一種凍存口腔幹細胞可用性篩檢的方法與流程
2023-08-06 13:26:31
本發明涉及幹細胞技術領域，尤其是涉及一種可有效提升幹細胞健康使用概率的凍存口腔幹細胞可用性篩檢的方法。
背景技術：
幹細胞是一類具有自我複製能力的多潛能細胞，具有增殖和分化潛能、以及自我更新複製的能力，能夠產生高度分化的功能細胞。近年來，幹細胞在美容整形、器官移植、疾病治療、生物修復等領域開始得到快速應用和發展。口腔幹細胞是繼造血幹細胞、臍帶幹細胞、脂肪幹細胞之後有一個功能強大、應用領域廣泛的幹細胞類型。
為了進一步提高口腔幹細胞的應用安全及潛能發揮等性能，本案發明人提出了一種凍存口腔幹細胞可用性篩檢的方法，以便將幹細胞在凍存解凍復甦後所存在的基因先天缺陷、染色體損傷等缺陷及時篩檢出來，進而確保幹細胞在使用過程中的潛能健康發揮。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種凍存口腔幹細胞可用性篩檢的方法，為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：
一種凍存口腔幹細胞可用性篩檢的方法，其特徵在於，該方法包括以下步驟：
步驟s001、操作人員將手洗淨並用消毒水消毒，或者戴上消毒處理後的手套；
步驟s002、自液氮或乾冰容器中取出潔淨的培養容器，並將由幹細胞無血清基礎培養基、小分子肽、及螺旋藻混合所組成的新鮮培養基倒入該培養容器內；
步驟s003、將裝有上述步驟s002中所述新鮮培養基的所述培養容器快速置於37℃恆溫水槽中進行回溫；
步驟s004、將上述步驟s003中回溫後的所述培養容器用酒精含量達65％以上的酒精棉擦拭，擦拭後移入無菌操作臺內待用；
步驟s005、將凍存有口腔幹細胞的冷凍保存管取出，並立即放入37℃恆溫水槽中快速解凍，且輕搖所述冷凍保存管使其內部的幹細胞在1分鐘內全部融化；
步驟s006、將經上述步驟s005中解凍後的幹細胞懸浮液加入含有上述步驟s002中所述新鮮培養基的離心管內，以1000rpm的轉速離心不低於3 分鐘，然後去除以dmso或glycerol冷凍保護劑為主要成份的上清液；
步驟s007、將經上述步驟s006離心去除冷凍保護劑後的幹細胞液緩緩加入經上述步驟s004處理後的所述培養容器內，並將幹細胞液與所述新鮮培養基按照1:5～1:10的稀釋比進行均勻混合；
步驟s008、將上述步驟s007中裝有稀釋混合後幹細胞液的所述培養容器放入培養箱中，對幹細胞進行10小時以上的恢復性培養孵育；
步驟s009、用潔淨試管取出經過上述步驟s008培養孵育後的幹細胞10μl，並將10μl臺盼藍活性染料緩緩加入所述潔淨試管內與10μl幹細胞形成等比混合，輕輕搖晃所述潔淨試管使混合充分；
步驟s010、將上述步驟s009中幹細胞與臺盼藍活性染料的混合溶液緩緩倒入潔淨的血球計數盤，蓋上玻片，用100倍顯微鏡觀察幹細胞存活情況，沒有被臺盼藍活性染料染色的幹細胞為活細胞，被臺盼藍活性染料染成藍色或紅色的幹細胞為死細胞；
步驟s011、藉助上述步驟s010中的顯微鏡，用吸附器具將上述步驟s010中所發現的死細胞吸出，實現初步篩選；
步驟s012、利用染色質免疫共沉澱基因測序分析技術，對經過上述步驟s011初步篩選後的活幹細胞，進行pgs與pgd全基因篩查診斷，以篩檢幹細胞的健康程度進而判斷可用性。
其中，
所述步驟s002中的所述小分子肽是由2～4個胺基酸所組成的活性小分子肽；
所述新鮮培養基中幹細胞無血清基礎培養基、小分子肽、以及螺旋藻三者的組份比為9:0.35:0.65。
所述步驟s012還包括以下分步驟：
分步驟s01：利用植入前遺傳學篩查pgs對幹細胞的染色體數目和染色體結構進行檢測，通過所述步驟s012中的染色質免疫共沉澱基因測序分析技術，分析檢測幹細胞的染色體是否存在數目和結構上的缺陷、以及是否存在遺傳物質現象；
分步驟s02：利用植入前基因診斷pgd對幹細胞中是否攜帶病變基因和遺傳缺陷基因進行檢測，通過所述步驟s012中的染色質免疫共沉澱基因測序分析技術，分析檢測幹細胞的基因病變機率。
本發明的有益效果是，通過將解凍後的幹細胞放入帶有小分子肽成份的新鮮培養基中進行恢復性培養孵育，極大限度上提高了幹細胞的復甦率；然後通過臺盼藍活性染料將一部分已經死亡的幹細胞進行初步篩選；最好再利用染色質免疫共沉澱基因測序分析技術，對幹細胞進行pgs與pgd全基因篩查診斷，以得到幹細胞的健康程度進而判斷其可用性。
附圖說明
圖1是本發明實施例中方法實現流程示意圖。
具體實施方式
下面將結合本發明實施例，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明保護的範圍。
實施例，參照圖1所示，本發明所提供的一種凍存口腔幹細胞可用性篩檢的方法，將通過以下步驟來實現：
步驟s001、操作準備
操作人員將手洗淨並用消毒水消毒，或者戴上消毒處理後的手套；
步驟s002、培養基形成
自液氮或乾冰容器中取出潔淨的培養容器，並將由幹細胞無血清基礎培養基、小分子肽、及螺旋藻混合所組成的新鮮培養基倒入該培養容器內。該步驟內，所述小分子肽是由2～4個胺基酸所組成的活性小分子肽；在所述新鮮培養基中幹細胞無血清基礎培養基、小分子肽、以及螺旋藻三者的組份比 為9:0.35:0.65。利用小分子肽的修復特性將會對凍存後的幹細胞起到良好的修復、激活、補充養分等作用；
步驟s003、培養容器回溫
將裝有新鮮培養基的所述培養容器快速置於37℃恆溫水槽中進行回溫，或者放入一種恆溫裝置中，以確保所述培養容器內的新鮮培養基的溫度能夠滿足幹細胞所需要的正常溫度值；
步驟s004、培養容器消毒
將上述步驟s003中回溫後的所述培養容器用酒精含量達65％以上的酒精棉擦拭，擦拭後移入無菌操作臺內待用，以杜絕細菌等汙染；
步驟s005、幹細胞解凍
將凍存有口腔幹細胞的冷凍保存管取出，並立即放入37℃恆溫水槽、或者放入一種恆溫裝置中，以便實現對凍存幹細胞的快速解凍，且輕搖所述冷凍保存管使其內部的幹細胞在1分鐘內全部融化；
步驟s006、離心去冷凍保護劑
將經上述步驟s005中解凍後的幹細胞懸浮液加入含有上述步驟s002中所述新鮮培養基的離心管內，以1000rpm的轉速離心不低於3分鐘，然後去除以dmso(二甲基亞碸)或glycerol(甘油；丙三醇)冷凍保護劑為主要成份的上清液；
步驟s007、幹細胞與培養基按比混合
將經上述步驟s006離心去除冷凍保護劑後的幹細胞液緩緩加入經上述步驟s004處理後的所述培養容器內，並按照1:5～1:10的稀釋比進行均勻混合；
步驟s008、幹細胞恢復性培養孵育
將上述步驟s007中裝有稀釋混合後幹細胞液的所述培養容器放入培養箱中，對幹細胞進行10小時以上的恢復性培養孵育，通過觀察來決定幹細胞恢復性培養孵育的具體時間；
步驟s009、加入臺盼藍活性染料
用潔淨試管取出經過上述步驟s008培養孵育後的幹細胞10μl，並將10μl臺盼藍活性染料緩緩加入所述潔淨試管內與10μl幹細胞形成等比混合，輕輕搖晃所述潔淨試管使混合充分；
步驟s010、觀察幹細胞存活情況
將上述步驟s009中幹細胞與臺盼藍活性染料的混合溶液緩緩倒入潔淨的血球計數盤，蓋上玻片，用100倍顯微鏡觀察幹細胞存活情況，沒有被臺盼藍活性染料染色的幹細胞為活細胞，被臺盼藍活性染料染成藍色或紅色的幹細胞為死細胞；
步驟s011、幹細胞初步篩選
藉助上述步驟s010中的顯微鏡，用吸附器具將上述步驟s010中所發現的死細胞吸出，實現初步篩選；
步驟s012、幹細胞全基因篩查
利用染色質免疫共沉澱基因測序分析技術(又稱chip-seq基因測序技術)，對經過上述步驟s011初步篩選後的活幹細胞，進行pgs(又稱植入前遺傳學篩查)與pgd(又稱植入前基因診斷)全基因篩查診斷，以篩檢幹細胞的健康程度進而判斷可用性。
其中，
所述步驟s012還包括以下分步驟：
分步驟s01：利用pgs對幹細胞的染色體數目和染色體結構進行檢測，通過所述步驟s012中的染色質免疫共沉澱基因測序分析技術，分析檢測幹細胞的基因是否存在缺陷、及存在遺傳物質現象；
分步驟s02：利用pgd對幹細胞中是否攜帶病變基因和遺傳缺陷基因進行檢測，通過所述步驟s012中的染色質免疫共沉澱基因測序分析技術，分析檢測幹細胞的基因病變機率。
本發明通過將解凍後的幹細胞放入帶有小分子肽成份的新鮮培養基中進行恢復性培養孵育，極大限度上提高了幹細胞的復甦率；然後通過臺盼藍活性染料將一部分已經死亡的幹細胞進行初步篩選；最好再利用染色質免疫共 沉澱基因測序分析技術，對幹細胞進行pgs與pgd全基因篩查診斷，以得到幹細胞的健康程度進而判斷其可用性。
對於本領域技術人員而言，顯然本發明不限於上述示範性實施例的細節，而且在不背離本發明的精神或基本特徵的情況下，能夠以其他的具體形式實現本發明。因此，無論從哪一點來看，均應將實施例看作是示範性的，而且是非限制性的，本發明的範圍由所附權利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權利要求的等同要件的含義和範圍內的所有變化囊括在本發明內。
此外，應當理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但並非每個實施方式僅包含一個獨立的技術方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領域技術人員應當將說明書作為一個整體，各實施例中的技術方案也可以經適當組合，形成本領域技術人員可以理解的其他實施方式。