鞘氨醇單胞菌屬菌株及其在水處理中的應用的製作方法
2023-07-19 10:23:51
專利名稱：鞘氨醇單胞菌屬菌株及其在水處理中的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於環境工程、生物工程技術領域。具體涉及鞘氨醇單胞菌屬菌株及其對含氮工業廢水、生活汙水的短程硝化一反硝化脫氮以及在受汙染水源水中處理應用。
背景技術：
近年來，隨著工農業生產的快速發展和社會的進步，排入水體的汙染物大量增加， 其中含氮廢水的排放也急劇增加，導致我國主要河流、五大淡水湖及近海水體富營養化，藻類水華頻繁暴發。進入水體的氨氮被氧化成亞硝酸鹽和硝酸鹽，消耗大量氧氣，降低了水體質量，嚴重危害著水生生態系統安全。同時，超標的亞硝酸鹽和硝酸鹽也嚴重威脅著人類健康。面對越來越嚴重的水體氮汙染狀況，加強和深化廢水脫氮技術的研究，尤其是篩選高效脫氮微生物、開發新型脫氮技術具有實際意義和價值。目前，純種高效脫氮微生物的篩選， 因其脫氮速率快，脫氮效果好，能從生物地球化學循環的途徑進行脫氮，並且對COD具有一定的去除效果越來越受到研究者的關注和重視。而對於具有革新脫氮工藝、生態安全性的微生物菌種的篩選更具有重要意義。加強生物脫氮技術方向主要有兩個方面首先，開發新的工藝技術、優化反應器； 其次，篩選高效脫氮微生物。改進的成果主要有1)開發出了亞硝酸鹽型硝化反硝化技術 (SHARON工藝、OLAND工藝)、同時硝化反硝化技術、厭氧氨氧化技術(SHAR0N-AN0MM0X工藝、 CANON工藝、OLAND工藝)、好氧脫氨技術。其中，短程脫氮技術因其具有顯著的優點受到了研究者的重視，短程脫氮是在脫氮過程中僅將氨氮氧化成亞硝酸鹽，然後進行短程反硝化， 相比於全程脫氮需要將氨氮及亞硝酸鹽氧化，產物是硝酸鹽，這一過程大大節約了碳源、能耗以及基建和運行費用、減少反應容積。由於其具有上述各種優點，短程硝化技術已成為生物脫氮領域研究的熱點之一。2)篩選出可應用於環境治理的各種微生物菌種；目前，國內外在微生物應用於環境治理方面進行了廣泛研究，分離出各種微生物菌種，取得了較好的效果，主要集中於鞘氨醇單胞菌對難降解有機物降解、養殖廢水中和土壤中的應用(如李華等，2010 年，化工環保，固定化如cier sp. Ik臨邾 Sphingomorms sp. FG03 降解苯酚；黃海東等，2010，天津農學院學報，菌株N3和TP-3的分類鑑定及保水效果研究；何麗媛，2010，環境科學學報，混合菌對原油的降解及其降解性能的研究)，申請了部分國家發明專利(鞘氨醇單胞菌屬菌株及其在蔥醒染料廢水脫色中的應用，發明專利號ZL 200410020832. 6 ；少動鞘氨醇單胞菌在鰻鱺養殖中的應用，專利申請號200510083414 . 6 ；紅樹植物根際促生固氮菌(DZY - N56 )及其應用，專利申請號200810(^8955. 2 ；減少亞硝胺類的微生物和用其減少亞硝胺類的方法；專利號ZL 03810579. 9)。迄今為止，雖然篩選出多種環境治理微生物菌種，但其應用卻主要集中在有機廢水尤其是含難降解有機物廢水的處理方面。而在廢水脫氮新技術一短程脫氮方面，主要通過亞硝化控制技術——控制溫度、DO、pH值、游離氨濃度(FA)等條件篩選出氨氧化細菌， 淘汰亞硝酸鹽氧化細菌，實現亞硝酸鹽積累。但這些方法同時也存在控制條件苛刻和容易向全程硝化轉化的缺點，從而局限了其應用。而通過採用微生物技術篩選出的短程高效脫氮微生物較少(水生叢毛單胞菌屬菌株及其在廢水生物脫氮中的應用，發明專利號 ZL200810020649.4)，因此，篩選高效脫氮效果、具有生態安全性的微生物菌種具有重要意義。
發明內容
本發明需要解決的問題是為含氮廢水的生物處理提供高效的短程硝化一反硝化菌製劑，強化含氮廢水的脫氮處理，從自然界中分離出的一株鞘氨醇單胞菌屬菌，分離自我國太湖水體，為本土菌種，生物安全性高，能夠以(X)2為碳源及能量或者以(X)2和有機物為混合碳源和能量、氨氮或硝態氮為氮源生長，通過將氨氮轉化為亞硝酸鹽氮，再將亞硝酸鹽氮轉化為氮氣實現短程硝化一反硝化，對含氮廢水具有高效的脫氮作用。在含氮廢水脫氮中具有廣泛的應用前景。本發明的技術解決方案是，本發明提供的鞘氨醇單胞菌sp. LZff3, 於2011年1月30日保藏於「中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心」，其保藏號 CGMCC No . 4589。該鞘氨醇單胞菌屬菌株是從太湖水體水生植物根區、太湖水體敞水區以及太湖沉積物中採集、分離得到。具體篩選步驟如下
用預先滅菌的分層水樣採集器，採集太湖沉積物界面以上不同深度的水樣0. 25L，分裝於預先滅菌的棕色玻璃瓶；用預先滅菌的彼得森採泥器(l/16m2)採集太湖表層沉積物(厚度約為IOcm)，放入已滅菌的不鏽鋼容器中；用預先滅菌的針管(15cmX 1. 5cm)採集太湖水生植物根區水樣，裝於預先滅菌的棕色玻璃瓶，上述樣品取樣後立即封口，作為菌源進行分離，富集培養。在無菌條件下，將水樣加到氨氧化細菌富集培養基中(氨氧化細菌培養基成分為(NH4)2SO4 0. 2g, K2HPO4 0. lg, MgSO4 0. 05g, NaCl 0. 2g, FeSO4 0. 04g, CaCO3 0. 5g, H2O 100ml, pH值7. 2，其中培養基在121°C溼熱滅菌20min後使用)，置於搖床上在條件下培養48h。然後再轉到氨氧化細菌的固體培養基中，固體培養基成分為(NH4)2SO4 0. 2g， K2HPO4 0. lg, MgSO4 0. 05g, NaCl 0. 2g, FeSO4 0. 04g, CaCO3 0. 5g，瓊脂 2g, H2O 100ml, pH 值 7. 2，將擴培後的菌種進行平板劃線初步分離，平板在培養48h。根據平板上長出的單個微生物，選擇其中長勢較好的進行再次富集培養。最後在固體培養基上反覆進行平板劃線分離，分離出一株對氨氮和亞硝酸鹽氮具有高效降解能力的鞘氨醇單胞菌屬菌株。該鞘氨醇單胞菌屬菌株在pH值6. 5、. 5培養基介質中培養，適合的生長溫度為 25^35 0C ；其細菌學形態特徵為革蘭氏陰性桿菌，尺寸為0.5 1.0X1 3 ym，無鞭毛， 好氧或厭氧，接觸酶陽性，氧化酶陽性，以(X)2為碳源及能量或者以(X)2和有機物為混合碳源和能量、氨氮或硝態氮為氮源生長。該菌在固體培養基上培養15 20天，菌落小，呈圓形，邊緣光滑，表面光滑，菌體呈現淡黃色，極易挑起。依據該菌株形態學以及分子生物學分析，可鑑定其為鞘氨醇單胞菌屬的菌株。 用PCR儀(GeneAmp，PCR system 9700 )進行擴增反應。擴增反應體積為10XTaq聚合酶反應緩衝液 5 μ L，dNTP(20mmol/L)5y L,5'端和 3'端引物(25/7mol/μ L)各 2 μ L， Mg2+ (25mmol/L) 6 μ L，菌體 DNA (約 50ng/ μ L) 1 μ L, Taq DNA 聚合酶(5U/ μ L) 0· 5 μ L，Η2028· 5 μ L，總體積50 μ L。反應條件為首輪循環94°C變形2min ；在接94°C 30s, 50°C 30s， 72°C lmin,30個循環；最後72°C延伸lOmin。1. 5%的瓊脂糖凝膠，EB染色後紫外檢測。通過Blast程序進行同源性比較，表明該菌株與^^i/^oMwas sp.相似度高達99%以上、 可重複性99%。本發明的鞘氨醇單胞菌屬菌株對氨氮的降解能力極強，經該菌株作用後，氨氮在可見光區最大吸收峰(412nm)消失，從而降低廢水中的氨氮濃度。該鞘氨醇單胞菌屬菌株通過將亞硝酸鹽氮轉化為氮氣，使得亞硝酸鹽氮在可見光區最大吸收峰(540nm)消失，從而降低廢水中的亞硝酸鹽氮。該鞘氨醇單胞菌屬菌株既可在富營養培養基中生長，也可在以(X)2為碳源及能量或者以(X)2和有機物為混合碳源和能量、氨氮或硝態氮為氮源的基礎培養基中生長。本發明的鞘氨醇單胞菌屬菌株，可以用新鮮培養的生長期菌種或是固定化菌株對氨氮進行降解處理。本發明的鞘氨醇單胞菌屬菌株，可以用新鮮培養的生長期菌種或是固定化菌株先將氨氮轉化為亞硝酸鹽氮，然後將亞硝酸鹽氮轉化為氮氣，通過短程硝化一反硝化作用對含氮廢水進行高效降解處理。本發明所達到的有益效果是本發明提供的鞘氨醇單胞菌屬菌株，分離自我國太湖水體，為本土菌種，生物安全性高，能夠以CO2為碳源和能量或者以(X)2和有機物為混合碳源和能量、氨氮或者硝態氮為氮源生長，對氨氮和亞硝酸鹽具有較強的轉化能力，降解速度快，降解率高達90%以上。該菌株可作為游離生物菌製劑或固定化菌株，投加到現有的廢水處理系統中，對含氮廢水進行短程硝化一反硝化處理，提高原處理系統的反應效率，降低能耗，縮短反應時間，增強原處理系統的處理能力和效率，在工業水、生活汙水處理以及受汙染水源水淨化中具有廣闊的應用潛力。
圖1.鞘氨醇單胞菌屬菌株去除氨氮能力
一 ▲一進水氨氮濃度(mg/L)，一□一出水氨氮濃度(mg/L)，一 一氨氮去除率 (100%)
圖2.鞘氨醇單胞菌屬菌株去除亞硝酸鹽能力(葡萄糖和(X)2為混合碳源) 一 ▲一進水亞硝酸鹽濃度(mg/L)，一 □一出水亞硝酸鹽濃度(mg/L)，一 ▼一亞硝酸鹽去除率
圖3.鞘氨醇單胞菌屬菌株去除亞硝酸鹽能力(乙酸鈉和(X)2為混合碳源) 一 ▲一進水亞硝酸鹽濃度(mg/L)，一 □一出水亞硝酸鹽濃度(mg/L)，一 ▼一亞硝酸鹽去除率
圖4.鞘氨醇單胞菌屬菌株硝化一反硝化去除氨氮能力
一 ■一進水氨氮濃度(mg/L)，一▲一出水氨氮濃度(mg/L)，一Δ—出水亞硝酸鹽濃度 (mg/L)，一·一氨氮去除率
圖5.實驗反應裝置，(1).流化床；(2).取樣口 ；(3).轉子流量計；(4).空壓機； (5).增壓泵；(6).循環水槽；(7).加熱裝置
圖6.流化床系統對含氨氮廢水短程硝化的應用一· 一進水氨氮濃度，一〇一出水氨氮濃度，一 ▲一亞硝化率，一 一氨氮去除率圖7.流化床系統對含亞硝酸鹽氮有機廢水短程反硝化的應用 -■ 一進水亞硝酸鹽濃度，-· 一出水亞硝酸鹽濃度，一▲一氮負荷速率圖8.流化床系統對含氨氮有機廢水短程硝化一反硝化的應用一 ▲一進水氨氮濃度，一〇一出水氨氮濃度，一 一氨氮去除率，一 Δ—出水硝酸鹽濃度，一 ■一總氮去除率
圖9固定化鞘氨醇單胞菌對太湖水源地總氮的去除應用研究一■一空白，一 一微生物，一▲一植物，一▼一植物+微生物圖10固定化鞘氨醇單胞菌對太湖水源地氨氮的去除應用研究一■一空白，一 一微生物，一▲一植物，一▼一植物+微生物。
具體實施例方式實施例1本發明提供的鞘氨醇單胞菌屬菌株的篩選步驟
用預先滅菌的分層水樣採集器，採集太湖沉積物界面以上不同深度的水樣0. 25L，分裝於預先滅菌的棕色玻璃瓶；用預先滅菌的彼得森採泥器(l/16m2)採集太湖表層沉積物(厚度約為IOcm)，放入已滅菌的不鏽鋼容器中；用預先滅菌的針管(15cmX 1. 5cm)採集太湖水生植物根區水樣，裝於預先滅菌的棕色玻璃瓶，上述樣品取樣後立即封口，作為菌源進行分離，富集培養。在無菌條件下，將水樣加到氨氧化細菌富集培養基中(氨氧化細菌培養基成分為(NH4)2SO4 0. 2g, K2HPO4 0. lg, MgSO4 0. 05g, NaCl 0. 2g, FeSO4 0. 04g, CaCO3 0. 5g, H2O 100ml, pH值7. 2，其中培養基在121°C溼熱滅菌20min後使用)，置於搖床上在條件下培養48h。然後再轉到氨氧化細菌的固體培養基中，固體培養基成分為(NH4)2SO4 0. 2g， K2HPO4 0. lg, MgSO4 0. 05g, NaCl 0. 2g, FeSO4 0. 04g, CaCO3 0. 5g，瓊脂 2g, H2O 100ml, pH 值 7. 2，將擴培後的菌種進行平板劃線初步分離，平板在培養48h。根據平板上長出的單個微生物，選擇其中長勢較好的進行再次富集培養。最後在固體培養基上反覆進行平板劃線分離，分離出一株對氨氮和亞硝酸鹽氮具有高效降解能力的鞘氨醇單胞菌屬菌株。該鞘氨醇單胞菌屬菌株在pH值6. 5、. 5培養基介質中培養，適合的生長溫度為 25^35 0C ；其細菌學形態特徵為革蘭氏陰性桿菌，尺寸為0.5 1.0X1 3 ym，無鞭毛， 好氧或厭氧，接觸酶陽性，氧化酶陽性，以(X)2為碳源及能量或者以(X)2和有機物為混合碳源和能量、氨氮或硝態氮為氮源生長。該菌在固體培養基上培養15 20天，菌落小，呈圓形，邊緣光滑，表面光滑，菌體呈現淡黃色，極易挑起。依據該菌株形態學以及分子生物學分析，可鑑定其為鞘氨醇單胞菌屬的菌株。 用PCR儀(GeneAmp，PCR system 9700 )進行擴增反應。擴增反應體積為10 X Taq聚合酶反應緩衝液 5 μ L，dNTP(20mmol/L)5y L,5'端和 3'端引物(25/7mol/μ L)各 2 μ L， Mg2+ (25mmol/L) 6 μ L,菌體 DNA (約 50ng/ μ L) 1 μ L, Taq DNA 聚合酶(5U/ μ L) 0· 5 μ L， Η2028· 5 μ L，總體積50 μ L0反應條件為首輪循環94°C變形2min ；在接94°C 30s, 50°C 30s， 72°C lmin,30個循環；最後72°C延伸lOmin。1. 5%的瓊脂糖凝膠，EB染色後紫外檢測。通過Blast程序進行同源性比較，表明該菌株與^^i/^oMwas sp.相似度高達99%以上、 可重複性99%。
製備鞘氨醇單胞菌屬菌株的細胞液體培養物
挑取固體培養基上的鞘氨醇單胞菌屬菌株單菌落於裝有滅菌的液體培養基中，於 28°C, pH 7.5，80r/min，進行好氧培養48h，取培養好的菌液Iml接種在裝有100 ml含氨氮(100 mg/L)的基礎培養基的250 ml錐形瓶中，28°C，pH 7. 5，80r/min，進行好氧培養48 h，即為鞘氨醇單胞菌屬菌株的細胞液體培養物。製備固定化鞘氨醇單胞菌
採用親水性玻璃態單體丙烯酸羥乙酯(HEA)、甲基丙烯酸β羥乙酯(HEMA)與蒸餾水按照一定的體積比混合均勻，在_63°C _95°C溫度條件下，用劑量為1 X IO3Gy 1 X IO6Gy的高能射線輻照形成生物相容性固定化共聚物多孔載體，加入經活化培養進入對數生長期的鞘氨醇單胞菌屬菌液，使之吸附於固定化載體表面並通過增殖進入多孔載體內部實現固定化。實施例2
本發明在富營養培養基中對氨氮降解研究的應用，其步驟如下在250ml的錐形瓶中加入50ml富營養培養基(氨氮濃度為100mg/L)。[2]將實施例1製得的鞘氨醇單胞菌屬菌株的細胞液體培養物加入上述[1]的錐形瓶中，28°C，80r/min，好氧培養。每隔2小時取樣測定。圖1為鞘氨醇單胞菌屬菌株在富集培養基中降解氨氮情況。從圖1可以看出，菌體少量的生長足以使氨氮降解，接種 6小時後，氨氮的去除率接近100 %。實施例3
本發明在以葡萄糖和(X)2為混合碳源，亞硝酸鹽為氮源培養基中對亞硝酸鹽降解研究的應用，其步驟如下將實施例1中的培養基換為以葡萄糖和(X)2為混合碳源，亞硝酸鹽為氮源的基礎培養基(亞硝酸鹽濃度為100mg/L)將實施例1製得的鞘氨醇單胞菌屬菌株的細胞液體培養物加入上述[1]的錐形瓶中，28°C，80r/min，厭氧培養。每隔2小時取樣測定。圖2為鞘氨醇單胞菌屬菌株在富集培養基中降解亞硝酸鹽情況。從圖2可以看出，菌體少量的生長足以使亞硝酸鹽降解， 接種12小時後，亞硝酸鹽的去除率接近100 %。實施例4
本發明在以乙酸鈉和(X)2為混合碳源，亞硝酸鹽為氮源培養基中對亞硝酸鹽降解研究的應用，其步驟如下將實施例1中的培養基換為以乙酸鈉和(X)2為混合碳源，亞硝酸鹽為氮源的基礎培養基(亞硝酸鹽濃度為100mg/L)將實施例1製得的鞘氨醇單胞菌屬菌株的細胞液體培養物加入上述[1]的錐形瓶中，28°C，80r/min，厭氧培養。每隔2小時取樣測定。圖3為鞘氨醇單胞菌屬菌株在富集培養基中降解亞硝酸鹽情況。從圖3可以看出，菌體少量的生長足以使亞硝酸鹽降解， 接種12小時後，亞硝酸鹽的去除率接近96 %。實施例5
本發明在以葡萄糖和(X)2為混合碳源，氨氮為氮源培養基中進行硝化一反硝化脫氮的應用，其步驟如下[1]將實施例1中的培養基換為以葡萄糖和ω2為混合碳源，氨氮為氮源的基礎培養基(氨氮濃度為100mg/L)將實施例1製得的鞘氨醇單胞菌屬菌株的細胞液體培養物加入上述[1]的錐形瓶中，28°C，80r/min，好氧一厭氧培養。每隔2小時取樣測定。圖4為鞘氨醇單胞菌屬菌株在富集培養基中降解氨氮情況。從圖4可以看出，菌體少量的生長足以使氨氮降解，接種12小時後，出水中的氨氮濃度很低，亞硝酸鹽濃度也低，系統脫氮率達到78. 6 ，實現短程硝化一反硝化，達到脫氮的目的。實施例6
本發明在實驗室模擬流化床反應器中對含氨氮廢水短程硝化的應用，其步驟如下 [1]圖5為實驗室模擬的流化床反應器。實驗在有效容積為1.7L(內徑8cm，高50cm)並帶有保溫夾套(夾套內通30士 1°C的水)的流化床反應器中進行，將實施例1製備的鞘氨醇單胞菌屬菌株的固定化菌株投入反應器中，固定化顆粒的填充率為10%，採用模擬廢水間歇式進水，同時進行曝氣，調節空氣流量，定時從反應器取出水樣，分析其中的NH4+-N、NO2--N 和Ν03_-Ν的濃度，並按下式計算氨氮去除速率和亞硝化率
氨氮去除率=(NH/-N進水一 NH4+-N出水)/ NH4+-N進水亞硝化率=NO2--N出水/( NO2--N出水 + NO3"-N^k)/ tX 100% [2]實驗進水分別為110、160、210 mg/L三種氨氮負荷條件，在30°C，曝氣量為 250ml/min條件下進行反應，M個小時後取樣測定。圖6是系統進水氨氮濃度、氨氮去除率和氮負荷速率隨時間的變化，結果表明，在三種氨氮負荷條件下，氨氮去除率和亞硝化率雖然在每次負荷提升後出現略微下降，但很快上升並穩定在較高水平，分別達到95%和90% 以上。降解的氨氮幾乎全部轉化為亞硝酸鹽氮，亞硝化率維持在90%以上，短程硝化效果明顯。實施例7
本發明在實驗室模擬流化床反應器中對含亞硝酸鹽氮和有機廢水短程反硝化的應用， 其步驟如下圖5為實驗室模擬的流化床反應器。實驗在有效容積為1.7L(內徑8cm，高50cm) 並帶有保溫夾套(夾套內通30士 1°C的水)的流化床反應器中進行，將實施例1製備的鞘氨醇單胞菌屬菌株的固定化菌株投入反應器中，固定化顆粒的填充率為10%，採用模擬廢水間歇式進水，調節空氣流量為60ml/min，造成一定擾動，定時從反應器取出水樣，分析其中的 NH/-N、NO2--N和NO3--N的濃度，並按下式計算氮負荷速率
權利要求
1.一種鞘氨醇單胞菌屬菌株，其特徵在於鞘氨醇單胞菌屬菌株為sp. LZW3，其細菌學形態特徵為革蘭氏陰性桿菌，尺寸為0.5 1.0 X 1 3 μ m，無鞭毛，好氧或厭氧，接觸酶陽性，氧化酶陽性，以(X)2為碳源及能量或者以(X)2和有機物為混合碳源和能量、氨氮或硝態氮為氮源的基礎培養基中生長，該菌株於2011年1月30日保藏於「中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心」，其保藏號CGMCC No . 4589。
2.根據權利要求1所述的鞘氨醇單胞菌屬菌株篩選方法，其特徵在於該菌株是從太湖水體的水生植物根區、太湖水體敞水區以及太湖沉積物中採集、分離得到；該菌株在PH 值6. 5、. 5培養基介質中培養，適合的生長溫度為25 35 °C。
3.根據權利要求1所述的鞘氨醇單胞菌屬菌株，其特徵為該菌株是游離生物菌製劑或固定化菌株。
4.根據權利要求3所述的鞘氨醇單胞菌屬菌株在水處理中的應用。
5.根據權利要求3所述的鞘氨醇單胞菌屬菌株在廢水生物脫氮的短程硝化一反硝化中的應用。
6.根據權利要求3所述的鞘氨醇單胞菌屬菌株在受汙染水源水淨化中的應用。
全文摘要
本發明屬於環境工程、生物工程技術領域。具體涉及鞘氨醇單胞菌屬菌株及其對含氮工業廢水、生活汙水的短程硝化－反硝化脫氮以及在受汙染水源水中的處理應用。本發明涉及的鞘氨醇單胞菌菌株，分離自我國太湖水體，為本土菌種，生物安全性高；該菌株可以以CO2為碳源及能量或者以CO2和有機物為混合碳源和能量、氨氮或硝態氮為氮源的基礎培養基中生長。其菌液、休眠細胞以及固定化菌株均可以將氨氮分解為亞硝酸鹽氮，同時可以將氨氮轉化為氮氣，既能夠作為脫氮微生物將氨氮轉化為亞硝酸鹽氮，又能夠將氨氮轉化為氮氣，實現短程硝化－反硝化，對氨氮的降解速度快，適用於含氮工業廢水、含氮生活汙水以及受汙染水源水處理。
文檔編號C12R1/01GK102168054SQ20111004405
公開日2011年8月31日 申請日期2011年2月24日 優先權日2011年2月24日
發明者馮露露, 吳凱, 吳寧梅, 周濤, 周莉, 李正魁, 潘靜贇, 王易超, 王月明, 範念文, 趙琳, 陳祈春 申請人:南京大學