一種低強度脈衝超聲波輔助下的旋轉管式細胞/組織培養系統的製作方法

2023-07-19 22:19:06 3

專利名稱：一種低強度脈衝超聲波輔助下的旋轉管式細胞/組織培養系統的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫學組織工程技術領域，具體涉及一種低強度脈衝超聲波輔助下 的旋轉管式細胞/組織培養系統。
背景技術：
美國國家自然科學基金會(NSF)在1987年8月召開的一次學術討論會上提出 了「組織工程」這一概念，並於1988年明確界定其內涵為「應用工程科學和生命科學的原 理和方法，來解釋哺乳動物組織的功能_結構關係，並且發展具有活性的人工替代物，來恢 復、維持或提高組織的功能」。其關鍵在於通過對哺乳動物細胞進行離體培養，形成具有特 定功能的活組織或各種生物替代物並將其應用於臨床。組織工程涉及多方面的科學問題， 三維細胞/組織培養系統是其重要技術之一，它與製藥工業、乳發酵工程等現代生物化學 工程中所採用的生物反應系統以及傳統的細胞培養方法存在本質上的不同。如現代生物化 學工程中所用的搖瓶、搖床等生物反應系統藉助吹氣或機械攪拌引起強迫對流等方法保持 培養物的懸浮狀態，進而改善營養供應，這在微生物培養(如青黴素生產)中是完全可行 的，但並不適合哺乳動物細胞培養。原因如下(1)哺乳動物細胞遠比微生物脆弱，機械攪 拌形成的直接作用及流動剪切力很容易造成細胞損傷甚至死亡；(2)細胞聚集是細胞培養 形成組織的關鍵一步，然而機械攪拌造成的流動剪切力使得細胞聚集程度降低甚至無法聚 集。另外，在90年代中期以前，醫學界利用傳統細胞培養方法無法培養出功能與在體 組織相同或相似的生物組織，其原因主要在於重力作用導致的細胞沉降以及細胞在培養器 器壁之間的接觸抑制使得所培養的細胞不能實現真正的三維生長，限制了細胞功能分化， 無法長成所需的組織，而空間微重力環境恰好為細胞創造了三維生長的條件。80年代中期 美國宇航局(NASA)就開始研製空間生物反應器。90年代初期，NASA Johnson中心發展了 旋轉管式生物反應器(Rotating Wall Vessel, RWV)，並在1995年太空梭搭載實驗中成 功地培養出結腸癌組織，組織切片觀察表明其結構與在體組織相似，而且尺寸比傳統方法 培養的組織大30倍，直徑達2cm。又在1997年進行關節軟骨組織培養實驗，成功地培養出 與在體軟骨組織結構和功能相似的關節軟骨組織，尺寸為釐米量級。這種新型的生物反應 器在地面運行時，藉助反應器內培養液的流體力學效應也可以有效避免重力沉降，進而確 保細胞三維生長。RWV在底座上用一個支架支撐培養器的內、外筒，其特點在於通過與培養室同軸旋 轉的內筒利用氣/液交換膜在線供氣，培養液可停機通過埠更新。這種裝置操作簡便，而 且整個培養過程可視化，適宜用於腫瘤組織藥物毒理試驗等，但也有一定的局限性①、只 能在線供氣不能供氧。經驗表明，對細胞/組織培養來說，氧供應比營養物質供應更為緊 迫，氧的消耗量大，這對於某些組織(如組織工程等)的培養不利；②、現有培養器不能在線 供液。每次更換營養液都必須停機，這會影響細胞的生長；③、現有培養器採用的氣液交換
3膜不耐高溫，不便於消毒；④、現有培養器沒有採用低強度脈衝超聲波等輔助手段為細胞/ 組織的增殖分化營造良好的微環境，不能很好地誘導細胞定向分化，形成組織。；⑤、供氧濃 度不可測定和控制；⑥、價格昂貴。超聲是一種在人類聽力頻率之外的聲壓波，可進入生物組織。傳導入人體的超聲 波可引起局部微環境應力的改變，導致機體組織產生細胞水平的生物學反應，其中超聲強 度在 100mW/cm2 以下屬低強度脈衝式超聲波(Low intensity pulsed ultrasound, Lipus) Lipus是一種使用頻率較低和劑量較小的脈衝式超聲波，其傳遞給組織的機械壓能量一般 < 3mg/cm2，不會引起組織致熱效應，從而避免了熱副作用。1952年，義大利學者在對兔橈 骨骨折的研究中發現超聲波治療可刺激骨痂形成，加快骨折癒合。Lipus最先於1983年應 用於骨不連合中的臨床治療，治癒率達68%。由於大量動物實驗以及臨床試驗的驗證，美 國食品和藥物管理局(FDA)對低強度超聲波在加速新鮮骨折癒合及治療骨折不癒合中的 作用予以了認可。Lipus目前主要用於骨折治療，特別是骨延遲癒合、骨不連或放射性骨 壞死的治療。近年來Lipus逐漸被應用於關節軟骨、韌帶的創傷治療。另外，Lipus應用 於細胞培養方面的研究越來越受到重視，並逐漸取得了矚目的成果(Takakura Y，Matsui N, Yoshiya S, et al. Low-intensity pulsed ultrasound enhances early healing of medial collateral ligament injuries in rats. Ultrasound Med,2002,21 (3) 283-288. Jia XL, Chen WZ, Zhou K, et al. Effects oflow-intensity pulsed ultra sound in repairing injured articular cartilage[J]. Chin JTraumatol,2005,8(3) :175_178·)。目前，應用於細胞培養增殖的Lipus大都採用以下參數頻率1. 5MHz，強度30mW/ cm2,重複頻率1kHz，脈寬200 μ S。國內外研究表明Lipus對多種細胞如幹細胞、軟骨細胞、 成纖維細胞等的培養有顯著促進效果，其可能是通過調節細胞的增殖，促進膠原及非膠原 蛋白的合成，影響細胞因子的分泌，從而加速細胞增殖，並在一定條件下誘導細胞分化。Lipus對細胞增殖的調控與細胞類型、作用條件和環境因素的影響有關。Warden等人用低強度脈衝超聲單次作用於成骨樣細胞UMR-106細胞株20min， 發現其可提高轉錄早期反應基因c-f0S、C0X-2、BMP以及ALP的表達，促進骨折的癒合。 Zhang等報導用1. 5MHz，脈衝頻率1 kHz，佔空比20 %的脈衝超聲30mW/cm2可使軟骨細胞 合成II型膠原和聚合蛋白多糖基因表達增加(Zhang ZJ, Huckle J，Francomano CA, et al. The effects of pulsed low-intensity ultrasound on chondrocyte viability, proliferation, gene expression and matrix production[J]. Ultrasound Med Biol, 2003,29(11) :1645-1651.)。Schumann也在對骨髓間充質幹細胞的研究中發現，Lipus 作用後其細胞夕卜基質明顯增力口(Schumann D, Kujat R, Zellner J, et al. Treatment of human mesenchymal stem cells with pulsed low intensity ultrasound enhances the chondrogenic phenotype in vitro[J].Biorheology,2006,43 (3-4) :431_443.)。 Li JK用低強度脈衝超聲作用於造骨細胞，發現其不僅增加了造骨細胞的數量，還增加了 TGF-β 1、IL-6、TNF-α的分泌。Lipus可增加NO合成酶的活性，提高NO水平，促進血管 內皮生長因子-Avascular endothelial growth factor，VEGF-A)基因表達，從而有利 於血管內皮細胞的生成，促進血管再生(Wang FS, Kuo YR, Wang CJ, et al. Nitric oxide mediates ultrasound-induced hypoxia-inducible factor-lalpha activation and vascular endothelial growth factor-Α expression in human osteoblasts[J]. Bone,
42004，35 (1) 114-123.)，梁國穗教授等人發現這種效應呈劑量依賴性，治療時間越長，VEGF 增加越明顯，且治療後期更明顯，可能與治療後期，細胞分化成熟，需要更多的營養供應有 關，同時Lipus作用後人骨膜細胞合成DNA的能力增加，通過對體外培養的人骨膜細胞的 研究表明，Lipus可促進骨膜細胞向成熟骨細胞分化，且這種效應呈劑量依賴性，每天治療 20min連續4d較每天治療IOmin 2d的效果更好。同時該研究還發現治療中Lipus對細胞 的增殖影響不大，而對細胞分化效應影響更大。Lipus連續治療28d，與對照組相比骨鈣沉 積明顯增力口(Leung KS, Cheung WH, Zhang C, et al. Low Intensity Pulsed Ultrasound Stimulates Osteogenic Activity of Human Periosteal Cells[J]. Clin Orthop Relat Res, 2004, (418) :253_259.)。Ikeda對間葉來源的多能幹細胞的研究發現，Lipus通過活化 的磷酸化細胞外信號調節激酶l/2(ERKl/2)和p38有絲分裂原蛋白激酶(p38_MAPK)，刺激 間葉幹細胞向成骨細胞和成軟骨細胞分化(Ikeda K, Takayama T, Suzuki N, et al. Effects of low intensity pulsed ultrasound on the differentiation of C2C12 cells. Life Sci，2006，79 (20) 1956-1943)。因此，若能將Lipus應用於細胞/組織培養系統，就能為細 胞的增殖、分化營造良好的微環境，更好的加速細胞增殖與誘導細胞分化，形成組織。此外，新近的研究表明不同氧濃度對各種細胞如幹細胞、成骨細胞、軟骨細胞、滑 膜細胞具有重要的影響。適度低氧可促進間充質幹細胞增殖及凋亡，有利於遷移和趨化，其對分化的影響 因細胞類型不同而有所差異。低氧影響間充質幹細胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs) 的分子機制主要涉及低氧誘導因子1、趨化因子及其受體、基質金屬蛋白酶，可形成適合 幹細胞存在及生長的微環境，促進細胞外基質降解(鍾啟，曾慧蘭.低氧對間充質幹細胞 生物學特性的影響[J]·中國組織工程研究與臨床康復，2009，13(40) =7942-7946.)。不 同氧濃度微環境影響MSCs的分化，高濃度氧有助於MSCs成骨和成脂分化，而低濃度氧 則表現為分化抑制。低氧對人單核細胞來源成熟樹突狀細胞基質金屬蛋白酶-9(MatriX Metalloproteinase, MMP-9)(Tissue Inhibitor of metalloproteinase 1，TIMP-1)表達的影響，MMP-9和TIMP-I在關節疾病中有著重要的作用，低氧微環境可能 同樣影響關節軟骨等結構(李寧，吳桂英，李啟明，等.不同氧濃度微環境對大鼠骨髓間充 質幹細胞成骨及成脂肪分化的影響[J].重慶醫學，2009，38 (19) =2448-2450.宋海波，楊美 香，孫錦堂，等.低氧對人成熟樹突狀細胞MMP-9/TIMP-1及CCR7表達的影響[J].中國病 理生理雜誌，2009，25 (10) 2012-2016)。缺氧可抑制成骨細胞增殖，同時可以誘導細胞VEGF的表達，加強局部血管形成， 從而促進成骨細胞的分化，完成骨創傷的自身修復，並且缺氧對成骨細胞凋亡的促發作用 是隨缺氧時間的延長而加重的(姚琦，張元和，姜華，等.缺氧對成人成骨細胞增殖及分 化的影響[J].中國骨傷，2006，19 (7) :417-419.)。缺氧能誘導人滑膜成纖維細胞環氧合 酶2(CyCla0Xygenase，C0X-2)表達上調的途徑顯著促進人滑膜成纖維細胞分泌前列腺素 E2 (Prostaglandin E2，PGE2)，從而影響關節炎性病變進程(柯金，龍星，劉羽，等.缺氧 狀態下人顳下頌關節滑膜成纖維細胞環氧合酶2的表達及意義[J].中華醫學雜誌，2005， 85(25) :1747-1751)。5%左右的低氧濃度相當於軟骨細胞的體內生存環境，有利於單層 和三維培養體系對軟骨細胞的培養，過高或過低的氧濃度都不適合。關注氧濃度在軟骨細 胞生長不同時期的影響，將有利於調控好氧濃度，使細胞較長時間處於較好的生長增殖狀
5態(吳華，吳紀饒，王曼瑩.氧濃度對關節軟骨細胞體外培養的影響[J].醫學綜述，2006， 12(8) :454-456)。目前，很多熱點研究大多需要控制不同氧濃度進行組織、細胞的培養，以研究高 氧、低氧對組織/細胞的生物學特性的影響，但現有的生物反應器雖然能夠初步調節供養 濃度，但是不夠精確，且存在可用的培養儀器少、價格昂貴等問題，這就需要在現有生物反 應器中增加一種精確的供氧濃度可控部件。隨著培養技術的成熟、培養規模擴大和骨與軟骨組織工程的需求，如何更好地快 速擴增幹細胞、成骨細胞、軟骨細胞、滑膜細胞等，同時定向調控細胞的分化方向，以獲得產 量多、質量好的骨與軟骨組織工程種子細胞應用於臨床，將會開拓應用前景，但是現有的生 物反應器並不能很好的做到這一點，因此，發明一種能夠精確監測和控制氧濃度的生物反 應器，使儀器獲得更好的研究適應性能，而且將Lipus應用於該系統，就能為細胞/組織的 增殖分化營造良好的微環境，更好的誘導細胞增殖與分化，形成組織。

發明內容
本發明的目的在於根據現有的細胞培養器中存在的不能在線供氧、供液，無法精 確控制供氧濃度，交換膜不耐高溫、不便於消毒，沒有採用輔助手段刺激細胞/組織的增 殖、分化，難以提供良好的生長微環境，價格昂貴等問題，提供一種Lipus輔助下的旋轉管 式細胞/組織培養系統。本發明目的通過以下技術方案予以實現本發明Lipus輔助下、氧氣濃度可控的旋轉管式細胞/組織培養系統主要由培養 器主體、氣室、Lipus超聲儀和供氧濃度控制部件組成，培養器主體中包括細胞/組織培養 室、培養液流動室和氣室，細胞/組織培養室和培養液流動室連為一體並用軸通過轉速調 節結構與馬達帶動，可繞軸做變速轉動，而氣室則獨立，不隨軸轉動，氣室的上端設置供氧 濃度控制部件。通過繞水平軸旋轉模擬微重力環境以及Lipus的輔助共同營造一個更有利 於細胞、細胞聚集體和組織三維增殖分化的環境，同時更有利於培養室內氧氣、二氧化碳和 代謝物的運輸。具體地，本發明Lipus輔助下、氧氣濃度可控的旋轉管式細胞/組織培養系統結 構包括設置有轉軸的培養器主體，轉軸設置在培養器主體的兩端，培養器主體一端設置有 Lipus超聲儀，Lipus超聲儀的超聲發射探頭插入培養器主體內部。作為一種優選方案，所 述Lipus超聲儀的超聲發射探頭上設置有用於固定超聲發射探頭的分離部件，使之不隨著 轉軸的轉動而轉動。其中，所述培養器主體包括設置在同一軸上的內筒和外筒，內筒為培養液流動室， 外筒為細胞/組織培養室，在外筒的外面套有氣室，在內外筒之間的環形開口上安裝有 Lipus超聲儀的超聲發射探頭。所述內筒為鏤空金屬，內筒外壁上固定有液液交換膜；所述 外筒為鏤空金屬，外筒內壁上固定有氣液交換膜。所述氣液交換膜是用白炭黑、聚乙烯、聚 醯胺、玻璃纖維增強的矽橡膠材料，模擬人體肺泡膜，能有效地在線供氣供氧，滿足細胞對 氧氣的需要。聚二甲基矽氧烷(PDMS)即矽橡膠膜，具有極為優良的透氣性，室溫下對氮氣、 氧氣和空氣的透過量比天然橡膠高30 40倍，比丁基橡膠則要高600 800倍，是現有氣 體透過率最高的高分子材料。另外，PDMS化學性質非常穩定，具有顯著的疏水性，其常溫下
6的蒸汽壓較低，不容易揮發，加之燃點和閃點較高，可在-50 180°C溫度範圍內長期使用。 雖然均質矽橡膠膜存在成膜性和機械強度差等缺點，但是用白炭黑、聚乙烯、聚醯胺、玻璃 纖維增強的矽橡膠膜，其機械強度和透過性均有提高，完全可以滿足氣液交換膜的要求。本 發明所用PDMS規格如下厚度約1. 5mm，其孔徑小於1 μ m，最大曝氣量為5m3/h ；氧利用率 > 25%;充氧能力> 0. 145kg02/h。所述液液交換膜為醋酸纖維素濾膜(Acetylcellulose， CA)，CA有很高的流速、熱穩定性，以及非常低的吸附性，是水相溶液如緩衝液、血清、培養基 除菌過濾的理想用膜。CA中各組分重量比例醋酸纖維素16 22% ；二氧六環5 15% ； 丙酮55 75% ；高氯酸鎂1 4% ；生物類酯0.1 6% ；該濾膜pH4 8範圍內穩定，可 耐受大多數純類和油類，最高可耐受180°C。本發明所用CA的規格如下厚約60 μ m，其孔 徑小於1 μ m，能夠過濾分子量小於1000的物質，可採用的滅菌方式為高壓滅菌(121°C或者 134°C)，乾熱滅菌180°C)，Y射線或環氧乙烷燻蒸。作為一種優選方案，所述內筒一端的端軸上設置有分離部件，分離部件上設置有 培養液進口和培養液出口，使培養液進、出口和旋轉內筒軸分離開來，不隨軸的轉動而轉 動。所述培養系統還包括用於提供新鮮培養液的供液裝置、用於存儲培養液的培養液 存儲器和用於收集培養液的培養液收集器，供液裝置通過輸液泵液管與培養液存儲器相 連，通過多孔管管道穿過培養器主體內筒的培養液出口，直達培養器主體內筒的另一端，培 養液均勻進入細胞/組織培養室，細胞/組織培養室的輸出管道與培養液收集器相連。
所述氣室還包括進氣口和出氣口，系統還包括提供氣源的供氣裝置和收集餘氣的 餘氣收集器，氣室的進氣口通過進氣管與供氣裝置連接，氣室的出氣口通過排氣管與餘氣 收集器連接。本發明系統還可以包括驅動裝置，驅動裝置帶動培養器主體以轉軸為軸心旋轉。 其中，所述驅動裝置優選變速馬達。本發明培養系統的工作過程如下1、本發明使用前需要常規消毒，以保證生物反應器不受汙染，本發明採用的兩種 交換膜均可耐180°C的高溫，因此可以採用高溫消毒，方便重複使用。2、根據實際需要加入適當的培養液，同時根據所培養的細胞/組織或研究目的決 定培養液的供給速度，選擇供氧濃度，同時計算生物反應器的旋轉速度和調節Lipus的參 數。例如培養軟骨細胞可選擇參數強度30mW/cm2，頻率1. 5MHz，脈寬200 μ s，重複頻率 IkHz。生物反應器的旋轉速度可以近似使用下式確定ω = 1.38951Χ102(Ι^)-1/3(ω-回 轉器的最佳轉速，單位為r/min ；L0-實驗樣品到轉軸的距離，單位為cm ；t_試驗持續時間， 單位為s)3、本發明接通電源後，水平旋轉，可以模擬微重力環境，促進細胞三維生長，同時 輔助以Lipus技術，使細胞更好地增殖分化。在連續供氣供氧的條件下，可連續培養，經過 一定時間後，便可切斷電源，得到產物。本發明採用的Lipus參數如下頻率1. 5MHz，強度30mW/cm2，重複頻率1kHz，脈寬 200 μ S，可以根據研究的目的調節相應的參數。本發明的培養系統是綜合考慮了超聲波、氧氣濃度、旋轉、液液交換、氣液交換等 多重因素的相互制約和影響，通過多次試驗摸索而開發出來的，可以適應於幹細胞、成骨細
7胞、軟骨細胞、滑膜細胞等多類細胞培養的有機系統。。Lipus最先於1983年應用於骨不連合中的臨床治療，目前主要用於骨延遲癒合、 骨不連或缺血性骨壞死的治療，且逐漸被應用於關節軟骨、韌帶損傷的治療。另外，Lipus應 用於細胞培養方面的研究越來越受到重視，並逐漸取得了矚目的成果(Takakura Y5Matsui N, Yoshiya S，et al. Chin J Traumatol，2005，8 (3) :175_178·)。Lipus 對多種細胞如幹細 胞、軟骨細胞、成纖維細胞等的培養有顯著促進效果，其可能是通過調節細胞的增殖，促進 膠原及非膠原蛋白的合成，影響細胞因子的分泌，從而加速細胞增殖，並在一定條件下誘導 細胞分化。但如何將現有的Lipus細胞培養原理跟旋轉培養原理結合起來，需要克服Lipus 的介入問題、動態刺激和誘導問題、超聲力學作用問題等一些技術難題。本發明採用分離 部件，即可獲得Lipus界面與培養液的接觸，也可以讓Lipus部件獨立不隨轉軸運轉；運用 Lipus連續發生和均勻作用等特性，實現培養過程中的動態刺激和誘導；通過計算Lipus超 聲作用的強度衰減情況，在IOcm內超聲強度的衰減可以忽略不計，且同時可以部分抵消普 通生物反應器旋轉培養時的「頂端效應」，使得引入Lipus後的旋轉培養更佳均勻、力學分 布更好，有利於細胞的增殖和分化。三維動態的細胞/組織培養系統是骨與軟骨組織工程中的重要技術之一，但現有 生物反應器培養系統存在不能在線供氧、供液，沒有採用輔助手段刺激細胞/組織的增殖、 分化，無法精確地控制供氧濃度，交換膜不耐高溫、不便於消毒，價格昂貴、儀器少等問題， 且隨著培養技術的成熟、培養規模擴大和骨組織工程與軟骨組織工程的需求，如何更好地 快速擴增幹細胞、成骨細胞、軟骨細胞、滑膜細胞等各類細胞，同時定向調控細胞的分化方 向，以獲得產量多、質量好的骨組織工程與軟骨組織工程種子細胞應用於臨床。因此本發明 針對現有情況，設計一種能夠精確監測和控制氧濃度的生物反應器，使儀器獲得更好的研 究適應性能，而且將Lipus應用於該系統，就能為細胞/組織的增殖分化營造良好的微環 境，更好的誘導細胞增殖與分化，形成組織。本發明克服現有生物反應器的問題，最終實現 各部件互相彌補，相互促進的統一、有機效果，利於骨與軟骨組織工程的研究和開發，應用 前景廣泛。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果(1)本發明在細胞培養室的一端添加了 Lipus超聲儀作為輔助裝置，能夠有效地 誘導細胞增殖和/或分化，形成組織；(2)本發明將氣體流動室設置在培養室的外部，氣體交換面積更大，交換效率更 尚；(3)本發明將內筒設置為培養液流動室，提供在線供液，不需停機更換營養液，能 及時、持續地更新培養液，添加營養物質，排除代謝產物，讓培養過程更連續，效率更高；(4)本發明的氣液交換膜採用了用白炭黑、聚乙烯，聚醯胺、玻璃纖維增強的矽橡 膠材料，模擬人體肺泡膜，能有效地在線供氣供氧，滿足細胞對氧氣的需要；(5)本發明增加了氧氣濃度可控部件，通過此種微調方式可以使培養室內的氧氣 濃度得到精確控制，利於在低氧、高氧條件下開展研究工作，儀器的研究適應性更好；(6)本發明使複雜的生物反應器裝置小型化，使用的主體材料，液液和氣液交換膜 均為耐高溫材料，可直接高溫消毒，清洗、消毒方便徹底；
8
(7)本發明培養系統價格較低廉。


圖1為本發明的主體結構圖，其中1為氣罩；2為氣室；3為外筒；4為細胞培養 室；5為內筒；6為培養液流動室；7為進氣口 ；8為出氣口 ；9為出液口 ；10為進液口 ；11為 分離結構；12為馬達；13為齒輪；14為Lipus超聲儀；15為水平支撐板；16為超聲傳導線； 17為Lipus超聲探頭；圖2為供液系統的示意圖，其中20為鮮培養液存貯器；21為流量、壓力可調的輸 液泵；22為培養液輸入用的多孔管管道，經阻尼器進入培養室至培養室終端，阻尼器用以 調節培養室內壓力；23為培養液回收器；10為培養液進口 ；9為培養液出口 ；圖3為供氣系統的示意圖，其中24為氣源，用氣管與穩壓，調壓閥相連，氣管出氣 口連接到培養器氣室2 ；25為穩壓調壓閥，安裝載氣路之中；26為進氣管與培養器進氣口 7 相連；27為排氣管與培養器出氣口 8相連；28為餘氣收集器；氣室出氣口通過排氣管27連 接餘氣收集器28上；29為氧氣濃度傳感器，通過導線30與控制電路31相連，將氣室內的氧 氣濃度情況反應到控制電路；30為導線，連接氧氣濃度傳感器及控制電路；31為控制電路， 與穩壓調壓閥25相連接，控制氣壓，進而控制氣體濃度。
具體實施例方式以下結合實施例來進一步解釋本發明，但實施例並不對本發明做任何形式的限定。實施例1採用本發明培養骨髓間充質幹細胞(Bone Marrow Stem Cells,MSCs)分化增殖為 骨細胞。具體步驟如下將MSCs與培養液(其中DMEM與無血清DMEM以1 1體積比混合)混合加入 細胞培養室中，開動培養系統，調到適合的旋轉速度，且將Lipus參數調為頻率1. 5MHz，強 度30mW/cm2，重複頻率1kHz，脈寬200 μ s，在37°C的溫度下開始進行旋轉刺激培養。通過 在線供液系統定時向培養室內供應培養液，通過在線供氣系統實時向氣室內供氣，並通過 氧氣濃度傳感系統將氧氣濃度控制在適宜的範圍內。培養48h後在供液系統中加入骨細 胞定向誘導培養基(100ml高糖DMEM誘導液含骨形態發生蛋白-2 (Bone Morphogenetic Protien, BMP-2) 100ng/L、鹼性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF) lOOng/L、維生素C 50 μ g/ml、胰島素10U/ml、甲狀腺素50 μ g/ml、血管內皮生長因子 (Vascular endothelial growth factor，VEGF) 20ml/L 以及牛血清白蛋白 1. 25 μ g/ml)，定 向誘導細胞分化為成骨細胞，並進一步分化為骨細胞。連續培養4d後停機取出培養物。利 用HE染色和掃描電鏡對細胞的分化增殖情況進行觀察。實施例2採用本發明進行MSCs與「膠原/納米三磷酸鈣/透明質酸」(Collagen/nano Tri-calcium Phosphate/Hyaluronic Acid, Col/nano-TCP/HA)骨軟骨支架材料聯合培養， 構建組織工程軟骨。具體步驟如下將Col/nano-TCP/HA生物材料修剪成直徑5mm、厚3mm，取第3代MSCs以1 X 106/ml
9密度接種於支架材料內，然後與培養液(其中DMEM與無血清DMEMWl 1比例混合)混合 加入細胞培養室中，開動培養系統，調到適合的旋轉速度，將Lipus參數調為頻率1. 5MHz, 強度2mW/cm2，重複頻率1kHz，脈寬200 μ s，在37°C的溫度下開始進行旋轉刺激培養。通過 在線供液系統定時向培養室內供應培養液，通過在線供氣系統實時向氣室內供氣，並通過 氧氣濃度傳感系統將氧氣濃度控制在適宜的範圍內。培養48h後在供液系統中加入軟骨細 胞定向誘導培養基(100ml高糖DMEM誘導液含TGF-β lOOng/ml、地塞米松lOOng/L、維生素 C50 μ g/ml、胰島素10U/ml、甲狀腺素50 μ g/ml、β -甘油磷酸鈉20ml/L以及牛血清白蛋白 1.25 μ g/ml)，定向誘導細胞分化為軟骨組織。連續培養4天後停機取出培養物。利用相差 倒置顯微鏡觀察和掃描電鏡觀察複合細胞後的材料結構，對材料的三維立體結構和細胞的 粘附、增殖情況進行觀察，同時實施病理組織學切片，評估軟骨形成情況。
權利要求
一種低強度脈衝超聲波輔助下的旋轉管式細胞/組織培養系統，其特徵在於所述培養系統包括設置有轉軸的培養器主體，轉軸設置在培養器主體的兩端，培養器主體一端設置有Lipus超聲儀，Lipus超聲儀的超聲發射探頭插入培養器主體內部，培養器主體的上端設置有供氧濃度控制部件。
2.根據權利要求1所述的細胞/組織培養系統，其特徵在於所述培養器主體包括設置 在同一軸上的內筒和外筒，內筒為培養液流動室，外筒為細胞/組織培養室，在外筒的外面 套有氣室，在內外筒之間的環形開口上安裝有Lipus超聲儀的超聲發射探頭，在氣室上端 內壁設置有供氧濃度控制部件。
3.根據權利要求2所述的細胞/組織培養系統，其特徵在於所述內筒為鏤空金屬，內筒 外壁上固定有液液交換膜；所述外筒為鏤空金屬，外筒內壁上固定有氣液交換膜。
4.根據權利要求2或3所述的細胞/組織培養系統，其特徵在於所述內筒一端的端軸 上設置有分離部件，分離部件上設置有培養液進口和培養液出口。
5.根據權利要求4所述的細胞/組織培養系統，其特徵在於所述培養系統還包括用於 提供新鮮培養液的供液裝置、用於存儲培養液的培養液存儲器和用於收集培養液的培養液 收集器，供液裝置通過輸液泵液管與培養液存儲器相連，通過多孔管管道穿過培養器主體 內筒的培養液出口，直達培養器主體內筒的另一端，培養液均勻進入細胞/組織培養室，細 胞/組織培養室的輸出管道與培養液收集器相連。
6.根據權利要求1或2所述的細胞/組織培養系統，其特徵在於所述氣室還包括進氣 口和出氣口，系統還包括提供氣源的供氣裝置和收集餘氣的餘氣收集器，氣室的進氣口通 過進氣管與供氣裝置連接，氣室的出氣口通過排氣管與餘氣收集器連接。
7.根據權利要求1或2所述的細胞/組織培養系統，其特徵在於所述系統還包括驅動 裝置，驅動裝置帶動培養器主體以轉軸為軸心旋轉；所述Lipus超聲儀的超聲發射探頭上 設置有用於固定超聲發射探頭的分離部件。
8.根據權利要求1或2或6所述的細胞/組織培養系統，其特徵在於所述供氧濃度控 制部件、氣室的進氣口和出氣口各連接一個氣泵，氣泵與兩位三通電磁閥連接，光感模式的 氧氣濃度傳感器感知氣室內的氧氣濃度，將信號傳遞到控制電路，控制三通閥，進而開啟或 關閉氣泵，調節氣室的氧氣濃度。
9.根據權利要求8所述的細胞培養系統，其特徵在於所述驅動裝置為變速馬達。
10.根據權利要求3所述的細胞/組織培養系統，其特徵在於所述液/液交換膜為醋酸 纖維素濾膜，濾膜厚度為60 μ m,孔徑小於1 μ m ；所述氣/液交換膜是用白炭黑、聚乙烯、聚 醯胺、玻璃纖維增強的矽橡膠材料，厚度為1. 5mm,孔徑小於1 μ m，最大曝氣量為5m3/h，氧利 用率> 25%，充氧能力> 0. 145kg02/h。
全文摘要
本發明公開了一種低強度脈衝超聲波輔助下的旋轉管式細胞/組織培養系統。本發明Lipus輔助下的旋轉管式細胞/組織培養系統包括設置有轉軸的培養主體，培養主體外面套有氣室，轉軸設置在氣室的兩端，培養器主體一端設置有Lipus超聲儀，Lipus超聲儀的超聲發射探頭插入培養器主體內部，氣室的內壁設置有氧氣濃度可控部件。本發明培養系統可以在線供氧、供液，有利於培養系統內氧氣、二氧化碳和代謝物的運輸，同時可精確控制氧氣濃度，採用Lipus超聲儀作為輔助手段，為細胞或組織的增殖或分化營造了良好的微環境，最終模擬微重力環境進行三維動態培養，並可實現定向的擴增和誘導分化功能。
文檔編號C12M3/00GK101914438SQ20101021481
公開日2010年12月15日 申請日期2010年8月12日 優先權日2010年8月12日
發明者吳少旭, 廖威明, 林子洪, 郭曉升, 陳奕春, 陳曉敏, 陳耿東, 黃楚輝 申請人:中山大學