玉米磷轉運蛋白上遊調控因子ZmPHO2;H1及其編碼基因的製作方法
2023-07-19 14:50:01 1
玉米磷轉運蛋白上遊調控因子ZmPHO2;H1及其編碼基因的製作方法
【專利摘要】本發明提供了一種玉米磷轉運蛋白上遊調控基因ZmPHO2的同源基因ZmPHO2;H1,在耐低磷自交系178中克隆所得序列，其核苷酸序列如SEQID?No.2所示，其胺基酸序列如SEQID?No.1所示。本發明設置了正常磷濃度（1mmol/L）、四個低磷水平（無磷、1μmol/L、10μmol/L、100μmol/L）處理12h和八天並做定量分析，結果表明在某些特定的時間段，不同低磷濃度處理下該基因的表達量低於正常磷水平，並且證實了該基因在耐低磷自交系178和低磷敏感自交系9782中不同的表達規律，為了該基因後續在研究中的應用奠定基礎。
【專利說明】玉米磷轉運蛋白上遊調控因子ZmPH02;H1及其編碼基因
【技術領域】
[0001]本發明屬於基因工程和分子生物學【技術領域】，尤其涉及一種玉米磷轉運蛋白上遊調控因子ZmPH02;Hl實驗設計創新及其應用。
【背景技術】
[0002]磷是生物生長發育的重要營養元素之一，是蛋白質、核酸、脂類以及各種重要的小分子，如能源供應者ATP的重要組成成分，是各種糖代謝，如糖降解必須的中介物，是生物發育的調節物，如磷酸化等。因此，施加磷肥對提高作物產量起著關鍵作用。
[0003]玉米是一種重要的糧食作物和經濟作物，土壤低磷嚴重影響玉米的正常生長發育。張繼海等通過對多份玉米自交系進行耐低磷力鑑定，篩選出一批耐低磷的種質，耐低磷玉米自交系178就屬於其中一個表現優異的種質。耐低磷玉米能夠在低磷條件下提高對磷的利用率，提高玉米的產量，其中磷轉運蛋白上遊調控基因在耐低磷的作用機制中起到關鍵作用。因此，闡明該基因在低磷處理時的表達模式和在不同低磷濃度處理下的表達特徵，並在耐低磷自交系178和低磷敏感自交系9782中測得可溶性磷含量，有利於闡明耐低磷機制，為提高玉米耐低磷能力和玉米產量提供重要的研究方向。
【發明內容】
[0004]本發明目的在於提供一種玉米磷轉運蛋白上遊調控因子ZmPH02;Hl及其應用，本發明提供的玉米基因ZmPH02;Hl在低磷環境下受到抑制，使磷酸鹽從地上部分向地下部分運輸受到一定程度的抑制 ，從而保持葉片中磷濃度處於正常狀態，不會受到缺磷的影響。並發現了在ZmPH02;Hl蛋白結構域中絡氨酸變為半胱氨酸，而半胱氨酸在泛素結合酶複合體形成中起到非常關鍵的活化作用，對後續抑制或降解磷轉運蛋白起到重要的調控作用，因此，深入研究該基因在這個位點上的突變帶來的功能變化有重要意義。
[0005]本發明提供了一種玉米磷轉運蛋白上遊調控因子ZmPH02;Hl，其胺基酸序列如SEQID N0.1 所示。
[0006]本發明還提供編碼上述蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQID N0.2所示。
[0007]本發明還提供含有編碼玉米磷轉運蛋白上遊調控基因ZmPH02;Hl的載體及含有該載體的宿主細胞。
[0008]本發明設置了正常磷濃度(lmmol/L)、四個低磷水平(無磷、I μ mol/L、10 μ mol/L、100 μ mol/L)處理12h和八天並做定量分析，結果表明在某些特定的時間段，不同低磷濃度處理下的該基因的表達量低於正常磷水平，為了該基因後續在研究中的應用奠定基礎。
[0009]本發明還提供了在不同磷濃度不同時間段內處理下，耐低磷自交系178和低磷敏感自交系9782中葉和根的有效磷含量，闡明了葉中的有效磷含量要高於根中的有效磷含量，以及在根和葉中有效磷含量的變化規律，進一步證實該基因在研究中的重要價值。
[0010]本發明提供的ZmPH02;Hl基因是從耐低磷自交系178 (由四川農業大學玉米研究所提供)中克隆得到的基因，其開發閱讀框為1122bp，編碼373個胺基酸；其在耐低磷自交系178或者低磷敏感自交系9782的葉和根中均有表達；其與喬草(Setaria italica)XP_004967378、水稻(Oryza sativa) 0s01g0233900> 短柄草(Brachypodium distachyon)XP_003566089、大麥(Hordeum vulgare ) BAK03891、小麥屬(Triticum urartu ) EMS50616 存在高度保守性；其表達的玉米磷轉運蛋白上遊調控因子ZmPH02;Hl包含一個保守結構域UBC (泛素結合酶);等電點和分子量為:Theoretical pI/Mw:8.36/41839.39 J_ZmPH02;Hl沒有跨膜結構域；其表達部位在細胞核內。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0011]圖1為本發明實施例所提供的編碼玉米磷轉運蛋白上遊調控基因ZmPH02;Hl的擴增條帶；
[0012]圖2為玉米磷轉運蛋白上遊調控基因ZmPH02;Hl在耐低磷自交系178葉中的相對
表達量;
[0013]圖3為玉米磷轉運蛋白上遊調控基因ZmPH02;Hl在耐低磷自交系178根中的相對
表達量; [0014]圖4為本發明實施例所提供的玉米磷轉運蛋白上遊調控因子ZmPH02;Hl的胺基酸序列保守結構域的分析結果；
[0015]圖5為本發明實施例所提供的玉米磷轉運蛋白上遊調控因子ZmPH02;Hl的跨膜結構域分析結果；
[0016]圖6為本發明實施例所提供的玉米磷轉運蛋白上遊調控因子ZmPH02;Hl的表達部位預測分析結果；
[0017]圖7為本發明實施例所提供的玉米磷轉運蛋白上遊調控因子ZmPH02;Hl的進化樹分析結果；
[0018]圖8為本發明實施例所提供的玉米磷轉運蛋白上遊調控因子ZmPH02;Hl的多重序列比對;
[0019]圖9為編碼玉米磷轉運蛋白上遊調控基因ZmPH02;Hl在低磷敏感自交系9782葉中的相對表達量；
[0020]圖10為編碼玉米磷轉運蛋白上遊調控基因ZmPH02;Hl在低磷敏感自交系9782根中的相對表達量；
[0021]圖11為編碼玉米磷轉運蛋白上遊調控基因ZmPH02;Hl在耐低磷自交系178和低磷敏感自交系9782葉中的相對表達量；
[0022]圖12為編碼玉米磷轉運蛋白上遊調控基因ZmPH02;Hl在耐低磷自交系178和低磷敏感自交系9782根中的相對表達量；
[0023]圖13為耐低磷自交系178在12h和8d不同磷濃度的有效磷含量；
[0024]圖14為低磷敏感自交系9782在12h和8d不同磷濃度的有效磷含量。
【具體實施方式】
[0025]實施例1玉米磷轉運蛋白上遊調控基因ZmPH02;Hl在低磷處理下組織特異性表達
[0026]1.1玉米磷轉運蛋白上遊調控基因ZmPH02;Hl在不同組織中表達特徵分析
[0027]1.1.1引物設計[0028]本實驗選擇玉米組成型表達基因18S為內參基因，用於校準不同樣品中起始模板量以及RNA反轉錄效率。依據qRT-PCR引物設計的要求和原則，結合Primer Premier5.0和Beacon designer設計目的基因和內參基因的特異性引物，用e_PCR在玉米基因組資料庫中對設計的引物進行驗證，將只能擴增出單一條帶的引物作為候選，送上海Invitrogen公司合成。
[0029]定量引物信息如下:
[0030]正向引物F 如 SEQID N0.3 所示，為:GCTCCTCTGTGAATGTC ；
[0031]反向引物R 如 SEQID N0.4 所示，為:TTCCTTGCTCTGTCCTT。
[0032]1.1.2引物的特異性檢測
[0033]以各時段cDNA樣品混合液稀釋10倍後用作qRT_PCR反應的模板，退火溫度梯度範圍設定為50~65°C，用於確定最佳Tm值，同時根據溶解曲線的峰型檢測引物的特異性。10 μ L反應體系見表1，qRT-PCR反應在CFX96Manager (Bio-Rad USA)進行，反應程序見表2。
[0034]表1螢光定量PCR的反應體系
[0035]
【權利要求】
1.玉米磷轉運蛋白上遊調控因子ZmPH02;Hl，其胺基酸序列如SEQIDN0.1所示。
2.編碼權利要求1所述蛋白的基因。
3.如權利要求2所述的基因，其特徵在於，其核苷酸序列如SEQIDN0.2所示。
4.含有權利要求2或3所述基因的載體。
5.含有權利要求4 所述載體的宿主細胞。
【文檔編號】C12N15/29GK103992397SQ201410108347
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年3月21日 優先權日:2014年3月21日
【發明者】高世斌, 劉丹, 吳玲, 田躍飛, 蘇順宗, 榮廷昭, 潘光堂, 劉堅, 張志明, 林海建, 沈亞歐, 聶治, 張嘯, 劉文軍 申請人:四川農業大學