大豆7S球蛋白(α+β)亞基缺失型種質的α-亞基基因的特異性序列片斷的製作方法

2023-08-06 11:56:31

專利名稱：：大豆7S球蛋白(α+β)亞基缺失型種質的α-亞基基因的特異性序列片斷的製作方法大豆7S球蛋白(oc+p)亞基缺失型種質的oc-亞基基因的特異性序列片斷.
技術領域：
.本發明涉及一種大豆蛋白的棊因序列片斷。
背景技術：
：7S球蛋白是大豆種子貯藏蛋白的重要組分之一，大豆7S球蛋白亞基組成的不同直接影響大豆蛋白的營養品質和加工特性。大豆7S球蛋白也稱P-伴大豆球蛋白，是由a'-(76kDa),a-(72kDa)禾Q卩-(52-54kDa)三個亞基組成的分子量為150kDa的三聚體化合物，具有天然的降血脂和降低血清膽固醇含量的保健功能。近年的研究結果表明大豆7S球蛋白的a-亞基是大豆蛋白的主要過敏源之一，但現有技術不能夠實現在分子水平上調控大豆7S球蛋白oc-亞基的表達
發明內容.本發明是為了解決現有技術不能在分子水平上調控大豆7S球蛋白oc-亞基的表達的問題，而提供大豆7S球蛋白(oc+p)亞基缺失型種質的a-亞基基因的特異性序列片斷。大豆7S球蛋白(cc+(3)亞基缺失型種質的oc-亞基基因的特異性序列片斷長度為1379bp，基因序列如SEQIDNO.l所示。本發明成功的製備出與大豆7S球蛋白(a+p)亞基缺失型種質a-亞基缺失特性相關的ot-亞基基因的特異性序列片斷，實現了在分子水平上調控大豆7S球蛋白ot-亞基的表達。(a+P)-亞基缺失型與日E(^基表現正常型)的部分a-亞基基因擴增片段的序列(NCBI序列號為GeneBank:M36686)進行比較，日E(亞基表現正常型)與(a+p)-亞基缺失型之間相同的核苷酸同源性為90.9%。具體實施例方式具體實施方式一本實施方式按照如下方法製備大豆7S球蛋白(a+j3)亞基缺失型種質的ot-亞基基因的特異性序列片斷一、大豆7S球蛋白a-亞基缺失突變體的分析確認(SDS-PAGE梯度電泳法)a、稱取5mg的大豆粉，加入0.5mL的抽提緩衝液(0.05M鹽酸緩衝液(Tris-HCl,pH8.0)，0.2%十二烷基硫酸鈉(SDS)，5M尿素(Urea))充分混勻，在室溫條件下靜置過夜，加入10pL的巰基乙醇，混勻，在4'C的條件下以14000r/min的速度離心15min,取20pL上清液進行SDS-PAGE電泳與考馬斯亮藍染色；b、凝膠製備(1)分離膠11.98%的分離膠配方如表1所示，依表中順序加入試劑，攪拌均勻，最後加入N，N，N'，N'-四甲基乙二胺(TEMED)，混勻後快速灌入裝好的玻璃板內，用膠頭滴管加入一水層，等待分離膠凝固大約IO分鐘，凝固後倒掉水層；'表1tableseeoriginaldocumentpage5(2)聚合膠4.38%的聚合膠配方如表2所示，藥品配製步驟同分離膠，最後加入TEMED，混勻後快速灌在分離膠上，插入梳子，等待其凝固大約15分鐘，小心拔出梳子，待用；.表2.tableseeoriginaldocumentpage5c、電泳將聚丙烯醯胺膠板固定於電泳槽上。加lxTAE於電泳槽內，確保電泳槽內不漏液。用微量移液器取1015pL上清液，點入點樣孔內，待所有的材料點樣完成後，開動電泳儀，先將電泳儀的電流調到15mA進行15分鐘，後調到30mA進行40-60分鐘；d、染色、脫色電泳結束後，先卸板，將板上部的聚合膠去除，切角(目的記住點樣順序)，然後放到染色劑中染色30min，染色結束後換成脫色劑脫色數小時直至條帶清晰。染色、脫色過程需在搖床上進行；e、譜帶分析用BIO-IDImage軟體對圖象進行處理、分析，根據各譜帶峰面積的大小，分析每個電泳樣品的蛋白質^a成，計算a-亞基的相對含量。二、大豆種子基因組DNA的提取a、取經聚丙烯醯胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)確認過亞基表現的大豆種子，去掉種皮，研磨成粉末狀，稱取20mg的豆粉裝入1.5mL的離心管內；b、加入DNA提取液(pH值為7.8，具體成分見表3)40(^L和6^iL的蛋白酶K浸透粉末，倒轉離心管，使粉末充分散開。然後在55。C水浴中保溫20min;表3tableseeoriginaldocumentpage6c、加入400mLPCI溶液(pH值為7.8，具體成分見表4)充分混勻，然後在4。C的條件下以12000r/min的速度離心5min;表4tableseeoriginaldocumentpage6d、取上清液放入1.5mL的離心管中，加入400nL的異丙醇，混勻後室溫下靜置30min，再在4。C的條件下以12000r/min的速度離心5min;e、棄去上清液，加入400pL的TE(Tris-HCl和乙二胺四乙酸(EDTA)的混合液，具體成分如表5所示)溶解後在4。C的條件下以12000r/min的速度離心3min;表5tableseeoriginaldocumentpage7f、取上清液放入1.5mL的離心管中，加入2pLRNA酶在37。C的水浴保溫30min，再加入40pL的濃度為3mol/L的NaAC溶液和lmL的巰基乙醇，混勻後在室溫下靜置10min，然後在4。C的條件下以12000r/min的速度離心5min，棄去上清液，加入lmL的質量濃度為7(P/。的酒精，然後在4"C的條件下以12000r/min的速度離心5min，再次棄去上清液後在4°C的條件下以12000r/min的速度離心5min，再棄去上清液;g、將離心管倒置在吸水紙上，自然乾燥至上清液消失，再加200pL的無菌去離子水溶解，4。C保存；即得到大豆種子基因組的DNA。三、用PCR反應製備(a+(3)亞基缺失型種質的a-亞基基因的特異性序列片斷oc-亞基基因的特異性弓I物序列正向弓I物CTTCAATCTGGTGATGCCCT反向引物CAAAGGACCCTTTCTTCCCTPCR反應體系如表6所示，反應程序如表7所示表6tableseeoriginaldocumentpage7表7tableseeoriginaldocumentpage7tableseeoriginaldocumentpage8三、將PCR'產物用EZ-10spincolumnDNA回收試劑盒(上海生工出品)進行切出與純化a、加入48mL質量濃度為99%乙醇於洗脫液中待用；將洗脫緩衝溶液放到55"C的水浴鍋中預熱；'b、稱量1.5mL離心管，記錄重量；c、切膠，並將DNA膠移至稱量好重量的1.5mL離心管內，再稱重量，計算出膠塊的重量；d、按每100mg膠塊加400pL結合緩衝液II(BindingbufferII)的比例加入結合緩衝液II(BindingbufferII)，再放入506(TC的水浴10min，期間每隔3min上下顛倒離心管直至凝膠完全溶解；e、溶解的凝膠加到EZ-10柱中，在375(TC的恆溫金屬浴中靜置2min後以8000r/min的速度離心lmin，棄離出液;'f、加入500^L的洗脫液(ElutionBuffer)到上步的'EZ-IO柱中，再以8000r/min離心lmin棄離出液，重複本步驟一次；g、再以10，000r/min的速度離心lmin，棄離出液；h、將上步的EZ-10柱放到一個新的1.5mL離心管中，在柱的中心加入3050)iLS5。C預熱的洗脫緩衝液，在3750。C的恆溫金屬浴中靜置2min，再以10000r/min的速度離心lmin，然後回收DNA，放到-20。C中保存。四、大腸杆齒感受態細胞的製備a、取DH-5ot大腸桿菌原種，於LB瓊脂板上劃線培養(過夜)；b、挑取新鮮單菌落，接種於30mL的LB培養基中，37。C震蕩培養過夜；c、取對數生長期的菌液，按1/100的稀釋比例接種於50mL的LB液體培養基中，'繼續培養至OD6oo為0.40.5;d、菌液冰浴"min,分.裝於1.5mL無菌離心管中，在4。C的條件下以4000r/min的速度離心6min，收集細菌沉澱；e、加入600pL的冰預冷無菌的0.1mol/L的CaCl2溶液，懸浮細菌沉澱，在冰浴條件下保溫30min，再在4°C的條件下以4000r/min的速度離心10min，收集細菌沉澱；'f、每管加入100pL冰浴冷的0.1mol/L的CaCl2溶液，重懸細菌沉澱，即為感受態細胞，在4'C下保存；五、目的片段的連接反應.a、PCR產物濃度需確保為0.2pmol/L，體系最終用去離子水調整至終體積為10iaL，反應體系如表8所示，其中T4QNA連接酶應最後加入;b、連接產物在16'C的金屬浴中過夜；表8.tableseeoriginaldocumentpage9六、連接產物轉化大腸桿菌a、向在16。C過夜的連接產物內加入l^iL、5mol/L的NaCl溶液中，用槍頭輕輕混勻，加入100pL的感受態細胞，混勻後在冰上放置30min，再放42°C的水浴中熱'激45s後，迅速置於冰上冷卻2min;b、加入90(HiL的LB液體培養基，，在37。C的水浴中以100r/min的速度振蕩培養1.5h;c、將200mg/mL異丙基-(3-D-硫代半乳糖苷(IPTG，具體成分如表9所示)和Mmg/mL5-溴4-氯-3-卩引哚-P-D-半乳糖苷(X-gal，具體成分如表10所示)依次均勻塗布於^"有抗生素(100mg/mL的氨苄青黴素(Amp))的預先製備好的LA培養基上，待用。表9藥品.劑量IPTG2gtableseeoriginaldocumentpage10d、將培養好的菌液轉移至1.5mL離心管內，收集細菌沉澱，並將菌液均勻塗布於LA板上，37。C倒置培養14~16小時；七、克隆產物的篩選a、藍、白斑確認選擇LA板上白色單一菌落，編好序號，轉移至新LA板上；'b、重組質粒的篩選和鑑定，'質粒檢測PCR反應體系如表11所示，PCR反應程序如表12所示，質粒篩選通用引物序列為正向弓I物5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'反向引物5'-AGAGGATAACAATTTCACACAGGA-3'表11tableseeoriginaldocumentpage10八、質粒DNA的製備鹼裂解法小量製備質粒DNA(採用EZ—IOSpinColumn質粒DNA提取試劑盒)a、將洗脫緩衝液放到375(TC的水浴中待用；檢查SolutionII是否有沉澱，若有，37"保溫至沉澱溶解，加RNaseA溶液(具體成分如表13所示)到SolutionI中混勻，在4。C保存，加入48mL、濃度為96%~100%的乙醇到12mL的洗脫液中混勻；tableseeoriginaldocumentpage11b、挑取一個PCR檢測為陽性的單菌落在10mL的LA液體培養基中、37"C的條件下振蕩培養過夜；c、取2個1.5mL離心管，每管加入1.5mL的過夜培養的菌液，在4"C的條件下以12000r/min的速度離心lmin，除去上清液，重複此步驟35次；d、加入200^iL的SolutionI到離心管中，振蕩至懸浮，靜置2min，再加入400pL的SolutionII，上下顛倒46次，室溫靜置lmin，然後加入700pL的SolutionIII，輕緩混勻，室溫靜置2min，然後以12000r/min的速度離心5min;e、取上清液於EZ—10柱中，室溫靜置lmin，以8000r/min的速度離心lmin，棄掉離出液，再加入500pL的洗脫液到EZ—10柱中，以8000r/min的速度離心lmin，棄掉離出液，.然後加入50(HiL的洗脫液到EZ—10柱中，以8000r/min的速度離心lmin，棄掉離出液，再以10000r/min的速度離心lmin，棄掉離出液；f、把EZ—10柱放到一個新的1.5mL離心管中，加50pL的洗脫緩衝液到EZ—10柱的中心處，室溫靜置2min，再以10/000r/min的速度離心2min，回收質粒DNA，將獲得的質粒DNA放到-20。C保存；九、將PCR檢測呈陽性的菌株進行測序，即得到大豆7S球蛋白(a+卩)亞基缺失型種質的oc-亞基基因的特異性序列片段，長度為i379bp，基因序列如下所示tableseeoriginaldocumentpage12序列表<110〉劉珊珊-〈120大豆7S球蛋白(a+(3)亞基缺失型種質的a-亞基基因的特異性序列片斷511379DNA人工序列大豆73球蛋白(a+P)亞基缺失型種質的qc-亞基基因的特異性序列片斷1.gtgatgccctaagcagctccctgcaggaaccttcaatctgctgacaa&gagatUgaggtcaaatcttaagctccagtagcgacccgtttccgcgcggggggttctgaagatcaagttgtttcagtgttgtgcactttcttcctttgttcacgtactagtgacggcgaacg3tactgaatttctcatattttgttttattaatt犯tttgaaggcgttccctggttgtggatgccgagaatctcactacttattgatcaatcttcctacttgcaacaccatctattgattttatcagcaacaag已ttcgggaacgagattacccg3t3tgCgtt3gttsgagtttgggtatttgtaatttgcttttgg3tatcacgatacatgtgagtctgcai61tcagcctcagag3tg3t^ctttataacttttcttttctgttcagcatacgctagc8g3CCattggggtg3gCaC3acttgsggaaacct已ttcagctctt-tttaggcaaacgccctttgCCC3gC3ggttatcaatgcccatagctgac33tgtgataag3ta"ttg3gacaggcactcgccataattaattaactgcagagttgt3ttcaaattcaatagctgcagtgccaaatctccgcgaccccccctcagctt3aaa3ctg3ttgagactttctgccacactattgaacttggaagtgcggatatccagttggagaacccatgctgttgatgagctatttgccagataccacctaataaacacatact3tacccgttaacttattattcttcttcctatctagaggcctcttatcattatcaaggttcgtgattgagttcaaggatctattccacgggacttgg3ta^tg3ttcaattcaaattggcattaatggtccgcagaggaacttagtgUgttactaatccttttagtc3gtggagccaaagtgtggttaacc60acccggta120aatttgUtc180tagcactc240atacgacgta300ccttatattt360tgtttggtag420tggaaatctc480agaccatttc540tcgcttgg600atgtcttcct660gagttctatt720ttactttttt780ggcc由gtg840agaacaacaa900tgaattgtct960tacctcagat1020cttgcaggta1080cUtUUgt1140ggtgattgaa1200caggagcttg1260gagtcctact1320ggtcctttg1379,220DNA人工序列a:亞基基因特異性的正向引物2cttcaatctggtgatgccct20320DNA人工序列a-亞基基因特異性的反向引物3caaaggaccctttcttccct20424DNA人工序列.質粒篩選通用的正向引物4cgccagggttttcccagtcac.gac24524DNA人工序列質粒篩選通用的反向引物5agaggataacaatttcacac3gga2權利要求1、大豆7S球蛋白(α+β)亞基缺失型種質的α-亞基基因的特異性序列片斷，其特徵在於大豆7S球蛋白(α+β)亞基缺失型種質的α-亞基基因的特異性序列片斷如下所示CTTCAATCTGGTGATGCCCTAAGCAGCTCCCTGCAGGAACCACATACTATGTGGTTAACCCTGACAACGACGAGAATCTCAGAATGAIAACACTCGCCATACCCGTTAACAAACCCGGTAGATTTGAGGTACTACTTATTCTTTATAACTAATTAATTAATTATTATTCTAATTTGTTTCCAAATCTTAAGATCAATCTTTTTCTTTTCTCTGCAGAGTTTCTTCCTATCTAGCACTCAAGCTCAACAGTCCTACTTGCAAGGGTTCAGCAAGAATATTCTAGAGGCCTCATACGACGTAAGCGACCAACACACCATCTAATACGCTAGCAAATTCAATATTATCATTATCCTTATATTTGTTTCCGCGCTTGATTTTATAGACCAAATTCGAGGAGATAAACAAGGTTCTGTTTGGTAGAGAGGAGGGGCAGCAACAAGGGGAGGAGAGGCTGCAAGAGAGTGTGATTGTGGAAATCTCAAAGAAACAAATTCGGGAACTGAGCAAACATGCCAAATCTAGTTCAAGGAAGACCATTTCTTCTGAAGATAAACCTTTCAACTTGAGAAGCCGCGACCCCATCTATTCCATCAAGCTTGGCAAGTTGTTTGAGATTACCCCAGAGAAAAACCCTCAGCTTCGGGACTTGGATGTCTTCCTCAGTGTTGTGGATATGAACGAGGTAAGCAGAAAAACTGAACATGACAATTGAGTTCTATTCACTTTCTTCTTAGTTAGAGAAACCTATTCTTGAGACTTTAAATAATGATTTACTTTTTTCTTTGTTCACAAATATAGGGAGCTCTTTTTCTGCCACACTTCAATTCAAAGGCCATAGTGGTACTAGTGATTAATGAAGGAGAAGCAAACATTGAACTTGTTGGCATTAAAGAACAACAACAGAGGCAGCAACAGGAAGAGCAACCTTTGGAAGTGCGGAAATATAGAGCTGAATTGTCTGAACAAGATATATTTGTAATCCCAGCAGGTTATCCAGTTGTGGTCAACGCTACCTCAGATCTGAATTTCTTTGCTTTTGGTACAATGCCGAGAACAACCAGAGGAACTTCTTGCAGGTACATATTTTGTATATCACGATCAAATAGAACATGCTGTTGAAGTGTTGTTACTTTTTTTGTTTTATTAATTACATGTGAAACATAGCTGACTGAGCTATTTCTAATCCTTTGGTGATTGAAAATTTGAAGGTTCGAAAGACAATGTGATAAGCCAGATACCTAGTCAAGTGCAGGAGCTTGCGTTCCCTGGGTCTGCAAAAGATATTGAGAACCTAATAAAGAGCCAAAGTGAGTCCTACTTTGTGGATGCTCAGCCTCAGCAGAAAGAGGAGGGGAACAAGGGAAGAAAGGGTCCTTTG。全文摘要大豆7S球蛋白(α+β)亞基缺失型種質的α-亞基基因的特異性序列片斷，它涉及一種大豆蛋白的基因序列片斷。本發明是解決了現有技術不能在分子水平上調控大豆7S球蛋白α-亞基的表達的問題。本發明利用PCR獲得大豆7S球蛋白(α+β)亞基缺失型種質的α-亞基基因的特異性序列片斷，大豆7S球蛋白(α+β)亞基缺失型種質的α-亞基基因的特異性序列片斷長度為1379bp。本發明實現了在分子水平上調控大豆7S球蛋白α-亞基的表達。文檔編號C12N15/10GK101363023SQ20081006456公開日2009年2月11日申請日期2008年5月23日優先權日2008年5月23日發明者劉珊珊,張永強,李文濱申請人:劉珊珊