具有改變的特性的變體的製作方法

2023-08-06 09:48:51

專利名稱：具有改變的特性的變體的製作方法
技術領域：
本發明涉及親代Termamyl樣oc-澱粉酶的變體(突變體)，這些變體具有 oc澱粉酶的活性，並且在如下幾方面的性質中，顯示出至少一種與所述親 代a澱粉酶有所不同底物特異性，底物結合性，底物裂解模式，熱穩定 性，pH/活性特徵曲線，pH/穩定性特徵曲線，針對氧化的穩定性，Ca^依賴 性，比活性，和溶解度，特別是在生產與應用環境下。
背景技術：
cc澱粉酶(ot-l，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，E.C. 3.2丄1)組成一組催化澱 粉和其它直鏈和支鏈1 ，4-糖苷鍵寡糖和多糖水解的酶。
在現代工業生物技術中，在發酵、純化、回收過程的中和產物配製中可 出現高蛋白濃度。
在發酵過程中，蛋白的濃度取決於所用的宿主細胞。在工業生產過程中， 蛋白濃度一般為0.1克/升發酵液以上。而在芽孢桿菌中大量重組生產oc-澱粉 酶時，蛋白濃度可高達250克/升發酵液。經過純化，蛋白濃度可以達到大 約1000克/升水平。這樣的高濃度導致不希望有的沉澱，而使得活性蛋白丟 失。增加產物的強度是目前的趨勢，這種增加的強度可使酶在更重要的溶 液中得以維持。蛋白溶液濃度的升高通常導致蛋白的沉澱，而沉澱的蛋白 很難溶解成活性蛋白。
所以，本發明的目標是提供具有以下改變的特性的a-澱粉酶，特別是 使其溶解度增加。
發明簡述本發明的目的是提供Termamyl樣澱粉酶的變體，它們與相應親代oc-澱 粉酶即未突變的oc澱粉酶相比，具有oc-澱粉酶活性，並且相對於親代oc-澱 粉酶，顯示如下性質中至少一種性質的改變底物特異性，底物結合性，底 物裂解模式，熱穩定性，pH/活性特徵曲線，pH/穩定性特徵曲線，針對氧化 的穩定性，Ca"依賴性，比活性和溶解度，特別是在製備條件下的溶解度。
命名法
在本說明書和權利要求中，用到了常用的I個字母和3個字母的氨基 酸代碼。為便於參考，本發明中的ct-澱粉酶變體用下面的命名法來描述 原胺基酸位置取代的胺基酸
依照這種命名法，舉例來說，將第30位的丙氨酸取代為天冬醯胺，表 示為Ala30Asn或A3 ON
在相同位置缺失丙氨酸表示為 Ala3(^或A30*
插入另外一個胺基酸殘基，如賴氨酸，表示為 Ala30AlaLys或A30AK
—段連續的胺基酸殘基的缺失，例如，第30-33位的胺基酸殘基被缺失， 表示為(30-33^或A(A30-N33)。
當某一cc-澱粉酶與其他oc-澱粉酶相比有一個"缺失"，並在該位置上 又插入了一個胺基酸則表示為
*36Asp或*360
即，在第36位插入了天冬氨酸。 多突變被"+"號分隔開，如 Ala30Asp + Glu34Ser或A30N+E34S
代表第30位的丙氨酸和第34位的穀氨酸分別被天冬醯胺和絲氨酸取代。
當一個或多個可選擇的胺基酸殘基插入同一給定位點時，表示為 A30N,E或 A30N或A30E
另外，當本文中鑑定出 一個適於修飾的位點而沒有提示任何特定的修飾 時，應理解為任何一個胺基酸殘基都可以取代這個位點上現有的胺基酸。例如，當提到在位點30的丙氨酸的修飾，而又沒有特別指明進行何種修飾時， 應理解為該丙氨酸可以被缺失或被下列任何一個胺基酸所取代
R，N,D,A，C,Q,E，GH，I，L,K，M，F，P，S，T,W,Y，V。
進一步的，"A30X"代表下列任何一種取代
A30R, A30N, A30D， A30C， A30Q， A30E， A30G A30H, A30I, A30L, A30K, A30M, A30F, A30P, A30S， A30T, A30W, A30Y,或A30V;或簡寫為 A30R，N,D,C,Q,E朋,I，L,K，M,F，P,S,T，W，Y,V。


圖1是五種親代Termamyl樣oc-澱粉酶胺基酸序列的比對。最左邊的數 字分別代表如下的胺基酸序列 l:SEQIDNO:4(SP722) 2: SEQ ID NO: 2 (SP690) 3: SEQIDNO: 10 (BAN) 4: SEQ ID NO: 8 (BLA) 5: SEQ IDNO: 6(BSG)。
圖2顯示由4個酶分子組成的晶格的格點視圖。每個分子都有8個相 互作用的區域。
圖3顯示由4個酶分子組成的晶格的頂視圖。
發明詳述
本發明的目的是提供多肽(如酶，特別是ot-澱粉酶)，這些多肽相對於 所述親代多肽在如下性質中有至少一種性質改變底物特異性，底物結合 性，底物裂解模式，熱穩定性，pH/活性特徵曲線，pH/穩定性特徵曲線， 針對氧化的穩定性，Ca^依賴性，比活性和溶解度，特別是在製備條件下的 溶解度。以下有對這些性質的進一步描述。
多肽
本發明的多肽包括具有生物活性，抗微生物活性，和酶活性的蛋白質。 涉及的酶活性包括蛋白酶，澱粉酶，CGT酶(CGTase)，甘露聚糖酶 (m隱anase)，產麥芽糖澱粉酶(maltogenic amylase), 葡萄糖澱粉酶，糖酶 (carbohydrase)，轉移酶，裂解酶，氧化還原酶，脂肪酶的活性。在一個優選實施方案中，所述酶是一種CX-澱粉酶，特別是芽孢桿菌屬
或麴黴屬(X-澱粉酶。在一個優選實施方案中，芽孢桿菌屬oc-澱粉酶是 Termamyl樣澱粉酶。
具有生物活性的多肽包括紅細胞生成素(EPO)， TPO,生長激素，調節 肽，凝血因子，抗體等。
改變了溶解度的多肽
蛋白(多肽)晶體是由系統排列的相同單位在三維結構上緊密堆積而成。 晶格可以包含一個或多個蛋白分子和大量的水。在三級結構中也發現有離 子例如鈣離子，鈉離子，氯離子，疏酸根離子和較大的分子如表面活性劑 和底物(在晶體生長過程中出現)。雖然單個分子和單個原子很小，但相同單 位的重複排列有利於進行X-線衍射，從而為蛋白質工程提供結構信息。
相對於晶體來說，沉澱物與聚集體是較小的單位，並且單個分子比在 晶體中時更加無序。然而分子間的某些作用與在非常有序的晶體中所見相 同，並因此可用三級結構(三維結構)和分子間信息來設計蛋白質工程改造 的、具有改變的特性的oc-澱粉酶變體，所述特性特別是沉澱趨勢下降，即 溶解度增加。
由於蛋白分子為球形和通常有不規則的表面結構，晶格中會出現大孔， 這些大孔被更加雜亂的溶劑如水佔據。實際上，大多數蛋白質表面都覆蓋 著水層，這就是為什麼通過X光晶體學方法得到的蛋白結構與溶液中的蛋 白結構相同的一個原因。蛋白分子只在極少區域直接相互接觸，但溶劑介 導的接觸可以象"膠水，， 一樣把晶體粘在一起。
通常，蛋白的溶解度受有機溶劑，鹽類如硫酸銨、氯化鈉和氯化鈣， 和改變分子表面電荷的pH變化的影響。這些因素在將酶維持於溶液中的酶 生產以及得到有效晶體的結晶學實驗中都有涉及。大的對稱晶體需要緩慢 增加蛋白質濃度或者改變蛋白表面來加強分子間相互接觸而得到。
不是所有的蛋白都結晶為有效於X光晶體學確定方法的形式，但是， 如果模板分子與目的分子的同源性足夠高，那麼根據已有的三級結構，可 以建立精確的模型。
當同源多肽(如酶，特別是以下定義的Termamyl樣oc -澱粉酶)在三級結 構基礎上相比較時，最主要差異在於分子表面。儘管如此，本發明人發現，Termamyl樣oc-澱粉酶(SP722，公開於SEQ ID NO: 4)表面的(直接或通過水分子間接)參與晶體形成的胺基酸殘基，在其 它Termamyl樣a澱粉酶的晶體形成中(以下描述)也起了關鍵作用。
以下描述了用另 一種Termamyl樣oc澱粉酶結構(SP722結構，附錄1中 公開)建立一個Termamyl樣cx澱粉酶的三級結構模型的實例。
可以理解，本發明的概念與以下描述的建模方法可以推廣到所有的多肽， 蛋白，特別是酶，如ot澱粉酶。
SP722的三級結構以及對另 一種Termamvl樣a澱粉酶三級結構的建模
本發明的oc澱粉酶突變體是基於附錄1中SP722(SEQ ID NO: 4)的三級 結構發現的，其它多肽的突變體通過其它的三級結構發現。鹼性Termamyl 樣cx-澱粉酶的結晶(8 722)(如SEQ ID NO: 4中顯示，也在美國專利 5,824,531中有描述)是用懸滴法(本領域已知的方法)得到的，其三級結構(三 維結構)見本文附錄1。
其晶格包含4個酶分子，每個分子有8個相互作用的區域(圖2和圖3)。 其中兩個區域被確定在酶的圍繞活性位點的一側，在a -澱粉酶上相對於活性 位點的背側發現了一個大的區域。所述側還有兩個相互作用的區域，分子的 頂部和底部各有一個相互作用的側面，形成"頂"對"底"的相互作用。
可以從圖2看出兩個環繞活性位點的相互作用區域與一個反向平行的 相鄰分子上的兩個相同區域之間相互作用。同樣，背側區域與第三個反向 平行的澱粉酶分子上的背側區域相接觸，但所有這些接觸都是由水分子介 導。還可以從圖2、圖3看出相互作用的區域分散在整個分子。
另 一鹼性Termamyl樣ct -澱粉酶模型AA560是基於附錄1公開的SP722 的三級結構建立的。ot-澱粉酶AA560與模板澱粉酶(SP722)大約有87%相 同，且序列對比排列不含有插入或缺失。在蛋白的生產過程中，即從發酵 到純化的過程中，由於存在高度的同源性(同一性)，相同的對稱性和相同的 晶體間相互作用，蛋白表面相同的相互作用區域參與蛋白濃度增加情況下 的晶體形成和沉澱(參見背景章節)。
在這些相互作用區域中構建突變，表達並純化酶，用"材料與方法" 章節中描述的方法，在實施例8和實施例9描述的不同條件下，對蛋白溶 解度進行檢測。本發明的發現可以應用於如下Termamyl樣cc -澱粉酶與SEQ ID NO: 12所示的Termamyl樣ot-澱粉酶至少60%相同，優選至少70%相同，更優 選80%相同，甚至更優選85%相同，甚至更優選90%相同，甚至95%相同， 甚至97%相同，甚至99%相同。這些發現優選適用於鹼性Termamyl樣cc -澱 粉酶，特別是那些與SP722(SEQIDNO:4，在圖1的序列對比中顯示為1號 的序列)比較時，在對比的一級結構中沒有添加或缺失胺基酸的，長度相同 的鹼性Termamyl樣oc-澱粉酶。這些發現尤其可以用於以下鹼性Termamyl 樣cc響澱粉酶SP690(SEQ ID NO: 2)， SP722(SEQ ID NO: 4), AA560(SEQ ID NO: 12), #707 ot-澱粉酶(SEQ ID NO: 13)，公開在KSM AP1378中的KSM APE 1738 oc-澱粉酶，WO 97/11324中公開的cc-澱粉酶，或者它們的片段 或截短形式。後面提到的這些鹼性Termamyl樣oc澱粉酶在上述相互作用的 區域周圍有非常類似的晶體三級結構，而且有485個胺基酸長的相同的一 級結構。
與此不同的是，例如，Termamyl(圖1的對比中序列號為4的序列)與 SP722對比排列時，缺少兩個胺基酸殘基(l位和2位)；在174位和181-182 位有缺口；在378-381位多了 3個胺基酸殘基。
BAN(圖1的對比中序列號為3的序列)與SP722對比缺少5個胺基酸殘 基(1_4位和488位)；在174位、181-182位有缺口；在378-381位多了 3個 胺基酸殘基。
BSG(圖1的對比中序列號為5的序列)與SP722對比缺少1個胺基酸殘 基(l位)；在489-519位多了 31個胺基酸殘基。
KSM-K36和KSM-K38(EP 1,022,334-A)與SP722對比缺少5個胺基酸 殘基(1位和2位)，並在174位、181-182位有缺口。
AA180, AA20和Amrk385(丹麥專利申請PA 2000 00347或 PCT/DK01/00133)與SP722對比在261位多了 一個胺基酸。
以下描述如何根據一種Termamyl樣a -澱粉酶建立另 一種Termamyl樣 ct-澱粉酶的模型。在實施例4中描述了根據SP722建立AA560的模型。這 種方法可以推廣用於其它的多肽如以上所提到的多肽。
Termamyl樣a -澱粉酶才莫型的建立
WO 96/23874提供了 Termamyl樣oc -澱粉酶的三級結構(三維結構)和X 光晶體結構數據，所述Termamyl樣oc-澱粉酶由解澱粉芽孢桿菌a-澱粉酶衣芽孢桿菌ot-澱粉酶(SEQ ID NO: 8)C末端301-483位胺基酸殘基組成。WO 96/23874進一步描述了 ，在分析親 代Termamyl樣a -澱粉酶的結構的基礎上，建立該親代Termamyl樣oc -澱粉 酶的相對於其親代特性已改變的變體的模型的方法。
依照WO 96/23874可以建立其它Termamyl樣結構模型，該文獻納入本 文作為參考。
至於獲得本發明的變體，如實施例l所述，基於SP722的三級結構(附 錄l中公開)設計了 AA560的三級結構(建模)。其它Termamyl樣oc-澱粉酶(例 如本文^Hf的)的結構可以用類似的方法建立。
Termamyl樣oc澱粉酶
芽孢桿菌菌抹產生的多種oc澱粉酶在胺基酸水平上是高度同源(相同) 的。多種芽孢桿菌a-澱粉酶的同一性可從以下表1中觀察到 表1
百分比 同一性
707AP1378BANBSGSP690SP722AA560Terma
707100.086.466.966.587.686.295.568.1
AP137886.4跳O67.168.195.186.686.069.4
BAN66.967.1100.065.667.168.866.980.7
BSG66.568.165.6100.067.967.166.365.4
SP69087.695.167.167.9100.087.287.069.2
SP72286.286.668.867.187.2100.086.870,8
AA56095.586.066.966.387.086.8跳O68.3
Termamyl68.169.480.765.469.270.868.3100.0
例如，地衣芽孢桿菌oc澱粉酶包含SEQ ID NO:8所示的胺基酸序列(可 以TermamylTM商品名購買到)，已發現其與包含SEQ ID NO:10所示胺基酸序 列的解澱粉芽孢桿菌oc -澱粉酶有約81%的同源性，與包含SEQ ID NO:6所 示胺基酸序列的嗜熱脂肪芽孢桿菌的oc-澱粉酶有約65%的同源性。其它同 源的ot澱粉酶包括WO 95/26397中公開的SP690和SP722,本文中SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4分別對它們進行了的描述。其它澱粉酶有來源於芽孢 桿菌的AA560 cc -澱粉酶(SEQ ID NO:12)和來源於芽孢桿菌的存707 cx -澱粉酶(顯示在SEQ ID NO: 13), Tsukamoto et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 151(1988), pp. 25-31對此有描述。
KSM AP1378 ct -澱粉酶公開於WO 97/00324(來自KAO公司)。另外， EP 1,022,334中公開了 K38和K38oc-澱粉酶，對此本發明也有涉及。
其他同源的oc-澱粉酶包括由EP 0252666描述的地衣芽孢桿菌菌才朱 (ATCC 27811)產生的ot-澱粉酶，以及WO 91/00353和WO 94/18314中所確 定的oc -澱粉酶。其它商品化的Termamyl樣a -澱粉酶包括用以下商品名稱 出售的產品Optitherm 和TakathermTM(Solvay出品)；MaxamylTM(Gist-brocades/Genencor出品),Spezym AA 和Spezyme AAA (Genencor出品)， 還有KeistaseTM(Daiwa出品)，Purastar ST 5000E, PURASTRA HPAM L(Genencor Int.出品)。
由於這些oc澱粉酶的結構同源性，所以它們#1認為屬於同 一類a -澱4分 酶，即"Termamyl才羊a-澱4分酶"。
因此，本文術語"Termamyl樣a-澱粉酶"意指那些在胺基酸水平上與 Termamyl ,即具有本文SEQ ID NO: 8所示胺基酸序列的地衣芽孢桿菌ot -澱粉酶基本相同的a -澱粉酶。
換言之，以下所有具有本文SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8， 10， 12,和13所示氨基 酸序列的a -澱粉酶，被認為是"Termamyl樣ot -澱粉酶"。其它Termamyl樣 oc-澱粉酶是如下oc-澱粉酶i)與上述SEQ ID NO: 2,4, 6， 8, 10， 12,和13所 示胺基酸序列中至少一種胺基酸序列有至少60%,如至少70%,例如至少 75%，或至少80%，至少85%,至少90%,至少95%,至少97°/。，至少99% 的同源性，和/或ii)由能與編碼上述oc-澱粉酶的DNA序列(本說明書中SEQ ID NO: 1,3， 5， 7,9,它們分別編碼本文SEQ ID NO: 2, 4, 6， 8， 10, 12所示氨基 酸序列)雜交的DNA序列編碼。
關於特性i)，同源性是兩個序列之間提示第一個序列從第二個序列衍生的 同一性程度。同源性可通過本領域已知的電腦程式如GCG軟體包提供的 GAP程序適當確定(如上所述)。這時，Gap GCGv8可以用如下默認參數缺 口產生罰分為5.0,缺口延伸罰分為0.3,默認得分矩P車，對核酸序列和蛋白質 序列分別為3.0和0.1 。 GAP用Needleman/Wunsch/Sellers方法進4亍排列對比。
Termamyl(SEQ ID NO: 8)和另 一種Termamyl樣a -澱粉酶的結構對比可 以用來確定其它Termamyl樣a-澱粉酶中等效的/相應的位置。 一種獲得所述結構對比的方法是應用GCG軟體包的Pile Up程序，採用缺口罰分默認值， 即缺口產生罰分用3.0,缺口延伸罰分用O.l。其它結構對比方法包括疏水簇 分析(Gaboriaud et al.， (1987), FEBS LETTERS 224, pp. 149-155)和反向穿 梭(reverse threading)法(Huber, T;Tord， AE， PROTEIN SCIENCE Vol. 7， No. 1 pp. 142-149(1998)。 雜交
用於鑑定多肽，如具有以上ii)特性的Termamyl樣a -澱粉酶的寡核苷酸 探針，可以在所述a -澱粉酶的全部或部分核苷酸或胺基酸序列&出上適當製備。
雜交檢測的適當條件包括在5xSSC中預浸泡，於 40。C,在含有20%曱 醯胺，5xDenhardt溶液，50mM磷酸鈉，pH 6.8,和50mg變性的超聲波處理的 小牛胸腺DNA的溶液中預雜交1小時，然後於 40。C,在補充有100mMATP 的上述相同溶液中雜交18小時，再於40。C,用2xSSC， 0.2% SDS洗濾膜 三次，每次30分鐘(低嚴緊度)，優選在50。C(中等嚴緊度)，更優選在65。C(高 嚴緊度)，甚至更優選在約75。C(極高嚴緊度)進行洗滌。雜交方法的更多細 節描述於Sambrook等,Molecular—Cloning: A Laboratory Manual,第二版Cold Spring Harbor, 1989。
本文中，"衍生" 一詞不僅指所述菌抹產生或可誘導產生的oc-澱粉酶， 還指由分離自這種菌林的DNA序列編碼的ot -澱粉酶和在所述DNA序列轉 化的宿主生物中產生的oc-澱粉酶。該術語還指由合成的和/或cDNA來源的 DNA序列編碼的oc-澱粉酶，其有所述oc澱粉酶的可鑑別的特徵。該術語也 指親代a-澱粉酶的天然產生的變體，即天然產生的a-澱粉酶經一個或多個 (幾個)胺基酸殘基的修飾(插入，取代，缺失)後產生的變體。
親代Termamvl樣a -澱粉酶
根據本發明，如上所述的所有Termamyl樣ot-澱粉酶，都可以作為親代 (即，骨架(backbone))a-澱粉酶。在本發明的優選實施方案中，親代oc-澱粉 酶衍生自地衣芽孢桿菌，例如，上述那些a -澱粉酶之一，如具有SEQ ID NO: 10所示胺基酸序列的地衣芽孢桿菌a-澱粉酶。尤其優選的親代a-澱粉酶是 SP722a-澱粉酶和AA560oc-澱粉酶。在一個實施方案中，親代a-澱粉酶有 一個或多個以下突變/取代A(R81-G182); A(D183-G184); A(D183-G184)+N195F; RR181Q+N445Q+K446N; A(D183-G184)+R181Q。親代雜合體Termamyl樣oc -澱粉酶
親代cc -澱粉酶(即骨架a -澱粉酶)也可以是雜合體a -澱粉酶，即包含來 自至少兩種oc-澱粉酶的部分胺基酸序列之組合的oc-澱粉酶。
親代雜合體a -澱粉酶可以是這樣一種oc -澱粉酶，在胺基酸序列同源性 (同一性)和/或DNA雜交(如以上所確定的)基礎上，能確定其屬於Termamyl 樣ot-澱粉酶家族。在此情況下，雜合體a-澱粉酶通常由以下部分組成 Termamyl樣a-澱粉酶的至少一部分和從微生物(細菌或真菌)和/或哺乳動物 來源的Termamyl樣oc -澱粉酶或非Termamyl樣a -澱粉酶中選定的一種或多 種其它的a -澱粉酶的部分。
所以，親代雜合體oc-澱粉酶可包含來源於至少兩種Termamyl樣ct-澱 粉酶，或來源於至少 一種Termamyl樣和至少 一種非Termamyl才羊細菌a -澱 粉酶，或來源於至少 一種Termamyl樣a-澱粉酶和至少 一種真菌cx -澱粉酶的 部分胺基酸序列的組合。作為部分胺基酸序列的來源的Termamyl樣a-澱粉 酶，可以是本文所涉及的那些具體Termamyl樣cc -澱粉酶中的任何一種。
例如，親代ot-澱粉酶可以包含來源於地衣芽孢桿菌菌抹a-澱粉酶的C 末端部分和來源於解澱粉芽孢桿菌菌抹或嗜熱脂肪芽孢桿菌菌抹a-澱粉酶 的N末端部分。例如，親代ot-澱粉酶可包含地衣芽孢桿菌cx-澱粉酶的C末 端部分至少430個胺基酸，並且可包含a)相當於解澱粉芽孢杵菌具有SEQ ID NO: 10所示胺基酸序列的a -澱粉酶N末端37個胺基酸殘基的胺基酸片段， 和相當於地衣芽孢桿菌具有SEQ ID NO: 8所示胺基酸序列的a -澱粉酶C末 端445個胺基酸殘基的胺基酸片段，或與該Termamyl序列相同的雜合體 Termamyl樣cx -澱粉酶，即SEQ ID NO: 8所示地衣芽孢桿菌a -澱粉酶，但 其成熟蛋白的N末端35個胺基酸殘基，已被BAN(成熟蛋白)即SEQ ID NO: 10所示的解澱粉芽孢桿菌cx -澱粉酶N末端33個殘基取代；或b)相當於 嗜熱脂肪芽胞桿菌具有SEQ ID NO: 6所示胺基酸序列的a -澱粉酶N末端68 個胺基酸殘基的胺基酸片段和相當於地衣芽孢桿菌具有SEQ ID NO: 8所示 胺基酸序列的a -澱粉酶C末端415個胺基酸殘基的胺基酸片段。
另一種適合的親代雜合體a-澱粉酶是此前WO 96/23874(出自Novo Nordisk)中描述的，其由BAN,解澱粉芽孢桿菌a-澱粉酶的N末端(成熟蛋 白的1-300位胺基酸)和Termamyl的C末端(成熟蛋白的301-483位胺基酸) 構成。改變的特性 以下討i侖表現為本發曰/
親代Termamyl樣a -澱粉酶)之間的相互關係。
如上所述，本發明涉及特性改變的，特別是在生產條件下特性改變的 Termamyl樣a -澱粉酶。
涉及到改變的特性時，尤其涉及的親代Termamyl樣a-澱粉酶是上述提 到的親代Termamyl樣cx-澱粉酶和親代雜合體Termamyl樣oc-澱粉酶。以 SP722 oc-澱粉酶作為起點，但例如Termamyl, BSQ BAN, AA560, SP690, AA180,KSM，AP1378,和#707, K38,和K36的相應位點也應理解為已〃>開。
在優選實施方案中，本發明的變體的溶解度已經增加，尤其是在洗滌或 清洗條件下。
本發明一方面涉及上述具有特性改變的變體。
第一方面，親代Termamyl樣oc-澱粉酶的變體在選自下組的一個或多個 位點(用SEQIDNO: 12的胺基酸編號)包含改變
R28, R118, N174; R181, G182, D183, G184, G186, W189, N195, M202, Y298， N299， K302， S303， N306, R310， N314; R320， H324, E345, Y396, R400， W439， R444, N445， K446, Q449, R458, N471， N484，
其中
(a) 所述每一改變是
(i)在佔據該位點的胺基酸下遊插入一個胺基酸，
Cii)缺失佔據該位點的胺基酸，或
(iii)用另一胺基酸取代佔據該位點的胺基酸，
(b) 變體有cx澱粉酶活性和
(c) 每一位點都對應於具有SEQIDNO: 12所示AA560胺基酸序列的親 代Termamyl樣oc -澱粉酶的胺基酸序列位點。
在SP722(SEQ ID NO: 4)中，這種相應位點是R28; N94; L118; N125; Q174; R181; G182; D183; G184; A186; W189; N195, M202, Y298; N299; N302; S303; N306; A310; N314; K320; H324; Q345; F396， T400, W439, Q444; N445, K446, Q449， K458; N471; K484。
在優選實施方案中，本發明的變體有一個或多個如下突變/取代(用SEQ ID NO: 12的編號)△G184; A(R181-G182); A(D183-G184); R28N,K; S94K; R118K; N125A，R，K; N174D; R181Q，E，K; G186R; W189R，K; N195F; M202L; Y298H,F; N299A; K302R; S303Q; N306QD,R，K; R31 OA，K,Q,E,H，D,N; N314D; R320K; H324K; E345R，D，K，N; Y396F; R400T，K; W439R; R444K; N445K,Q; K446N: Q449E; R458K; N471E; N484Q。
優選的雙重，三重和多重突變(以SEQIDNO: 12為編號^5il0包括
A(D183-G184)+R181Q;
A(D183-G184)+G186R;
A(D183-G184)+磨5F;
A(D183-G184)+M202L;
△(D183-G184)+G186R+N195F;
△(Dl 83-Gl 84)+Nl 95F+R400T;
△(Dl 83-Gl 84)+N195F+W439R;
△(D183-G 184)+Nl 95F+Q449E;
△(Dl 83-Gl 84)+Nl 95F+N484Q;
△(Dl 83-Gl 84)+N195F+K446N;
△(Dl 83-Gl 84)+N195F+N445Q+K446N+N484E;
△(Dl 83-Gl 84)+N195F+N445Q+K446N+Q449E;
△(D183-Gl 84)+磨5F催71E;
△(D183畫G 184)+N 195F+H324K;
△(Dl 83-Gl 84)+N195F+Y396F;
△(D183-G 184)+N 195F+K446D;
A(D183-G184)+N195F+R181Q;
A(D183-G184)+N195F+R181E;
△(D183-G 184)+N 195F+N445Q+K446N;
N445Q+K446N;
N445Q+K446N+N484E;
N445Q+K446N+Q449E;
△(Dl 83-Gl 84)+Nl 95F+R181Q+N445Q+K446N;
A(D 183-Gl 84)+Nl 95F+R181Q+K446N;
△(D183-G 184)+Nl 95F+R181Q+N445Q+K446N+N484E;△(D183-G184)+N 195F+R181E+N445Q+K446N;
A(D 183 -G184)+N 195F+R181E+K446N;
△(Dl 83-Gl 84)+Nl 95F+R181E+N445Q+K446N+N484E;
A(D183-G184)+N195F+N445Q+K446N+Y243F;
A(D183-G184)+N195F+N445Q+K446N+V209I;
△(D183-G 184)+N 195F+E212R;
△(D183-G 184)+N 195F+M116R;
A(D183-G184)+N195F+K142H+D144H+R158H;
△(D183 -G184)+N 195F+K142H+D144H;
△(Dl 83-Gl 84)+Nl 95F+R158H;
△(Dl 83-Gl 84)+N195F+E345R;
△(D183-G 184)+Nl 95F+W189R;
A(Dl 83-Gl 84)+Nl 95F+Y298H;
A(D 183 -G184)+N 195F+N299A;
△(Dl 83-Gl 84)+N195F+K302R+S303Q;
△(D183 -G184)+N 195F+N3 06G;
A(D183-G184)+N195F+N125A; △(D183-G184)+N195F+N125R;
△(Dl 83-Gl 84)+N195F+Rl 81Q+N445Q+K446N+R31 OA;
△(Dl 83-Gl 84)+Nl 95F+R181Q+N445Q+K446N+R320K;
△(Dl 83-Gl 84)+N195F+Rl 81Q+N445Q+K446N+Q319K+R320D;
A(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N+N306A;
A(D 183-G 184)+N 195F+R181Q+N445Q+K446N+K3 02N;
△(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N+E345N;
△(Dl 83-Gl 84)+N195F+Rl 81Q+N445Q+K446N+Y298F;
△(D183-Gl 84)+Nl 95F+R181Q+N445Q+K446N+R28N;
A(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N+R28N+R310A;
A(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N+N128D+N306D;
A(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N+N128D;△(Dl 83-G184)+Nl 95F+R181Q+N445Q+K446N+N306D; N174D+N314D;
A(Dl 83-G84)+Nl 95F+N306D+R310H+E345D;
△(D183-G184)+Rl 81 Q+Nl 95F+W189R+S94K;
A(D 183-G184)+R 181 Q+Wl 89R+S94K;
△(D183-G 184)+N 195F+R181Q+S94K;
△(D183-G184)+N195F+R181K+N125R;
△(D183-G184)+N195F+R181K+N125K;
△(D183-G184)+Nl 95F+R118K+R320K+R458K;
△(D183-G 184)+Rl 81Q+N195F+R118K+R320K+R45 8K;
△(Dl 83-GI 84)+Nl 95F+RI81Q+N306G;
△(Dl 83-G184)+Nl 95F+R181 Q+Wl 89R;
△(D183-G 184)+Rl 81 Q+N 195F+R118K+N125K+R444K+N445K △(Dl 83-GI 84)+Rl 81 Q+Nl 95F+R118K+N125K+R320K+R458K;
△(D183-GI 84)+Rl 81 Q+Nl 95F+S94K+R118K+R320K+R458K; △(Dl 83-GI 84)+Rl 81Q+N195F+R118K+N306R+R320K+R458K; A(D 183-GI 84)+Nl 95F+R118K+R320K+R458K+R444K+N445K; △(D183-G184)+N195F+S94K+R118K+N306R+R320K+R458K;
考慮的變體包括在實施例中提到的具體變體和上述突變與一種或多種 如下突變/取代的進一步組合A(D183-G184); N195F; R181Q; G186R; M202L; V206F,L,M;N193S，T,P。
增加的溶解度
當把所有上述突變如下所述用於一組Termamyl樣oc-澱粉酶中的任何 一種a-澱粉酶，都會導致產生溶解度改變的Termamyl樣oc-澱粉酶變體。
所以，在優選實施方案中，本發明的變體是親代Termamyl樣a-澱粉酶 的變體，其與親代Termamyl樣cc-澱粉酶相比，溶解度已提高(如上定義)， 並包含選自下組的一個或多個位點的改變(用SEQ ID NO: 12進行胺基酸編 號)R28， R118， N174, R181, G182， D183, G184, G186, W189, N195， M202, Y298, N299， K302， S303， N306, R310, N314, R320， H324, E345, Y396, R400, W439， R444, N445, K446, Q449, R458, N471, N484,
其中
(a) 所述每一改變是
(i) 在佔據該位點的胺基酸下遊插入一個胺基酸，
(ii) 缺失佔據該位點的胺基酸，或
(iii) 用另一胺基酸取代佔據該位點的胺基酸，
(b) 變體有cc澱粉酶活性和
(c) 每一位點都對應於具有SEQIDNO: U所示AA560胺基酸序列的親 代Termamyl樣a -澱粉酶的胺基酸序列位點。
在優選實施方案中，本發明中溶解度增加的變體與親代a -澱粉酶相比 具有一種或多種如下取代
△G184; A(R181-G182); A(D183-G184); R28N,K; S94K; R118K; N125A,R, K; N174D; R181Q，E，K; G186R; W189R，K; N195F; M202L; Y298H,F; N299A; K302R; S303Q;難6GD，R，K; R310A,K，Q，E，H,D，N; N314D; R320K; H324K; E345R,D,K,N; Y396F; R400T,K; W439R; R444K; N445K,Q; K446N; Q449E; R458K;N471E;N484Q。
在更優選實施方案中，本發明溶解度增加的變體(由"材料與方法"部 分描述的方法之一確定)包括(以SEQIDNO: 12為基礎編號)
A(D183-G184)+R181Q;
A(D183-G184)+G186R;
A(D183-G184)+N195F;
A(D183-G184)+M202L;
△(Dl 83-G184)+Gl 86R+N195F;
A(D 183-G184)+N 195F+R400T;
A(D183-G184)+N195F+W439R;
A(D 183 -G184)+N 195F+Q449E;
△(D183-G184)+N 195F+N484Q;
A(D183-G184)+N195F+K446N;
△(D183-G184)+N 195F+N445Q+K446N+N484E;△(D183-G 184)+Nl 95F+N445Q+K446N+Q449E;
△(D183-Gl 84)+Nl 95F+N47 IE;
△(Dl 83-Gl 84)+N195F+H324K;
△(Dl 83-Gl 84)+N195F+Y396F;
A(D 183-G 184)+N 195F+K446D;
A(D183-G184)+N195F+R181Q;
A(D 183 -G184)+N 195F+R181E;
△(Dl 83-Gl 84)+Nl 95F+N445Q+K446N;
N445Q+K446N;
N445Q+K446N+N484E;
N445Q+K446N+Q449E;
△(D183-G 184)+N 195F+R181Q+N445Q+K446N;
△(D183-Gl 84)+Nl 95F+R181Q+K446N;
△(Dl 83-Gl 84)+Nl 95F+R181Q+N445Q+K446N+N484E;
△(D183-G184)+Nl 95F+R181E+N445Q+K446N;
A(D 183-G 184)+N 195F+R181E+K446N;
A(D 183-Gl 84)+Nl 95F+R181E+N445Q+K446N+N484E;
△(Dl 83-Gl 84)+Nl 95F+N445Q+K446N+Y243F;
A(D183-G184)+N195F+N445Q+K446N+V209I;
A(D 183 -G184)+N 195F+E212R;
A(D183陽G184)+N195F+M116R;
△(D183 -G184)+N 195F+K142H+D144H+R15 8H;
A(D 183 -G184)+N 195F+K142H+D144H;
A(D 183 -G184)+N 195F+R15 8H;
A(D183-G184)+N195F+E345R;
△(D183陽G 184)+N 195F+W1 ■;
△(D183-G 184)+Nl 95F+Y298H;
△(Dl 83-Gl 84)+N195F+N299A;
△(Dl 83-Gl 84)+N195F+K302R+S303Q;
△(D183-Gl 84)+N195F+N306G;
△(Dl 83-Gl 84)+N195F+Y298H+N299A+K302R+S303Q+N306G;A(D183-G184)+N195F+N125A; A(D183-Gl 84)+N195F+N125R;
△(Dl 83-Gl 84)+Nl 95F+R181Q+N445Q+K446N+R31 OA;
△(Dl 83-Gl 84)+Nl 95F+R181Q+N445Q+K446N+R310A+Q31 IN;
A(D 183-Gl 84)+Nl 95F+R181Q+N445Q+K446N+R320K;
△(Dl 83-Gl 84)+Nl 95F+R181Q+N445Q+K446N+Q319K+R320D;
△(Dl 83-Gl 84)+Nl 95F+R181Q+N445Q+K446N+N306A;
△(D183-G 184)+N 195F+R181Q+N445Q+K446N+K302N;
△(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N+E345N;
△(D183-Gl 84)+Nl 95F+R181Q+N445Q+K446N+Y298F;
A(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N+R28N;
△(Dl 83-Gl 84)+Nl 95F+R181Q+N445Q+K446N+R28N+R31 OA;
A(Dl 83-Gl 84)+N195F+Rl 81Q+N445Q+K446N+N128D+N306D;
A(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N+N128D;
A(D 183-Gl 84)+Nl 95F+R181Q+N445Q+K446N+N306D;
N174D+N314D;
△(Dl 83-Gl 84)+,5F+N306D+R310H+E345D;
A(D 183 -G184)+R 181Q+N195F+W189R+S94K;
A(Dl 83-Gl 84)+Rl 81 Q+Wl 89R+S94K;
△(D183-G 184)+N 195F+R181Q+S94K;
△(D183-G184)+N195F+R181K+N125R;
△(D183-G184)+N195F+R181K+N125K;
△(Dl 83-Gl 84)+Nl 95F+R118K+R320K+R458K;
△(Dl 83-Gl 84)+Rl 81Q+N195F+R118K+R320K+R458K;
A(D 183-G 184)+N 195F+R181Q+N3 06G;
△(D183-G 184)+Nl 95F+R181 Q+W 189R;
△(Dl 83-Gl 84)+Rl 81Q+N195F+R118K+N125K+R444K+N445K A(D 183 -G184)+R 181 Q+N 195F+R118K+N12 5K+R320K+R45 8K; △(Dl 83-Gl 84)+Rl 81 Q+Nl 95F+R118K+N125R+R320K+R458K; △(D183 -G184)+R 181 Q+N 195F+S94K+R118K+R320K+R45 8K; △(D183 -G184)+R 181 Q+N 195F+R118K+N3 06R+R320K+R45 8K;A(D183-G184)+N195F+S94K+R118K+N306R+R320K+R458K; 本發明的其它組合包括實施例中提到的具體組合和一種或多種如下取 代N195F; R181Q; G186R; M202L; V206F,L,M; N193P。 穩定性
在本發明的上下文中，那些獲得改變的穩定性，尤其是在特別高的pH 值(即pH 8-10.5)條件下，獲得改進的穩定性(提高或降低)的重要突變(包括氨 基酸取代和缺失)，包括"改變的特性"部分所列舉的任何一種突變。
Ca2+穩定性
改變的Ca"穩定性是指酶在Ca^損耗的條件下穩定性已得到改進，即， 提高或降低了穩定性。在本發明的上下文中，那些獲得改變的Ca^穩定性， 尤其是在特別高的pH值(即pH 8-10.5)條件下，獲得改進的Ca"穩定性(提 高或降低的穩定性)的重要突變(包括胺基酸取代和缺失)，包括"改變的特性 "部分所列舉的任何一種突變。
比活性
本發明另一方面，與獲得比活性改變，尤其在10-60°C溫度下，優選 20-50°C，尤其30-40°C溫度下增強或降低比活性的變體有關的重要突變(包 括胺基酸取代和缺失)，包括"改變的特性"部分所列舉的任何突變。
本發明變體的一般突變
那些能夠增加酶活性位點周圍流動性(mobility)的突變(包括胺基酸的取 代與缺失)是特別令人關注的。這可以通過破壞活性位點附近(即在優選距離 構成活性位點的任何胺基酸殘基IOA，或8A,或6A,或4A的範圍內)的穩 定作用而實現。
以下是降低側鏈大小的突變實例
Ala突變為Gly
Val突變為Ala或Gly
lie突變為Leu， Val， Ala或Gly
Thr突變為Ser
期望通過這些突變使活性位點區的柔性增加，這可用引入空腔或通過填 充突變留下的空間的結構重排來實現。本發明的變體優選除上述突變外還包含一種或多種修飾。因此，OC-澱 粉酶變體部分存在的一個或多個(幾個)脯氨酸殘基被非脯氨酸殘基取代可能 是有利的，所述非脯氨酸殘基可以是任何可能的天然產生的非脯氨酸殘基， 優選是丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸或亮氨酸。
同樣，親代OC -澱粉酶中 一個或多個(幾個)半胱氨酸殘基被非半胱氨酸殘 基，如，絲氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸或亮氨酸取代可能是優 選的。
此外，本發明的變體或者只經歷一種修飾，或者以任何上述修飾的組合
方式被修飾，以使對應於SEQ ID NO: 10的185-209位胺基酸的胺基酸片段 中存在的天冬氨酸和/或穀氨酸，各自被天冬醯胺和/或穀氨醯胺取代。 在這 些Termamyl樣oc -澱4分酶中，對應於SEQ ID NO: 10序歹'J 185-209位胺基酸 片段的胺基酸片段中存在的一個或多個(幾個)賴氨酸殘基被精氨酸取代，也 是人們所關注的。
可以理解，本發明包含引入二種或多種上述修飾的變體。
此外，在如下一個或多個位點引入突變可能是有利的(用SEQ ID NO: 10(TermamylTM)來編號)
M15， V128, Alll， H133, W138， T149， M197, N188， A209， A210, H405, T412,尤其是如下單個，雙重，三重或多重突變
M15X,特別是M15T,L;
V128X，特別是V128E;
H133X，特別是H133Y;
N188X,特別是N188S,T，P;
M197X,特別是M197T,L;
A209X,特別是A209V;
M197T/W138F; M197T/W138Y; M15窗133Y鹿88S;
M15/V12犯/H133Y/N188S; E119C/S130C; D124C/R127C; H133Y/T149I;
G475R， H133Y/S187D; H133Y/A209V;
在AA560中所述修飾對應於
L17X，特別是L17T;
E130Xj
Y135X;W140X,特別是W140F，Y; T193X;特別是S,P; M202X,特別是M202T，L; V214X;
涉及的突變組合包括
M202T/W140F; M202T/W140Y; L17T/T193S; L17窗193P; E121C/S132C; N126C/Q129C; T151I; G480R。
製備本發明oc-澱粉酶變體的方法
將突變引入基因的多種方法為本領域所知。在簡短討論如何克隆oc -澱粉 酶編碼DNA序列後，以下討論在oc-澱粉酶編碼序列的特定位點產生突變 的方法。
克隆編碼oc -澱粉酶的DNA序列
編碼親代oc-澱粉酶的DNA序列可以用本領域熟知的多種方法，從任何 產生所需ot-澱粉酶的細胞或微生物中分離出來。首先，從具有目的a-澱粉 酶的生物中獲得染色體DNA和/或信使RNA，建立基因組DNA和/或cDNA 文庫。然後，如果a-澱粉酶的胺基酸序列是已知的，可合成同源的經標記 的寡核苷酸探針，用於從所述生物中製備的基因組文庫中鑑定a -澱粉酶編 碼克隆。或者，包含已知oc-澱粉酶基因同源序列的標記寡核苷酸探針用作 探針，在較低嚴緊度的雜交和洗滌條件下，鑑定a-澱粉酶編碼克隆。
鑑定oc-澱粉酶編碼克隆的另一種方法是將基因組DNA插入到表達載 體，如質粒，用所得基因組DNA文庫轉化的a-澱粉酶陰性菌，然後，在 含有ct-澱粉酶底物的瓊脂培養基上塗板培養，以獲得能表達所要鑑定的ct-澱粉酶的克隆。
另外，編碼酶的DNA序列還可以用已建立的標準方法，例如，亞磷醯 胺'法(長口 S丄.Beaucage ,口 M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters 22, 1981， pp. 1859-1869所述)或Matthes等描述的方法(Matthes et al., The EMBO J. 3, 1984. pp. 801-805)得到。在亞磷醯胺法中，寡聚核苷酸是例如用DNA自動合成儀 合成的，對其進行純化，退火，連接，並克隆到合適的載體。
最後，DNA序列可以是採用標準技術製得的、基因組序列與合成的序列， 合成的序列與cDNA來源的序列，或基因組序列與cDNA來源的序列的混合(適當地，這些片段對應於整個DNA序列的各部分)。DNA序列還可以用特 定引物通過聚合酶鏈反應(PCR)得到，如US 4,683,202或R.K. Saiki et al., Science 239, 1988， pp. 487-491所述。
oc-澱粉酶變體的表達
根據本發明，可使用表達載體，以酶的形式表達通過上述方法，或通 過本領域已知的任何其它方法產生的編碼變體的DNA序列，所述表達載體 一般包括編碼啟動子，操縱子，核糖體結合位點，翻譯起始信號的控制序 列，並任選包括阻抑基因或多種激活基因。
攜有編碼本發明ot-澱粉酶變體的DNA序列的重組表達載體可以是能 對其方便地進行重組DNA操作的任何載體，載體的選擇經常取決於導入該 載體的宿主細胞。因此，載體可以是自我複製的載體，即作為染色體外實 體存在的載體，所述載體的複製獨立於染色體的複製，所述載體包括例如 質粒，噬菌體或染色體外元件，微型染色體或人工染色體。或者，載體可 以是當導入宿主細胞時可以整合至宿主細胞基因組，並與整合了該載體的 染色體一起複製的載體。
在載體中，DNA序列應該與適當的啟動子序列可操作相連。啟動子可 以是在選定宿主細胞中顯示出轉錄活性的任何DNA序列，啟動子可以得自 編碼與宿主細胞同源或異源之蛋白質的基因。介導編碼本發明a-澱粉酶變
體之DNA序列轉錄，尤其是在細菌宿主中的轉錄的適當啟動子的例子是 大腸桿菌/ac操縱子的啟動子，天藍色鏈黴菌瓊脂酶基因^gA啟動子，地 衣芽孢桿菌a-澱粉酶基因(a^y丄)啟動子，嗜熱脂肪芽孢桿菌產麥芽糖澱粉酶 基因Ow^W)啟動子，解澱粉芽孢桿菌a-澱粉酶(a/^0啟動子，枯草芽孢杆 菌xylA和xy舊基因的啟動子等。為了在真菌宿主中轉錄，有用的啟動子的 例子是得自編碼下列酶的基因的啟動子米麴黴TAKA澱粉酶，米赫根毛 黴(i /z&owwcor m/e/^')天冬氨酸蛋白酶，黑麴黴中性a-澱粉酶，黑麴黴酸穩 定的a-澱粉酶，黑麴黴葡糖澱粉酶，米赫根毛黴脂肪酶，米麴黴鹼性蛋白 酶，米麴黴丙糖磷酸異構酶或構巢麴黴乙醯胺酶。
本發明的表達載體還含有適當的轉錄終止子，在真核生物中，還含有 與編碼本發明a-澱粉酶變體的DNA序列可操作相連的聚-腺苦酸化序列。終 止和聚腺苦酸化序列可適當地得自與啟動子相同的來源。載體可進一步含有能使載體在所述宿主細胞中複製的DNA序列。所述 序列的例子是質粒pUC19， pACYC177, pUB110, pE194， pAMBl和pIJ702的
複製起點。
載體也可含有選擇標記，例如其產物可以補償宿主細胞缺陷的基因， 如枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的^ /基因，或能賦予抗生素抗性的基因，
所述抗生素抗性如氨節青黴素，卡那黴素，氯黴素或四環素抗性。另外， 載體可含有麴黴屬選擇標記，如amdS，argB,niaD和sC,產生潮黴素抗性的 標記，或者可通過WO 91/17243中所述的共-轉化來完成選擇。
儘管細胞內表達在某些方面(例如當使用某些細菌作為宿主細胞時)有 利，但一般優選在細胞外進行表達。通常，本文所述的芽孢桿菌a-澱粉酶 含有允許表達的蛋白酶分泌至培養基的前區(preregion)。必要時，該前區可 被不同的前區或信號序列取代，通過取代編碼各個前區的DNA序列可以方 便地實現此目的。
分別連接編碼a-澱粉酶變體的本發明DNA構建體，啟動子，終止子和 其它元件，並將它們插入含有複製所需信息的適當載體的方法是本領域技 術人員眾所周知的(參見例如Sambrook等，分子克隆實驗室手冊，第2版， 冷泉港，1989)。
含有上文所定義的本發明DNA構建體或表達載體的本發明細胞可以 有利地用作宿主細胞，以重組產生本發明的a-澱粉酶變體。可以方便地通 過將編碼變體的本發明DNA構建體(一個或多個拷貝)整合至宿主染色體， 用所述DNA構建體轉化細胞。 一般認為整合是有利的，因為整合後DNA 序列可以在細胞中更加穩定地維持。根據常規方法，例如通過同源或異源 重組可以將DNA構建體整合至宿主染色體。或者，可用與不同類型的宿主 細胞有關的上述表達載體轉化細胞。
本發明的細胞可以是高等生物，如哺乳動物或昆蟲的細胞，但優選其 為微生物細胞，例如細菌或真菌(包括酵母)細胞。
適合的細菌為革蘭氏陽性菌，如枯草芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，遲緩 芽孢桿菌，短芽孢桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌，嗜鹼芽孢桿菌(及a汰a/o/ Mw", 解澱粉芽孢桿菌，凝結芽孢桿菌，環狀芽孢桿菌，燦爛芽孢桿菌，巨大芽 孢桿菌，蘇雲金芽孢桿菌，淺青紫鏈黴菌或鼠灰鏈黴菌，或革蘭氏陰性菌如大腸桿菌。細菌的轉化可以通過，例如原生質轉化或通過已知的方式用 感受態細胞實現。
酵母生物可優選糖酵母屬或裂殖酵母屬，例如釀酒酵母。絲狀真菌優 選屬於麴黴屬，例如，米麴黴或黑麴黴。真菌細胞可用一種方法轉化，該 方法涉及原生質形成、原生質轉化、然後細胞壁以其本身已知的方式再生。
麴黴屬宿主細胞轉化的適合方法如EP 238 023所述。
在另一方面，本發明涉及生產本發明ot-澱粉酶變體的方法，該方法包 含在有利於變體生產的條件下培養如上所述宿主細胞以及從細胞和/或培養 液中回收變體。
用於培養細胞的培養基可以是適於培養所述宿主細胞，並表達本發明 ot-澱粉酶變體的任何常規培養基。適當的培養基可以商購，或者可根據公 開的配方(例如美國典型培養物保藏中心目錄中所述的配方)生產。
通過眾所周知的方法，包括通過離心或過濾將培養基與細胞分開，利 用鹽如硫酸銨沉澱培養基中的蛋白質成分，接著利用層析法，如離子交換 層析，親和層析等，從培養基中方便地回收宿主細胞分泌的a-澱粉酶變體。
工業化應用
本發明的cc澱粉酶變體有許多在工業應用中有價值的特性。具體地，本 發明的酶變體可以作為洗滌，清洗餐具，洗滌硬表面的洗滌劑組合物的成分。 本發明的具有改變的特性的變體還可用於澱粉加工，特別是澱粉轉化，特別 是澱粉的液化等過程(參見，例如US 3,912,590, EP專利
發明者卡斯滕·安德森, 託本·V·博徹特, 比賈尼·R·尼爾森 申請人:諾維信公司