上，用光滑的勺狀的金屬器具進一步按壓絲網膜。紙被蠟印之後，和網板一起置於加熱板上，並加熱至80℃，約10s，以將蠟熔化進紙，以形成疏水屏障；得到紙質雙極性電極。所述的紙質雙極性電極的尺寸見圖2所示。
3.pBPE-ECL檢測
TPrA(≥98％，編號：102-69-2)從Sigma-Aldrich公司(聖路易斯，密蘇裡州，美國)購買。晶片製作完成後，進行pBPE-ECL檢測。首先，將所製備的pBPE裁剪成單個，置於一個3D列印的一對塑料襯底中組裝成晶片，然後將晶片的一對驅動電極連接到一個直流電源上。最後，將含有5μL上述PCR擴增產物的溶液與在0.1M的PBS(pH為6.9)中製備的含有0.1mM[Ru(phen)2dppz]2+和50mM TPrA的混合液定容至25μL，將混合液滴到pBPE的中心。將滴加溶液後的pBPE翻轉，確保pBPE正面朝向PMT，然後將該pBPE晶片放置到暗盒裡。通電之前，需要等待30～60s，以確保整個紙基晶片的通道被溶液浸潤。接著，施加適當的驅動電壓。之後約5s，在pBPE的陽極可以獲得一個ECL信號。
4.數據採集和分析
直流電源(型號LW-K605D)從龍威儀表儀器有限公司(中國香港)購買。光電倍增管的電壓(PMT；MP-962型，Perkin Elmer公司，威斯巴登，德國)設定為850V。由光電倍增管收集的ECL信號被PMT放大，模擬信號被電晶體-電晶體邏輯(TTL)識別，並使用由LabView軟體程序控制的多功能採集卡(PCI-1751，研華，臺灣)進行採集，最終用基於Labview的光子計數的電腦程式記錄，並用於進一步的分析。在實驗中觀察到的ECL信號不是一個穩定的數值，實際上隨著時間衰減，這種現象可是由於發光體的不可逆的分解造成的。實驗中，我們將在10s內觀察到的最大的可再現的發光信號作為有效的信號值。
為了驗證我們的新開發的pBPE-ECL檢測系統的靈敏度，將不同濃度的李斯特菌DNA(106copies/μL，105copies/μL，104copies/μL，103copies/μL，102copies/μL和10copies/μL)分別加入PCR擴增體系中進行擴增。擴增後的DNA產物然後分別用0.1mM的[Ru(phen)2dppz]2+和50mM TPrA孵育，來評估pBPE-ECL檢測系統的靈敏度。如圖4所示，ECL強度隨著DNA濃度從10copies/μL到106copies/μL的增加而呈線性增加的趨勢。不同濃度靶DNA和陰性對照的最大ECL發光信號如圖所示。這表明該系統能夠高靈敏度地檢測單增李斯特菌。
為了進一步驗證pBPE-ECL檢測系統的特異性，將從單增李斯特菌，鼠傷寒沙門氏菌，大腸桿菌O157：H7和金黃色葡萄球菌中提取的106copies/μL靶DNA與之前使用的單增李斯特菌相同的特異性引物分別加入PCR擴增體系中進行PCR擴增。擴增後的DNA產物然後分別用0.1mM的[Ru(phen)2dppz]2+和50mM TPrA孵育，來評估pBPE-ECL檢測系統的特異性。如圖5所示，只有單增李斯特菌特異性擴增得到的PCR產物結合[Ru(phen)2dppz]2+以後表現出顯著的ECL信號。鼠傷寒沙門氏菌，大腸桿菌O157：H7，金黃色葡萄球菌和對照組表示沒有雙鏈PCR產物產生，所以ECL信號較低。這些結果證實，所設計的pBPE-ECL檢測系統可以在鼠傷寒沙門氏菌，大腸桿菌O157：H7，金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌中特異性區分出單增李斯特菌。
上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。