烏黴肽及其製備方法和使用的製作方法
2023-07-19 04:50:06 5
專利名稱：烏黴肽及其製備方法和使用的製作方法
技術領域：
本發明涉及可以通過刺黑烏黴(Memnoniella echinata)FH 2272，DSM 13195在培養基中的發酵而獲得的新型肽衍生物，稱為烏黴肽(memno peptide)，烏黴肽的製備方法和烏黴肽作為藥物的使用(例如用於生產治療心功能不全的藥物)。
在西方工業國家，心血管疾病仍然排在死因的第一位。其中診斷患有心功能不全的患者所佔比例並非無足輕重。心功能不全理解為指心臟的功能不充分。心臟不能產生相當於哺乳動物需求的輸出。心功能不全指急性或慢性心臟無能、負荷不足、或甚至靜歇，從而未能集聚代謝所必需的血液輸出或接受靜脈回流。在這種心臟狀況中，補償機制諸如心率、每搏輸出量、或高血壓不再能夠維持正常的心臟輸出。心功能不全具有多種起因，例如炎症性和退化性心肌變化、冠狀動脈循環紊亂、和心肌梗塞。心功能不全導致外周循環變化，導致呼吸、腎功能、和電解質平衡的損害，還導致骨骼肌力量降低，最終通常導致死亡。
心功能不全通常發生於老年人。35-64歲的發病率是每年每千人3例，65-94歲是每年每千人10例。75歲的死亡率相對於35-44歲年齡組升高了幾乎200倍。根據在美國進行的調查，死亡率在1970-1983年之間保持大致恆定。對於德意志聯邦共和國，推測是相同數目。超過50％的患者死於診斷後的前5年。這一統計檢查自身說明心功能不全對於人類而言極其重要，但是它也確認了當今醫師可利用的醫學治療不太適宜。
考慮到當今治療的不適宜性，已經形成了應當導致心臟治療創新的新概念。心肌和骨骼肌收縮從而進行機械工作的能力依賴於(1)可收縮的結構元件(肌原纖維)和(2)肌原纖維可利用的化學能(ATP)，它在收縮過程中轉變成機械能。在收縮過程中肌原纖維縮短。這可能是由運動神經脈衝發動的，在其作用下鈣離子(Ca2+)在幾毫秒內由胞外空間進入肌質空間，並騰空鈣貯存。在心肌不全(心功能不全)中，肌原纖維中的Ca2+濃度可能降低。然而，Ca2+離子是該收縮裝置的激活所不可缺少的。若需求增加，則Ca2+通常在依賴Ca2+的膜Mg2+-ATP酶(該酶也稱為肌(內)質網Ca2+ATP酶(SERCA2))的催化下被泵入肌質網(SR)中。根據親水性分析，Ca2+ATP酶包含10個跨膜螺旋和許多膜外環。在胞質側，形成了用於Ca2+和ATP結合、磷酸化、和與調控蛋白受磷蛋白(PLB)相互作用的結構域。後者是一種蛋白質五聚體，位於SR的膜中，並在未磷酸化狀態時對SERCA2發揮抑制影響。在生理學壓力下，PLB發生磷酸化，這增加了SERCA2a的Ca2+親和力，從而增加Ca2+離子在SR中的轉運速率。PLB(一種52個胺基酸的蛋白質)的磷酸化發生於2個胺基酸殘基處絲氨酸-16可能被依賴cAMP的蛋白激酶磷酸化，蘇氨酸-17可能被依賴Ca2+/鈣調蛋白的激酶磷酸化。這種磷酸化引起PLB構象的變化，繼而提高SERCA2對Ca2+的親和力。抗PLB抗體能夠模仿PLB磷酸化效應，從而證實了PLB作為心臟收縮活性調控物的關鍵作用(PhospholambanProtein Strcture，Mechanism of Action and Rolein Cardiac Function(受磷蛋白蛋白質結構、作用機制、和在心臟功能中的作用)，H.K.Simmerman和L.R.Jones，PhysiologicalReviews，78(4)921ff，1998)。因而，SERCA2的激活劑應當可以對心功能不全產生有利影響。
我們令人驚訝的發現真菌菌株刺黑烏黴FH 2272，DSM 13195的培養物包含能夠對心臟和循環展示有利作用的天然物質。分離的活性化合物即烏黴肽是包含特定組成基團的天然物質。這些組成基團包括萜類單位、所謂的polyketide模塊、和含氮基團。
萜類是天然發生化合物，它可以在形式上理解成碳氫化合物異戊二烯的聚合產物。根據異戊二烯基團的數目，可以分成單萜(C10)、倍半萜(C15)、二萜(C20)等。通過取代、環化、重排、氧化等，可以由親本結構形成大量的化合物；因此，文獻中已經描述了數以千計的萜。源自萜的含氮化合物也有報導，但是它們被計入生物鹼(如龍膽生物鹼)(Rmpp Chemie Lexikon(Rmpp氏化學百科全書)，第9版，第6卷，第4508頁及以下，Georg Thiene Verlag，Stuttgart/紐約，1992)。然而，這些萜從根本上不同於依照本發明的烏黴肽，其中萜不含能夠結合氨的polyketide模塊。
含氮萜的其它已知範例是-Stachybocins(J.Antibiotics，481396，1995)；-Stachybotrins(Y.Nozawa等人，J.Antibiotics，50635-645，1997)；-Spirodihydrobenzofuran lactams(J.Antibiotics，4913，1996)；-Nakijiquinones(Tetrahedron，5110867-10874，1995)；-F1839-A至J是具有polyketide模塊的含氮萜(日本專利061864133和08283118)。它們是膽固醇酯酶抑制劑。
這些萜衍生物是由刺黑烏黴和葡萄穗黴(Stachybotrys)和其它屬的多種菌株合成的。它們被描述成內皮素受體的拮抗劑、HIV-1蛋白酶和膽固醇酯酶的抑制劑、和生髮油。肌醇單磷酸酶抑制劑L-671，771也是由菌株刺黑烏黴ATCC 20928的培養物分離得到的(Y.K.T.Lam等人，J.Antibiotics，451397-1402，1992)。
依照本發明的烏黴肽具有不同的活性範圍。一個顯著特徵是它們對SERCA2從而對心功能不全具有激活效應。
因而，本發明涉及通式(I)的化合物 其中R1和R2一起是雙鍵鍵合的O、或H2、或H與OH，或者H與O-C1-C4-烷基；R3和R4一起是雙鍵鍵合的O、或H2、或H與OH，或者H與O-C1-C4-烷基；R8選自H、OH、C1-C4-烷基、和O-C1-C4-烷基，諸如O-甲基；R6是通式(II)的基團 其中R9是H或糖苷鍵鍵合的糖，或是通式(III)的基團 其中R10是H或糖苷鍵鍵合的糖；且其中若R6是通式(II)的基團，則R5與通式(II)的碳原子C9成鍵且R7是H，或R7與通式(II)的碳原子C9成鍵且R5是H，而若R6是通式(III)的基團，則R5和R7是H；A是胺基酸；n是選自1-12的整數，其中每一個A可以相同或不同；其中通式(I)異吲哚環中的氮原子是(A)n基團第一個胺基酸的N端胺基氮；或其鹽類或衍生物；但條件是當n是1，且R1和R2一起是雙鍵鍵合的O，且R3和R4一起是H2，且R6是通式(II)的基團，且R5與通式(II)基團的碳原子C9成鍵，且R7是H，且R8是H，且R9是H時，A是除了Glu以外的胺基酸。
在通式(I)中，(A)n可以是選自下組的至少一種天然胺基酸Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Ser、Thr、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、Asp、His、Glu、Asn、Gln、Cys、和Met。(A)n可以是具有2-12個胺基酸的肽鏈。在一個實施方案中，(A)n包含10個胺基酸。
C1-C4-烷基是具有1-4個碳原子的直鏈或支鏈烷基，諸如甲基、乙基、異丙基、和叔丁基。
糖可以是己糖，例如己醛糖，諸如甘露糖、葡萄糖、或半乳糖，其任選被額外的基團取代，諸如C1-C4-烷基或NH2。
本發明還涉及通式(I)的化合物的所有顯而易見的衍生物。衍生物指鹽、還原產物、酯、醚、縮醛及醯胺、和N-烷基化產物，還有所有的旋光對映體、非對映體、和所有的立體異構體形式。
在一個實施方案中，通式(I)的化合物具有通式(IV) 其中基團R1、R2、R3、R4、R9、和(A)n具有上述定義。在通式(IV)中，R1和R2一起可以是雙鍵鍵合的O，R3和R4一起可以是H2，且R9可以是H。
在一個實施方案中，本發明的化合物是通式(IVa)的烏黴肽A，C76H108N16O18S 在該通式中，具有4-甲基和亞甲基的十氫萘結構是萜模塊；取代的異吲哚環是ketide模塊。胺基酸序列Met His Gln Pro His Gln Pro Leu Pro Pro(SEQ ID NO1)是酪蛋白序列的一部分。甲硫氨酸(Met)可以氧化形成亞碸。
通式(IVb)顯示優選的空間形式 其中(A)n具有上述定義。
依照本發明的優選化合物的物理化學和光譜特徵可以概述如下烏黴肽A外觀無色物質，可溶於極性有機溶劑和水穩定性在中性、微酸性介質中穩定實驗式C76H108N16O18S分子量1565.87DaUV吸收(λmax)270nmNMR數據見表1碳原子的編號和相關NMR化學位移是依照環倍半萜的編號流程分類的。
圖1環倍半萜ketolide的編號 表1烏黴肽A在DMSO中的NMR數據(化學位移)-d6於310K
在本發明的一個實施方案中，可以通過將刺黑烏黴FH 2272，DSM13195或其突變體或變體在合適條件下在培養基中發酵直至培養基中存在至少一種通式(I)的烏黴肽並隨後分離烏黴肽而獲得通式(I)的化合物。
因此，本發明還涉及通式(I)的化合物的製備方法，包括將微生物刺黑烏黴FH 2272，DSM 13195或其突變體或變體在合適條件下在培養基中發酵直至培養基中存在至少一種通式(I)的烏黴肽並隨後由培養基分離烏黴肽。
在一個實施方案中，將菌株FH 2272，DSM 13195或其突變體或變體在包含至少一種碳源和至少一種氮源且任選包含常規無機鹽的營養液(也稱為培養基)中發酵直至培養基中存在烏黴肽。然後可以由培養基分離烏黴肽，並任選分離成各個成分和純化。在一個實施方案中，烏黴肽在培養基中積累，並被分離成各個成分。
在另一個實施方案中，用於培養基的至少一種氮源選自胺基酸和肽。用作氮源的胺基酸和肽可以與上文定義的(A)n基團相同。
依照本發明的方法可用於實驗室規模(毫升-升的範圍)和工業規模(立方米規模)的發酵。
培養刺黑烏黴FH 2272的強生產菌落。依照布達佩斯條約的規則，於1999年12月14日將分離菌保藏於Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1B，3300不倫瑞克，德國，編號刺黑烏黴FH 2272，DSM 13195。
刺黑烏黴FH 2272，DSM 13195具有棕綠色菌絲體，且具有黑烏黴屬(Memnoniella)的特徵性分生孢子梗。
菌株刺黑烏黴FH 2272，DSM 13195的突變體和變體也可用於合成依照本發明的烏黴肽的至少一種化合物。可以本身已知的方式通過物理手段生成這些突變體，例如照射，諸如紫外線或X射線，或者通過化學誘變劑，諸如甲磺酸乙酯(EMS)、2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮(MOB)、或N-甲基-N』-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)。可能的變體包括密切相關的真菌物種葡萄穗黴屬(Stachybotrys)，諸如葡萄穗黴(Stachybotrysatra)、Stachybotrys chartarum、或Stachybotrys complementi。
可以依照下列方案篩選合成依照本發明的烏黴肽的至少一種化合物的突變體和變體-發酵後分離菌絲體；-用有機溶劑抽提菌絲體；-使用固相由培養物濾出液提取烏黴肽；-通過HPLC、DC手段或通過生物學活性測試進行分析。
下文所述發酵條件適用於真菌刺黑烏黴FH 2272、保藏的分離菌DSM 13195及其突變體和變體。
在一個實施方案中，刺黑烏黴FH 2272在包含至少一種碳源、酪蛋白蛋白腖作為氮源、和常規無機鹽的營養液中生成烏黴肽A。在一個實施方案中，刺黑烏黴FH 2272是DSM 13195。
用於好氣發酵的可能碳源包括可同化的碳水化合物和糖醇，諸如葡萄糖、乳糖、蔗糖、澱粉、糊精、果糖、糖蜜、甘油、半乳糖、和D-甘露醇，和含碳水化合物的天然產物，諸如麥芽提取物。可能的氮源包括例如胺基酸；肽；蛋白質；胺基酸、肽、和蛋白質的降解產物，諸如酪蛋白、蛋白腖、胰蛋白腖；肉提取物；酵母提取物；花生提取物；種子磨粉，例如玉米、小麥、菜豆、黃豆、和棉花；含種子組合物；醇生產的蒸餾殘液/殘渣；肉粉；銨鹽；和硝酸鹽。在一個實施方案中，至少一種氮源選自(化學)合成獲得的肽和生物合成獲得的肽。營養液任選包含至少一種無機鹽。在一個實施方案中，無機鹽選自氯化物、碳酸鹽、硫酸鹽、和磷酸鹽。硫酸鹽和磷酸鹽可以選自鹼金屬的硫酸鹽、鹼金屬的磷酸鹽、鹼土金屬的硫酸鹽、和鹼土金屬的磷酸鹽，其中鹼土金屬選自鐵、鋅、鈷、和錳。
可以在包含酪蛋白蛋白腖的營養液中形成依照本發明的烏黴肽。在一個實施方案中，營養液包含酪蛋白蛋白腖的濃度範圍是大約0.05-5％。另一個實施方案包含酪蛋白蛋白腖的濃度範圍是0.1-1％。還有一個實施方案包含酪蛋白蛋白腖的濃度範圍是0.2-5％。營養液中可以包含葡萄糖。一個實施方案包含葡萄糖的濃度範圍是0.5-3％。營養液還可以包含玉米漿。在一個實施方案中，營養液包含玉米漿的濃度範圍是0.05-1％。另一個實施方案包含玉米漿的濃度範圍是0.1-0.5％。營養液可以包含痕量的至少一種選自氯化鉀、硫酸鎂、和硫酸鐵的成分。
在一個實施方案中，營養液包含酪蛋白蛋白腖、葡萄糖、玉米漿、和痕量的氯化鉀、硫酸鎂、和硫酸鐵。在另一個實施方案中，營養液包含酪蛋白蛋白腖的濃度範圍是大約0.05-5％，葡萄糖的濃度範圍是0.5-3％、玉米漿的濃度範圍是0.05-1％，和痕量的氯化鉀、硫酸鎂、和硫酸鐵。以百分比表述的數據在每一種情況中均是相對於營養液總質量。
在這種營養液中，刺黑烏黴(可以是刺黑烏黴FH 2272，DSM 13195)形成烏黴肽混合物。依照本發明的一種或多種烏黴肽的比率將根據營養液的組成發生變化。此外，培養基的組成可以控制個別烏黴肽的合成，從而甚至根本不生成某種烏黴肽或生成量低於微生物的檢測限制。
可以好氣方式進行該微生物的培養，即例如浸沒於搖瓶或發酵罐中並伴隨振搖或攪動，任選導入空氣或氧氣。溫度範圍可以是大約18-37℃，更窄的範圍是大約20-32℃，仍然更窄的範圍是25-30℃。pH範圍應當在6-8之間，諸如6.5-7.5之間。一般而言，在這些條件下將微生物培養24-300小時，更通常的是36-140小時。
有利的是，可以許多步驟進行培養，即在液體營養培養基中製備至少一次預培養物，然後可以例如以1∶10的體積比接種真正的生產培養基即主培養基。可以通過例如用菌絲體接種營養液隨後培養大約36-120小時(諸如48-72小時)來獲得預培養物。可以通過例如將菌株在固體或液體營養培養基(例如麥芽-酵母瓊脂或馬鈴薯右旋糖瓊脂(用於黴菌的標準培養基，例如來自Difco))上培養大約3-40天(諸如4-10天)來獲得菌絲體。
可以通過培養物pH或菌絲體體積的手段或者通過層析法(諸如薄層層析或高壓液相層析)或生物學活性測試來監控發酵過程。依照本發明的化合物可以存在於菌絲體和培養物濾出液二者中，但是通常在培養物濾出液中存在絕大部分。
下文所述分離過程用於純化依照本發明的烏黴肽，例如烏黴肽A。可以根據天然物質的化學、物理、和生物學特性依照已知方法由培養基分離或純化依照本發明的烏黴肽。為了測試培養基中或各個分離步驟中的烏黴肽濃度，可以使用薄層層析(例如在矽膠上，使用異丙醇/25％NH3作為洗脫劑)或HPLC。可以通過例如呈色試劑的手段來進行薄層層析分離中的檢測，諸如氯磺酸/冰醋酸，方便的將所形成物質的量與校準液進行比較。
為了分離依照本發明的烏黴肽，首先使用常用流程由培養液分離菌絲體，然後使用任選水可混有機溶劑由細胞團塊抽提烏黴肽。有機溶劑相包含依照本發明的天然物質；可以任選的將之真空濃縮，並如下所述進一步純化殘餘物。在一個實施方案中，通過向真菌與培養基的混合物中加入溶劑而由培養物提取烏黴肽。
可以任選的合併培養物濾出液與菌絲體提取物濃縮液，並用合適的水不混有機溶劑(例如正丁醇)進行抽提。隨後分離的有機相可以任選的真空濃縮。為了將有價值產物脫脂，可以用依照本發明的化合物不太可溶的非極性溶劑(例如己烷、石油醚、或二乙醚)稀釋濃縮液。在此過程中，烏黴肽沉澱，而親脂性雜質保持溶解並可以通過常規的固液相分離而除去。
可以將包含烏黴肽的沉澱溶於1/30初始體積的水/甲醇。沉澱在此過程中完全溶解，且可以凍幹。凍乾物(隨後稱為粗製產物)可以包含5-50％烏黴肽，且可用於進一步分離。
可以通過層析法在合適材料(例如分子篩、矽膠、礬土、離子交換劑、或吸收劑樹脂或者在反相(RP))上進行依照本發明的至少一種烏黴肽的進一步純化。可以藉助這種層析法來分離烏黴肽。可以使用緩衝的水溶液或者水與有機溶液的混合液來進行烏黴肽的層析。
水與有機溶液的混合液理解為指所有水可混有機溶劑，諸如甲醇、丙醇、和乙腈，濃度範圍是溶劑的5-80％，更通常的是溶劑的20-50％；或者所有與有機溶劑可混的緩衝水溶液。所用緩衝液可以與上文所述相同。
可以藉助反相層析，例如在MCI(吸收劑樹脂，來自Mitsubishi，日本)或Amberlite XAD(Toso Haas)上或者在其它疏水材料諸如RP-8或RP-18相上進行以不同極性為基礎的烏黴肽分離。此外，可以藉助正相層析例如在矽膠、礬土、諸如此類上進行分離。
可以使用緩衝或酸化的水溶液或水溶液與醇或其它水可混有機溶劑的混合液進行烏黴肽層析。在一個實施方案中，有機溶劑選自丙醇和乙腈。
緩衝或酸化的水溶液理解為指單獨或混和的至少一種溶液。例如，所述至少一種溶液可以選自水、磷酸鹽緩衝液、醋酸銨、檸檬酸鹽緩衝液、和酸。在一個實施方案中，檸檬酸鹽緩衝液的濃度範圍是0-0.5M。酸選自甲酸、乙酸、三氟乙酸、和本領域技術人員知道的所有商品化的酸。在一個實施方案中，商品化的酸的濃度範圍是0-1％。在還有一個實施方案中，酸的濃度是0.1％。
可以使用自100％水開始、至100％溶劑結束的梯度進行層析。使用至少一種溶劑。可以使用兩種或多種溶劑的混合液。在一個實施方案中，進行選自丙醇和乙腈的溶劑的20至50％的線性梯度。
或者，也可以進行凝膠層析或疏水相上的層析。
可以在聚丙烯醯胺或共聚物凝膠上進行凝膠層析，諸如Biogel-P2(Biorad)或Fractogel TSK HW40(Merck，德國或TosoHaas，美國)。
用於純化依照本發明的化合物的另一種很有效的方法可能是使用離子交換劑。例如，可以在陽離子交換劑諸如FractogelEMD SO3-上很有利的分離鹼性烏黴肽A。可以使用pH5-8之間，諸如pH6-7.5之間的緩衝液。可以使用例如升高的鹽梯度來實現洗脫。除了水以外，還可以有利的使用水緩衝液與有機溶劑的混合液作為溶劑。有機溶劑的比率可以是10-90％，諸如30-60％。
上述層析過程的順序是可逆的。
用於純化烏黴肽的另一種很有效的步驟是結晶。可以由有機溶劑和水與有機溶劑的混合液將烏黴肽由溶液中結晶出來。可以本身已知的方式進行結晶，例如通過濃縮或冷卻飽和的烏黴肽溶液。
依照本發明的烏黴肽在固體狀態和在pH3-8例如pH5-7的溶液中是穩定的，因而可以摻入常規的藥物製劑。
向刺黑烏黴培養物中加入期望胺基酸或肽作為前體將有助於含氮烏黴肽的形成。將所提供的胺基酸和肽的氨基與五元環內醯胺(通常是異吲哚環系統)的合成相結合可能是刺黑烏黴種的怪癖。這種結合或起始於氧化過程中的醛前體或起始於內酯氧化階段(開環形式或環狀內酯形式)。刺黑烏黴結合胺的能力是十分令人驚訝的，而且可用於獲得受保護的、轉變後的胺衍生物，諸如胺基酸和肽的萜衍生物。
考慮到有價值的藥物特性，依照本發明的烏黴肽的至少一種化合物可能適合於作為藥物用於人或牲畜醫學。
本發明因而涉及通式(I)的化合物或其生理學可耐受鹽類用於生產治療或預防心功能不全的心臟藥物的用途。
依照本發明的化合物還可用於生產治療心功能不全作為主要或次要原因的疾病諸如循環不全的藥物的用途。
烏黴肽的作用機制尚未確定，但是檢測到顯著效果。
為了檢測模擬PLB磷酸化效應的SERCA2的激活劑，可以進行比色法測試來測定在存在待測物質時狗心臟微粒體中Ca2+ATP酶的活性。可以在96孔微量滴定板中進行測試。由ATP酶促釋放的無機磷酸與鉬酸銨形成藍色複合物，可以在分光光度計中於620nm進行測量。
烏黴肽A自12.5μM的濃度激活SERCA2。
烏黴肽還具有抗微生物作用。
本發明因而涉及通式(I)的化合物或其生理學可耐受鹽類用於生產治療微生物例如細菌感染的藥物的用途。
表3顯示了烏黴肽A針對一些選定細菌的最小抑制濃度(MIC)。表3
除了抗細菌作用以外，依照本發明的化合物還展示微弱的抗黴菌即抗真菌特性，例如針對白色假絲酵母(Candida albicans)。
此外，依照本發明的物質對葡萄糖-6-磷酸移位酶(G-6-P-TL，對葡萄糖代謝從而對糖尿病治療重要的酶)具有某種有利的抑制作用。例如，化合物烏黴肽A展示針對G-6-P-TL的選擇性活性，但是它不抑制輔酶G-6-P磷酸酶。
本發明因而涉及通式(I)的化合物或其生理學可耐受鹽類用於生產治療糖尿病的藥物的用途。
本發明還涉及依照本發明的烏黴肽的至少一種化合物的藥物製劑。
通常可以諸如未稀釋形式施用依照本發明的烏黴肽的至少一種化合物。本發明的一個實施方案是作為與合適賦形劑或載體的混合物使用。可用於藥物的載體可以是常規的和藥物學可耐受的載體和/或賦形劑。
一般而言，可以口服或胃腸外施用依照本發明的藥物，但是直腸施用也是可能的。合適的固體或液體藥物製劑形式是例如顆粒、粉劑、片劑、包衣片劑、(微型)膠囊、栓劑、糖漿、乳劑、懸浮液、氣霧劑、滴劑、或安瓿形式的注射液，和受保護釋放活性成分的製劑，其中常規使用安瓿載體和添加劑和/或賦形劑諸如崩解劑、粘合劑、包衣劑、溶脹劑、助流劑或潤滑劑、調味劑、甜味劑、或增溶劑。可以提及的常用載體或賦形劑是例如碳酸鎂、二氧化鈦、乳糖、甘露醇和其它糖、滑石、乳蛋白、明膠、澱粉、維生素、纖維素及其衍生物、動物或植物油、聚乙二醇、和溶劑諸如無菌水、醇、甘油、和多元醇。
如果合適，可以通過例如在合適聚合物、蠟、諸如此類中包被或包埋顆粒形式的活性化合物而將劑量單位微囊化以用於口服施用，從而延遲釋放或長時間釋放。
在一個實施方案中，可以劑量單位生產並施用藥物製劑，每個單位包含特定劑量的依照本發明的烏黴肽的至少一種化合物作為活性組分。在固體劑量單位諸如片劑、膠囊、和栓劑的情況中，該劑量可高達大約500mg，但是更通常的是大約0.1-200mg；而在安瓿形式的注射液的情況中，可高達大約200mg，但是通常是大約0.5-100mg(每天)。
每日施用劑量通常取決於哺乳動物的體重、年齡、性別、和狀況。然而，在某些情況下，較高或較低每日劑量也可能是合適的。每日劑量的施用可以通過兩種方式進行一次施用單個劑量單位或許多較小劑量單位；或者以特定間隔多次施用復分劑量。
可以使用常規載體和(如果需要)添加劑和/或賦形劑將依照本發明的烏黴肽的至少一種化合物製成合適施用形式而生成依照本發明的藥物。
下列實施例進一步例示了本發明。百分比是重量百分比。混和比率在液體的情況中指體積，除非另有詳細說明。
下列實施例意欲例示本發明而非限制它的範圍。
實施例實施例1製備刺黑烏黴FH 2272，DSM 13195的甘油培養物將無菌300ml厄倫美氏燒瓶中的100ml營養液(麥芽提取物2.0％、酵母提取物0.2％、葡萄糖1.0％、(NH4)2HPO40.05％，pH6.0)接種菌株刺黑烏黴FH 2272，DSM 13195，並在旋轉搖床上於25℃、以140rpm培養7天。然後用2.5ml 80％甘油稀釋1.5ml該培養物，並保存於-20℃實施例2在厄倫美氏燒瓶中製備刺黑烏黴FH 2272，DSM 13195的培養物或預培養物將裝有100ml營養液(10g/L葡萄糖、5g/L酪蛋白蛋白腖、1.7g/L玉米漿液、和7ml微量元素液(10g/L KCl、10g/L MgSO4·7H2O、3.6g/LFeSO4·7H2O、6g/L MgSO4·H2O))的300ml無菌厄倫美氏燒瓶接種斜面管(含2％瓊脂的相同營養液)中培養的培養物或1ml甘油培養物(見實施例1)，並在搖床上以180rpm、於30℃進行培養。在大約120小時後實現了依照本發明的烏黴肽的至少一種化合物的最大產量。對於10升和200升發酵罐的培養，相同營養液中深層培養48-96小時的培養物(接種量大約10％)也能滿足。
7ml 微量元素溶液pH6.5(滅菌前)微量元素液 KCl 10g/L、MgSO4·7H2O 10g/L、FeSO4·7H2O 3.6g/L、MgSO4H2O 6g/L培養時間45小時培養溫度28℃攪動速度300rpm通氣15L/min任選通過重複加入乙醇多元醇液來遏制泡沫形成。在大約35-70小時後實現最大產量。實施例4由刺黑烏黴FH 2272，DSM 13195的培養液分離烏黴肽混合物刺黑烏黴FH 2272，DSM 13195的發酵完成以後，將依照實施例3獲得的培養液(200升)在添加大約2％助濾劑(如Celite)後進行過濾，並用66升甲醇抽提細胞團塊(22升)。將包含有價值物質的甲醇溶液過濾以除去菌絲體，並真空濃縮。用水稀釋濃縮液，並與培養物濾出液(180升)一起應用於預製的17升MCI GEL CHP20P柱。用60％異丙醇(溶於水)-水梯度進行洗脫。以10升為單位分段收集柱流出液(25升/小時)，並合併包含烏黴肽的級分(25％-30％異丙醇)。
真空濃縮產生20升褐色溶液。將6升用磷酸鉀緩衝液平衡於pH7的陽離子交換劑FractogelEMD SO3-裝到層析柱(125mm×500mm)中。將上述20升濃縮液加載至離子交換劑上，在水/甲醇(1∶1)中用1M NaCl(溶於10mM磷酸鉀緩衝液pH7)-10mM磷酸鉀緩衝液pH7梯度進行洗脫。流出液即未結合物質包含中性烏黴肽(49g)。流速是12升/小時；在梯度洗脫過程中以1升為單位進行分段收集。用0.75M(級分31和32)獲得烏黴肽A。合併級分31和32，並真空濃縮至大約500ml。實施例5通過凝膠層析富集烏黴肽將依照實施例4獲得的8g產物應用於容量3.9升且裝有FractogelTSK HW-40s(寬度x高度＝10cm×50cm)的層析柱。以20ml/min的流速抽吸洗脫劑甲醇/水(1∶1)流過層析柱，並分段(20ml)收集流出液。發現烏黴肽A主要存在於級分75-85中。將它們合併並真空除去甲醇。由此得到0.9g活性化合物混合物。實施例6用於檢測烏黴肽的HPLC系統下文所述系統可用於烏黴萜的濃度測試以及分離和定量，例如用於粗製混合物或培養物濾出液。洗脫劑溶於32％乙腈的0.1％三氟乙酸層析柱Nucleosil 100C18AB 250/4，Macherey-Nagel流速1.0ml/min檢測210nm處的紫外吸收在所示條件下，烏黴肽A具有如下停留時間烏黴肽A7.0分鐘。實施例7烏黴肽A的純化將依照實施例5分離並富集的500ml烏黴肽A溶液應用於500mlNucleosil100-7 C18AB柱，並使用溶於0.05％三氟乙酸/水的25-50％乙腈梯度進行層析。流速是50ml/min；級分大小是50ml。發現烏黴肽A存在於級分71-88中。使用恆定溶劑濃度即溶於0.05％三氟乙酸的28％乙腈對合併級分進行重複純化，在凍幹後得到超過95％純的烏黴肽C(100mg)。烏黴肽A的鑑定在恆沸氫氯酸中水解10μg烏黴肽A並在胺基酸分析儀中進行分析。發現了下列常規胺基酸穀氨酸11nmol脯氨酸22nmol組氨酸10nmol
亮氨酸 5.6nmol甲硫氨酸氧化物 5.5nmol紫外吸收λmax位於269nm，305nm(肩)高解析度FAB質譜在m/z 1565.7819Da處顯示強烈的MH+，較好的符合計算質量(C76H109N16O18S，單一同位素)1565.7827Da。MS/MS片段化符合通式(IVa)。
權利要求
1.通式(I)的化合物 其中R1和R2一起是雙鍵鍵合的O、或H2、或H與OH，或者H與O-C1-C4-烷基；R3和R4一起是雙鍵鍵合的O、或H2、或H與OH，或者H與O-C1-C4-烷基；R8選自H、OH、C1-C4-烷基、和O-C1-C4-烷基；R6是選自通式(II) 其中R9是氫原子或糖苷鍵鍵合的糖，和通式(III)的基團 其中R10是氫原子或糖苷鍵鍵合的糖，且其中若R6是通式(II)的基團，則R5是與通式(II)的碳原子C9形成的鍵且R7是氫原子，或R7是與通式(II)的碳原子C9形成的鍵且R5是氫原子，而若R6是通式(III)的基團，則R5和R7都是氫原子；A是胺基酸；n是選自1-12的整數，其中每個A可以是相同或不同的；其中通式(I)異吲哚環中的氮原子是(A)n基團第一個胺基酸的N端胺基氮；或其鹽類或衍生物；但條件是當n是1，且R1和R2一起是雙鍵鍵合的O，且R3和R4一起是H2，且R6是通式(II)的基團，且R5是與通式(II)的碳原子C9形成的鍵，且R7是H，且R8是H，且R9是H時，A是除了Glu以外的胺基酸。
2.依照權利要求1的化合物，其具有通式(IV) 其中基團R1、R2、R3、R4、R9、和(A)n的定義依照權利要求1，或其鹽類或衍生物。
3.依照權利要求2的化合物，或其鹽類或衍生物，其中R1和R2一起是雙鍵鍵合的O，R3和R4一起是H2，且R9是H。
4.依照權利要求1的化合物，其具有通式(V) 其中基團R1、R2、R3、R4、R5、R7、R8、R10、和(A)n的定義依照權利要求1，或其鹽類或衍生物。
5.依照上述任一項權利要求的化合物，或其鹽類或衍生物，其中(A)n是具有2-12個天然胺基酸殘基的肽鏈。
6.依照上述任一項權利要求的化合物，或其鹽類或衍生物，其中(A)n是具有胺基酸序列Met-His-Gln-Pro-His-Gln-Pro-Leu-Pro-Pro(SEQ ID NO1)的肽鏈，其中Met基團任選被氧化形成亞碸。
7.依照上述任一項權利要求的化合物，或其鹽類或衍生物，其中R9或R10是己醛醣。
8.依照上述任一項權利要求的化合物，或其鹽類或衍生物，其可以通過在合適條件下在培養基中培養選自刺黑烏黴FH 2272，DSM 13195或其突變體或變體的真菌，直至培養基中存在化合物，並隨後分離化合物而獲得。
9.依照權利要求8的化合物，還包括將所述化合物轉變成至少一種選自衍生物或生理學可耐受鹽類的化學形式。
10.依照權利要求1的化合物，其具有通式(IVb) 其中(A)n的定義依照權利要求1。
11.依照權利要求1的化合物，它是烏黴肽A，C76H108N16O18S，具有通式(IVa) 或其鹽類或衍生物。
12.依照上述任一項權利要求的化合物，其中基團(A)n包含酪蛋白胺基酸序列的一部分。
13.依照權利要求12的化合物，其中(A)n是胺基酸序列Met His Gln Pro His Gln Pro Leu Pro Pro(SEQ ID NO1).
14.依照權利要求13的化合物，其中Met被氧化形成亞碸。
15.包含通式(I)的至少一種化合物和可接受載體的組合物，其中所述化合物的定義依照上述任一項權利要求。
16.依照權利要求15的組合物，其中所述組合物是藥物組合物且所述可接受載體是藥物可接受載體。
17.用於製備權利要求1-14中任一項定義的通式(I)的化合物或其鹽類或衍生物的方法，包括在合適條件下在包含至少一種碳源和至少一種氮源的培養基中培養刺黑烏黴FH 2272，DSM 13195或其突變體或變體直至培養基中存在通式(I)的至少一種化合物，並隨後分離所述化合物。
18.依照權利要求17的方法，還包括將所述化合物轉變成至少一種選自衍生物或生理學可耐受鹽類的化學形式。
19.依照權利要求17或18的方法，其中所述培養是在好氣條件下進行的。
20.依照權利要求17-19任一項的方法，其中所述至少一種氮源選自胺基酸和肽。
21.依照權利要求17-20任一項的方法，其中所述營養培養基包含酪蛋白蛋白腖，其濃度範圍是營養液總重量的大約0.05-5％。
22.依照權利要求17-21任一項的方法，其中所述營養培養基包含酪蛋白蛋白腖、葡萄糖、玉米漿、和痕量的氯化鉀、硫酸鎂、和硫酸鐵。
23.權利要求1-14任一項中定義的通式(I)的化合物或其鹽類或衍生物用於製備治療心功能不全的藥物的用途。
24.權利要求1-14任一項中定義的通式(I)的化合物或其鹽類或衍生物用於製備治療心功能不全作為主要或次要原因的疾病的藥物的用途。
25.權利要求1-14任一項中定義的通式(I)的化合物或其鹽類或衍生物用於製備治療糖尿病的藥物的用途。
26.權利要求1-14任一項中定義的通式(I)的化合物或其鹽類或衍生物用於製備治療微生物感染的藥物的用途。
全文摘要
本發明涉及可以通過培養刺黑烏黴(Memnoniellaechinata)FH2272，DSM 13195或其突變體和變體而獲得的通式(I)(其中R
文檔編號C07D491/048GK1406243SQ01805714
公開日2003年3月26日 申請日期2001年2月15日 優先權日2000年2月29日
發明者L·沃泰希, H·科格勒, A·瑪庫斯, M·希爾 申請人:阿文蒂斯藥物德國有限公司