具有免疫球蛋白結合能力的肽的製作方法

2023-08-06 11:03:41

專利名稱：具有免疫球蛋白結合能力的肽的製作方法
技術領域：
本發明涉及具有免疫球蛋白結合能力的肽以及含有所述肽的融合蛋白。本發明還涉及含有具免疫球蛋白結合能力的肽或者與所述肽的融合蛋白、由於Clq與免疫球蛋白的結合而引發的疾病的治療或預防用藥物組合物等。
背景技術：
已知Clq是補體蛋白的一種，在補體激活途徑中發揮作用。例如，據信經典途徑的激活是Clq與免疫球蛋白分子的Fe部分結合而引起的。Clq與免疫球蛋白的結合所引發的疾病有很多種，典型的例子可舉出系統性紅斑狼瘡(SLE)、腎小球腎炎、血管炎、關節炎等免疫複合物病或風溼。有報導指出:類風溼性關節炎(RA)患者的血液中存在很多Clq，未來會導致關節破壞(非專利文獻I)。可認為這樣的病態中有上述的Clq所致激活的參與，人們希望開發Clq與免疫球蛋白分子結合的抑制劑。目前，類風溼性關節炎的治療藥物大多使用氨甲蝶呤和來氟米特(Ieflumide)，但這些藥物具有副作用，無法大量給予。現有技術文獻 非專利文獻非專利文獻 1:0chi T 等人.，Arthritis.1988 Jan; 31 (1): 37-43。

發明內容
發明所解決的課題
本發明解決的課題在於提供具有免疫球蛋白結合能力的肽以及含有所述肽的融合蛋白；含有具免疫球蛋白結合能力的肽或者與所述肽的融合蛋白，且用於治療或預防由於Clq與免疫球蛋白的結合而弓I發的疾病的，有效、安全的藥物組合物等。解決課題的手段
本發明人發現:具有來自Clq的胺基酸序列的肽在類風溼性關節炎等的由於Clq與免疫球蛋白的結合引發的疾病中顯示治療和預防效果(參照國際公開第2009/025300號小冊子以及國際公開第2010/084851號小冊子)，進一步為了提高肽的水溶性而進行了深入的研究，結果發現:通過置換上述肽中特定位置的胺基酸，肽的水溶性得到改善，並且免疫球蛋白結合能力等生物學活性不會顯著降低，從而完成了本發明。S卩，本發明提供以下內容:
(1)肽，該肽為具有免疫球蛋白結合能力的肽，具有以下所示的胺基酸序列: Pro-Gly-Leu-X4-X5-Phe(I)
(這裡，X4和X5是不同時為Tyr的胺基酸);
(2)(I)的肽，其中，X4和X5的一方或兩者為親水性胺基酸；
(3)(I)的肽，其中，X4和X5兩者為親水性胺基酸；(4)(3)的肽,其中，X4 和 X5 獨立地為選自 Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gin、Ser 和 Thr
的胺基酸；
(5)(I)的肽，該肽具有SEQ ID NO: 9-15中任一個的胺基酸序列；
(6)(I)的肽，該肽具有SEQ ID NO: 12的胺基酸序列；
(7)(1)-(6)中任一項的肽，其中，式(I)的胺基酸序列中的I個或多個胺基酸(Gly除外)被對應的D-胺基酸置換；
(8)(1)-(6)中任一項的肽，其中，式(I)的胺基酸序列中的全部胺基酸(Gly除外)被對應的D-胺基酸置換；
(9)(8)的肽,該肽具有以下胺基酸序列:D-Pro-Gly-D-Leu-D-Glu-D-Lys-D-Phe ；
(10)核酸，該核酸為編碼具有免疫球蛋白結合能力的肽的核酸，編碼(1)-(6)中任一項的肽；
(11)(10)的核酸，該核酸編碼(5)的肽；
(12)(10)的核酸，該核酸編碼(6)的肽；
(13)載體，該載體含有(10)-(12)中任一項的核酸；
(14)融合蛋白，該融 合蛋白是(1)-(6)中任一項的肽附加於目標蛋白質的N末端和/或C末端而成；
(15)融合蛋白，該融合蛋白是(7)-(9)中任一項的肽附加於目標蛋白質的N末端和/或C末端而成；
(16)核酸，該核酸編碼(14)的融合蛋白；
(17)載體，該載體含有(16)的核酸；
(18)細胞，該細胞含有(10)-(12)中任一項的核酸、(16)的核酸、或者(13)或(17)的載體；
(19)具有免疫球蛋白結合能力的肽的製造方法，該方法包括:
(a)使用(13)的載體轉化細胞的步驟，和
(b)培養該細胞以生產肽的步驟；
(20)肽，該肽可通過(19)的方法獲得，具有免疫球蛋白結合能力；
(21)融合蛋白的製造方法，該融合蛋白是具有免疫球蛋白結合能力的肽附加於目標蛋白質的N末端和/或C末端而成，該製造方法包括:
(a)使用(17)的載體轉化細胞的步驟，和
(b)培養該細胞以生產融合蛋白的步驟；
(22)(21)的方法，該方法進一步包括從融合蛋白中取出目標蛋白質的步驟；
(23)融合蛋白，該融合蛋白可通過(21)或(22)的方法獲得；
(24)組合物，該組合物含有(1)-(9)中任一項的肽、或者(14)或(15)的融合蛋白，用於使免疫球蛋白結合；
(25)(24)的組合物，該組合物是用於確定免疫球蛋白的存在或量，或者用於分離免疫球蛋白；
(26)用於使免疫球蛋白結合的裝置，該裝置是將(1)-(9)中任一項的肽、或者(14)或
(15)的融合蛋白固定；
(27)(26)的裝置，該裝置是用於確定免疫球蛋白的存在或量，或者用於分離免疫球蛋白；
(28)使免疫球蛋白結合的方法，該方法包括:
(a)將(1)-(9)中任一項的肽、或者(14)或(15)的融合蛋白添加到試樣中的步驟，以
及
(b)調查肽或融合蛋白與免疫球蛋白的結合物的步驟；
(29)試劑盒，該試劑盒用於(28)的方法，含有(1)-(9)中任一項的肽或者(14)或(15)的融合蛋白；
(30)標記的(1)-(9)中任一項的肽或者(14)或(15)的融合蛋白；
(31)試樣中的抗體的檢測方法，其特徵在於:使(30)中的標記的肽或融合蛋白與試樣中的抗體反應，接著 ，檢測與抗體結合的該肽或融合蛋白；
(32)由於Clq與免疫球蛋白的結合而引發的疾病的治療或預防用藥物組合物，該藥物組合物含有(1)-(9)中任一項的肽、(14)或(15)的融合蛋白、(10)-(12)中任一項的核酸、
(16)的核酸、或者(13)或(17)的載體作為有效成分；
(33)(32)的藥物組合物，其中，疾病為類風溼性關節炎；
(34)(32)的藥物組合物，其中，疾病為系統性紅斑狼瘡(SLE)、腎小球腎炎、血管炎、關節炎等的免疫複合物病。發明效果
根據本發明，可提供具有免疫球蛋白結合能力的肽、以及含有所述肽的融合蛋白、在由於Clq與免疫球蛋白的結合而引發的疾病的治療或預防中更為有用的藥物組合物等。另夕卜，通過將水溶性得到改善的本發明的肽用於上述藥物組合物，可以提供與以往相比實質給予量提高的藥物組合物。附圖簡述


圖1表示肽Rl和4-6抑制Clq與免疫球蛋白結合。圖中，NC是將不含有肽的DMSO添加到不含有鹼性磷酸酶(ALP)標記人免疫球蛋白(IgG)的反應液中的樣品的結果，PC是將不含有肽的DMSO添加到含有鹼性磷酸酶(ALP)標記人免疫球蛋白(IgG)的反應液中的樣品白勺結果。圖2表示肽SP1-7抑制Clq與免疫球蛋白的結合。圖中，NC是將不含有肽的DMSO添加到不含有鹼性磷酸酶(ALP)標記人免疫球蛋白(IgG)的反應液中的樣品的結果，PC是將不含有肽的DMSO添加到含有鹼性磷酸酶(ALP)標記免疫球蛋白(IgG)的反應液中的樣品白勺結果。圖3表示本發明的肽的添加分別抑制了用TNF- α刺激自人RA患者採集的滑膜細胞而誘導的IL-1 β > TNF- α、ΜΜΡ_1和ΜΜΡ-3的生產。圖中，對照表示未添加肽的樣品的結果，SP3-100、SP3-10和SP3-1表示分別添加100 μ g、10 μ g和I μ g SP3的肽的樣品的結果，SP4-100、SP4-10和SP4-1表示分別添加100 μ g、10 μ g和I μ g SP4的肽的樣品的結果。圖4是通過臨床評分表示受驗物質a對於使用單克隆抗體雞尾酒(cocktail)誘發關節炎小鼠的關節炎抑制作用的圖表。〇表示對照組， 表示受驗物質a 10mg/kg給予組，■表示氨甲蝶呤0.15mg/kg給予組。圖5是通過臨床評分表示受驗物質α對於使用單克隆抗體雞尾酒誘發關節炎小鼠的關節炎抑制作用的圖表。〇表示對照組， 表示受驗物質a 10mg/kg給予組，■表示氨甲蝶呤0.15mg/kg給予組。圖6是通過臨床評分表示受驗物質VI1-1對於使用單克隆抗體雞尾酒誘發關節炎小鼠的關節炎抑制作用的圖表。〇表示對照組， 表示受驗物質VI1-1 10mg/kg給予組，Λ表示受驗物質VI1-1 100mg/kg給予組，■表示氨甲蝶呤0.15mg/kg給予組。圖7是通過臨床評分表示受驗物質VI1-2對於使用單克隆抗體雞尾酒誘發關節炎小鼠的關節炎抑制作用的圖表。〇表示對照組， 表示受驗物質VI1-2 10mg/kg給予組，Λ表示受驗物質VI1-2 100mg/kg給予組，■表示氨甲蝶呤0.15mg/kg給予組。圖8是通過後肢容積表示受驗物質a對於使用單克隆抗體雞尾酒誘發關節炎小鼠的關節炎抑制作用的圖表。〇表示對照組， 表示受驗物質a 10mg/kg給予組，■表示氨甲蝶呤0.15mg/kg給予組。圖9是通過後肢容積表示受驗物質α對於使用單克隆抗體雞尾酒誘發關節炎小鼠的關節炎抑制作用的圖表。〇表示對照組， 表示受驗物質a 10mg/kg給予組，■表示氨甲蝶呤0.15mg/kg給予組。圖10是通過後肢容積表示受驗物質VI1-1對於使用單克隆抗體雞尾酒誘發關節炎小鼠的關節炎抑制作用的圖表。〇表示對照組， 表示受驗物質VI1-1 10mg/kg給予組，Λ表示受驗物質VI1-1 100mg/kg給予組，■表示氨甲蝶呤0.15mg/kg給予組。圖11是通過後肢容積表示受驗物質VI1-2對於使用單克隆抗體雞尾酒誘發關節炎小鼠的關節炎抑制作用的圖表。〇表示對照組， 表示受驗物質VI1-2 10mg/kg給予組，Λ表示受驗物質VI1-2 100mg/kg給予組，■表示氨甲蝶呤0.15mg/kg給予組。圖12是通過後 肢容積增加率表示受驗物質a對於使用單克隆抗體雞尾酒誘發關節炎小鼠的關節炎抑制作用的圖表。〇表示對照組， 表示受驗物質a 10mg/kg給予組，.表示氨甲蝶呤0.15mg/kg給予組。圖13是通過後肢容積增加率表示受驗物質α對於使用單克隆抗體雞尾酒誘發關節炎小鼠的關節炎抑制作用的圖表。〇表示對照組， 表示受驗物質a 10mg/kg給予組，■表示氨甲蝶呤0.15mg/kg給予組。圖14是通過後肢容積增加率表示受驗物質VI1-1對於使用單克隆抗體雞尾酒誘發關節炎小鼠的關節炎抑制作用的圖表。O表示對照組，籲表示受驗物質VI1-1 10mg/kg給予組，Λ表示受驗物質VI1-1 100mg/kg給予組，■表示氨甲蝶呤0.15mg/kg給予組。圖15是通過後肢容積增加率表示受驗物質VI1-2對於使用單克隆抗體雞尾酒誘發關節炎小鼠的關節炎抑制作用的圖表。O表示對照組，籲表示受驗物質VI1-2 10mg/kg給予組，Λ表示受驗物質VI1-2 100mg/kg給予組，■表示氨甲蝶呤0.15mg/kg給予組。圖16a是表示阿瑟氏反應(Arthus reaction)中，受驗物質VI1-2腹腔內給予的效果的圖表。圖16b是表示阿瑟氏反應中，受驗物質VI1-2的尾靜脈內給予的效果的圖表。圖17是表示滑膜細胞與B細胞共存的類風溼性關節炎模型系統中，受驗物質VI1-2抑制IgG產生的效果的圖表。實施發明的方案
本發明的一個方案中，涉及具有與具 Pro-Gly-Leu-Tyr-Tyr-Phe (a)
所示的胺基酸序列(SEQ ID NO:1)的肽大致同等或更高的免疫球蛋白結合能力等的生物學活性、且水溶性得到改善的肽。本發明的肽的生物學活性可通過該技術領域中公知的方法進行調查。例如可將肽在免疫球蛋白存在下溫育，調查結合量。本發明的肽涉及具有在SEQ ID NO:1的胺基酸序列(a)中，I個或多個(例如2、3、4或5個)胺基酸被置換了的胺基酸序列的肽。本發明的肽中，被置換的胺基酸可以是任何胺基酸，優選為自上述胺基酸序列(a)的N末端起第4個和/或第5個胺基酸，進一步優選為自上述序列(a)的N末端起第4個和第5個兩者的胺基酸。本說明書中，不是用名稱表示、而是用3字母符號或單字母符號來表示胺基酸，3字母符號或單字母符號為本領域技術人員所熟知。對於本發明的肽，只要是具有免疫球蛋白結合能力，且顯示良好的水溶性，上述胺基酸序列(a)的任何的胺基酸就可被其它胺基酸置換，例如，可被甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、穀氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、賴氨酸、精氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、組氨酸或脯氨酸等構成天然蛋白質的胺基酸，或者丙氨酸、Y-氨基丁酸(GABA)、5_氨基酮戊酸、5-氨基戊酸、高半胱氨酸、鳥氨酸、5-羥基色氨酸、3，4- 二羥基苯丙氨酸(多巴)、三碘甲腺原氨酸、甲狀腺素、高賴氨酸、正亮氨酸、肌酸、鎖鏈素、正纈氨酸、碘化酪氨酸等非構成天然蛋白質的胺基酸置換。通過在上述胺基酸序列(a)中，將I個或多個胺基酸置換為親水性胺基酸，或者是置換為可提高肽的水溶性的胺基酸衍生物或修飾物等，可以改善具有該胺基酸序列的肽的水溶性。因此，本發明的優選方案中，式(a)的胺基酸序列中的胺基酸被親水性胺基酸、或者可提高肽的水溶性的胺基酸衍生物或修飾物等置換。親水性胺基酸的例子可舉出:絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、天冬氨酸(Asp)、穀氨酸(Glu)、天冬醯胺(Asn)、穀氨醯胺(Gin)、賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)或組氨酸(His)，但並不限於這些胺基酸。 通常在肽藥物中，考慮到在消化道中的易分解性，大多採用靜脈注射或皮下注射的給予方法。因此，水溶性低的肽難以臨床應用。但是，即使選擇口服給予也存在肽容易被分解的問題。本發明的改善了水溶性的肽消除了上述缺陷，在靜脈注射或皮下注射時發揮優異的效果。並且本發明的改善了水溶性的肽具有容易作為原材料應用的優點。在優選的方案中，本發明涉及具有 Pro-Gly-Leu-X4-X5-Phe(I)
(這裡，X4和X5是不同時為Tyr的胺基酸)
所示的胺基酸序列的肽。即，本發明的肽具有以下的胺基酸序列:上述胺基酸序列(I)中的胺基酸殘基X4、X5其中的一方或兩者為Tyr以外的胺基酸殘基。優選本發明的肽具有以下的胺基酸序列:上述胺基酸序列(I)中的胺基酸殘基X4、X5兩者為Tyr以外的胺基酸殘基。Tyr以外的胺基酸X4、X5可以列舉上述列舉的胺基酸，優選為親水性胺基酸，進一步優選為絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、天冬氨酸(Asp)、穀氨酸(Glu)、天冬醯胺(Asn)、穀氨醯胺(Gin)、賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)或組氨酸(His)等的親水性胺基酸。作為Tyr以外所優選的胺基酸X4、X5，也可以是可提高肽的水溶性的胺基酸衍生物或修飾物。X4、X5可以是相同種類的胺基酸，也可是互相不同種類的胺基酸。即使具有任一種的胺基酸序列，本發明的肽也具有免疫球蛋白結合能力，並且具有比具SEQ ID NO:1的胺基酸序列(a)的肽更高的水溶性。
優選的本發明的肽可例舉具有SEQ ID NO: 9_15中任一項的胺基酸序列的肽。這些肽也具有免疫球蛋白結合能力。並且本發明的肽還可以是具有下述胺基酸序列的肽:胺基酸序列(I)中的I個或多個(例如2、3、4、5或6個)胺基酸被對應的D-胺基酸置換而成的胺基酸序列。本發明的優選方案中，式(I)的胺基酸序列中的全部胺基酸可被對應D-胺基酸置換。具有任一種胺基酸序列時，本發明的肽也具有免疫球蛋白結合能力。通過將式⑴的胺基酸序列中的胺基酸置換為對應的D-胺基酸，則本發明的肽難以受到蛋白質分解，在所給予的對象體內具有高穩定性和長半壽期。本發明的肽可以由上述胺基酸序列⑴組成，或者含有上述胺基酸序列⑴作為核心序列、且在所述胺基酸序列的N末端和/或者C末端、或者在所述胺基酸序列的任意胺基酸殘基上結合有肽或胺基酸、它們的類似物、聚乙二醇、糖、多糖、核苷酸等各種物質(並不限於這些)。還可以是在N/C末端或任意的胺基酸殘基上，經由胺基酸或肽、或者使用可利用的官能基團，在胺基酸序列的內部結合螢光標記、生物素、鏈黴親和素、地高辛(DIG)、磁珠、膠乳珠、膠體金等物質(但並不限於這些)。例如，本發明的肽與另外的肽結合時，所述肽可以由I個-50個、例如1-20個、1-15個或1-9個胺基酸組成(上述胺基酸的個數只是例舉，並不是限定)。另外，所述肽還可以是具有組氨酸標籤、GST標籤、S標籤、Myc標籤、HA標籤或E標籤的功能(但並不限於它們)的肽。本發明的肽除上述肽之外，還包含具有在上述肽的胺基酸序列中，I個或多個、例如2、3、4或5個胺基酸缺失、置換或添加得到的胺基酸序列的肽；以及具有與上述肽的胺基酸序列具50%以上、優選60%以上、進一步優選70%以上、更優選80%以上、更進一步優選90%以上(例如95、97、98或99%以上)的同源性的胺基酸序列的肽。胺基酸序列的同源性例如可使用FASTA、BLAST、DNASIS(日立乂 7卜々工7工 > 夕二 7丨」> 夕'' (株)製造)、GENETYX((株)7工彳、f 7製造)進行測定。或者為短鏈肽時，也可以單純地將序列進行比較後計算。並且這些胺基酸中任一個可以被適當的修飾。具有任一種的胺基酸序列時，本發明的肽仍具有免疫球蛋白結合能力，比具有SEQ ID NO:1的胺基酸序列(a)的肽具有更高的水溶性。本發明的肽可通過本領域技術人員已知的各種方法製造和取得。例如可以按照肽固相合成法等化學合成本發明的肽，也可以根據編碼本發明的肽的核苷酸序列進行遺傳工程學製造，或者將這些方法組合獲得。本發明的又一方案涉及編碼具有免疫球蛋白結合能力的本發明的肽的核酸。本說明書中，核酸是指單鏈或雙鏈的DNA或RNA。本發明的核酸可通過本領域技術人員公知的各種方法製造和取得。本發明在某一方案中，涉及核酸，該核酸具有編碼SEQ ID NO: 9-15的任一胺基酸序列的核苷酸序列。本發明中，編碼SEQ ID NO: 9-15的任一胺基酸序列的核苷酸序列可例舉SEQ ID NO: 16-22的核苷酸序列。因此，本發明還涉及具有SEQ ID NO:16-22的任一核苷酸序列的核酸。另外,具有編碼SEQ ID NO: 9_15的任一胺基酸序列的上述以外的核苷酸序列(例如簡併序列)的核酸也包含在本發明中。本發明的核酸除上述核酸之外，還可為(a)具有在上述核酸的核苷酸序列中，I個或多個、例如 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17個核苷酸缺失、置換或添加而成的核苷酸序列的核酸；(b)在嚴格條件下可與上述核酸或其互補鏈形成雜合體的核酸；或者(c)具有與上述核酸的核苷酸序列具50%以上(例如60、70、80、90、95、97、98或99%以上)的同源性的核苷酸序列的核酸等。並且本發明的核酸還可以是上述核酸中的任意核苷酸被適當修飾所得。即使具有任一種的核苷酸序列，本發明的核酸也編碼具有免疫球蛋白結合能力、比具有SEQ ID NO:1的胺基酸序列(a)的肽具有更高水溶性的肽。上述嚴格條件例如可例舉J.Sambrook等人.，「Molecular Cloning: ALaboratory Manual, Second Edition，，， 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press所述的條件。例如在含有6XSSC、5XDenhardt’s溶液、0.5%SDS、100 μ g/ml改性鮭魚精子DNA的溶液中、在68°C下與探針形成雜合體，然後，洗滌條件為在2XSSC、0.1%SDS中室溫變化為在0.1 X SSC,0.5%SDS中、68°C的條件;在65°C下、在含有2 X SSPE (記載於FrederickM.Ausubel 等人.，「Current Protocols in Molecular Biology」，1987, John Wiley &Sons, Hoboken NJ.)和0.1%SDS的溶液中洗滌15分鐘2次、進一步在含有0.5 X SSPE和
0.1%SDS的溶液中洗滌15分鐘2次、接著在含有0.1 X SSPE和0.1%SDS的溶液中洗滌15分鐘2次的條件；或者在65°C、在含有2XSSPE、0.1%SDS和甲醯胺(5-50%)的溶液中洗滌15分鐘2次、進一步在含有0.5 X SSPE、0.1%SDS和甲醯胺(5-50%)的溶液中洗滌15分鐘2次、接著在含有0.1XSSPE、0.1%SDS和甲醯胺(5-50%)的溶液中洗滌15分鐘2次的條件等。上述核苷酸序列的同源性例如可使用FASTA、BLAST、DNASIS(日立乂 7卜々工7工 > 夕二 7丨J >夕'' (株)製造)、GENETYX((株)夕工木r 4夕X製造)進行測定。本發明的核酸只要是具有編碼具免疫球蛋白結合能力的肽的核苷酸序列的核酸即可，可以是任何核酸。還可以是由上述核苷酸序列組成的核酸，或者是含有上述核苷酸序列作為核心序列、且所述序列的5』末端和/或3』末端結合有核苷酸、多核苷酸或它們的類似物等各種物質的核酸。例如，本發明的核酸上結合有多核苷酸時，所述多核苷酸可以由1-150個、例如1-60個、1-45個或1_18個核苷酸組成(上述核苷酸的個數只是例子，並不是限定)。本發明的又一方案涉及含有上述核酸的載體。本發明的載體只要是含有上述核酸即可，可以是任何載體。可根據 導入載體的宿主的種類、必需的產物、使用目的等各種條件，適當選擇或設計並獲得載體。例如，通過在SEQ ID NO: 16-22的任一序列所示的核苷酸序列的5』末端或3』末端框內插入編碼目標蛋白質的核苷酸序列，本發明的載體可作為具有免疫球蛋白結合能力的肽附加於目標蛋白質的N末端或C末端而成的融合蛋白的表達用載體使用。為了容易地從融合蛋白上分離目標蛋白質，本發明的載體可以在上述核苷酸序列和目標蛋白質的核苷酸序列插入部之間含有例如由HRV 3C、凝血酶、Xa因子、腸激酶等的蛋白酶識別的序列。將本發明的載體導入細胞，可以產生本發明的肽或融合蛋白。本發明在另一方案中涉及本發明的具有免疫球蛋白結合能力的肽附加於目標蛋白質的N末端和/或C末端得到的融合蛋白。本發明的融合蛋白可通過本領域技術人員已知的各種方法製造和取得。本發明的融合蛋白含有具免疫球蛋白結合能力的肽，因此，使用所述肽作為標籤序列，可以分離和/或純化目標蛋白質。另外，本發明的肽不像A蛋白或G蛋白與免疫球蛋白的結合能力那麼高，因此，對於本發明的融合蛋白，例如固定於純化用柱時，與A蛋白或G蛋白相比較，可以進行溫和條件下的免疫球蛋白的純化以及反覆使用所述柱(可抑制劣化)，例如作為免疫球蛋白檢測用探針使用時，具有探針再生(Mprobe)容易等的優點。本發明的融合蛋白中所含的目標蛋白質可以是任何蛋白質。本發明的融合蛋白含有例如鹼性磷酸酶(ALP)、過氧化物酶(HRP)、螢光素酶以及綠色螢光蛋白(GFP)等的螢光蛋白、β -半乳糖苷酶、穀胱甘肽S轉移酶、麥芽糖結合蛋白等的酶作為目標蛋白質時，檢測本發明的融合蛋白中所含的具有免疫球蛋白結合能力的肽與免疫球蛋白的結合等變得容易。本發明的融合蛋白例如還可以含有組氨酸標籤、GST標籤、S標籤、Myc標籤、HA標籤或E標籤等的標籤序列、核定位信號、二氧化矽結合蛋白、A蛋白等。本發明的融合蛋白可以在本發明的肽和目標蛋白質之間含有由蛋白酶識別的肽。通過含有所述肽，可以容易地將目標蛋白質從融合蛋白上分離。本發明的又一方案涉及編碼上述融合蛋白的核酸。本發明進一步涉及含有核酸的載體，該核酸編碼上述融合蛋白。將所述載體導入細胞以產生蛋白質，由此可得到本發明的融合蛋白。本發明的一個方案中，涉及細胞，該細胞含有編碼上述具免疫球蛋白結合能力的肽的核酸、編碼上述融合蛋白的核酸、或含有這些核酸的載體。本發明的細胞例如可通過使用上述核酸或載體轉化大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞、動物細胞等宿主細胞來製造。也可通過培養本發明的細胞，回收產生的具有免疫球蛋白結合能力的肽、或含有具免疫球蛋白結合能力的肽的融合蛋白，來製造本發明的肽或融合蛋白。 本發明的又一方案涉及具有免疫球蛋白結合能力的肽的製造方法，該方法包括: (a)使用載體轉化細胞的步驟，該載體含有編碼具免疫球蛋白結合能力的肽的核酸；
以及
(b)培養該細胞以產生肽的步驟。細胞的轉化可通過本領域技術人員已知的手段和/或方法進行。因此，本發明涉及可通過上述肽的製造方法獲得的、具有免疫球蛋白結合能力、且水溶性得到改善的肽。本發明另一方案涉及融合蛋白的製造方法，該融合蛋白是具有免疫球蛋白結合能力的肽附加於目標蛋白質的N末端和/或C末端而成，該方法包括:
(a)使用載體轉化細胞的步驟，該載體含有編碼融合蛋白的核酸，該融合蛋白是具有免疫球蛋白結合能力的肽附加於目標蛋白質的N末端或C末端而成；以及
(b)培養該細胞以產生融合蛋白的步驟。本發明的融合蛋白的製造方法可進一步包括從融合蛋白中取出目標蛋白質的步驟。因此，本發明涉及融合蛋白，該融合蛋白可通過上述融合蛋白的製造方法獲得，該融合蛋白是具有免疫球蛋白結合能力、且水溶性得到改善的肽附加於目標蛋白質的N末端和/或C末端而成。本發明的又一方案涉及用於使免疫球蛋白結合的組合物，該組合物含有具免疫球蛋白結合能力的肽、或者含有所述肽的融合蛋白。上述肽或融合蛋白以外的成分可根據使用本發明的組合物的目的等各種條件適當選擇。如上所述，本發明的組合物含有具免疫球蛋白結合能力的肽，因此本發明的組合物例如可以是用於確定免疫球蛋白的存在或量的組合物，還可以是用於分離免疫球蛋白的組合物。通過本發明的組合物，可以確定試樣中免疫球蛋白的量、從試樣中分離免疫球蛋白等。本發明的又一個方案涉及用於使免疫球蛋白結合的裝置，該裝置是將具有免疫球蛋白結合能力的肽、或含有所述肽的融合蛋白固定而成。本發明的裝置例如是在板、樹脂、柱、珠、瓊脂糖、瓊脂糖凝膠(Sepharose)等含糖的樹脂、二氧化娃基板、玻璃(載玻片等)、金屬(金等)、磷灰石等載體上固定上述肽或融合蛋白而成。固定可通過經由肽、或者蛋白質的氨基或羧基的方法；經由胺基酸側鏈的SH基的方法；離子鍵合的方法；氫鍵合的方法等本領域技術人員已知的手段、方法進行。如上所述，本發明的裝置是將具有免疫球蛋白結合能力的肽固定而成，因此本發明的裝置包括:用於確定免疫球蛋白的存在或量的裝置、以及用於分離免疫球蛋白的裝置。本發明的裝置例如可以以ELISA用板、免疫球蛋白純化用柱、檢測用玻璃陣列(glassarray)、微流體系統、SPR用傳感晶片、檢測用二氧化矽基板、抗體藥物純化系統等的形式使用。本發明的又一方案涉及使免疫球蛋白結合的方法，該方法包括:
(a)將具有免疫球蛋白結合能力的肽、或者含有所述肽的融合蛋白添加到試樣中的步驟；以及
(b)調查肽或融合蛋白與免疫球蛋白的結合物的步驟。試樣只要是具有含免疫球蛋白的可能性即可，可以是任何試樣。通過調查與免疫球蛋白的結合物的存在和/或量，可以確定試樣中是否存在免疫球蛋白，可進一步確定存在於試樣中的免疫球蛋白的量等。本發明的方法中使用的肽或融合蛋白可以進行標記。標記可舉出生物素化、螢光標記、RI標記、酶標等本領域技術人員已知的各種標記。通過添加所述標記，可以容易地調查與肽或融合蛋白的結合物。本發明的方法可進一步包括從結合物上分離免疫球蛋白的步驟。因此，本發明還涉及試劑盒，該試劑盒用於使免疫球蛋白結合的方法，含有具免疫球蛋白結合能力的肽或含所述肽的融合蛋白。本發明的試劑盒除上述肽或融合蛋白以外，例如還可含有調查標記、結合物的裝置等。本發明的 又一方案涉及由於Clq與免疫球蛋白的結合而引發的疾病的治療或預防用藥物組合物，該組合物含有具免疫球蛋白結合能力的本發明的肽、含所述的肽的融合蛋白、編碼所述肽或融合蛋白的核酸、或者含有所述核酸的載體作為有效成分。由於Clq與免疫球蛋白結合而引發的疾病是指由於所述結合直接或間接發生的疾病，例如可舉出:類風溼性關節炎、關節炎、系統性紅斑狼瘡(SLE)、血管炎症候群、腎炎等免疫複合物病、其它炎症性疾病、銀屑病、以及惡性腫瘤等。本發明的藥物組合物可通過所含的具有免疫球蛋白結合能力的肽抑制Clq與免疫球蛋白的結合，來治療和預防上述疾病。本發明的肽來自於原本存在於人體內的Clq，因此，幾乎不發生由於將本發明的肽給予人而產生的副作用，即使有也很少。並且本發明的肽通過改變來自天然蛋白質的胺基酸序列，使水溶性得到改善，作為藥物組合物給予對象時，具有可提高實質給予量等的優點。另外，通過在構成成分中含有D-構型胺基酸，使其對蛋白質分解的抗性提高，因此本發明的肽在給予對象體內具有高穩定性和長半壽期。可作為本發明的藥物組合物的有效成分使用的本發明的肽是具有免疫球蛋白結合能力的肽，是具有下式所示的胺基酸序列的肽:
Pro-Gly-Leu-X4-X5-Phe(I)
(這裡，X4和X5為不同時為Tyr的胺基酸)。作為本發明的藥物組合物的有效成分，優選的本發明的肽的例子是:在上述胺基酸序列(I)中，X4、X5均為親水性胺基酸。所述親水性胺基酸可舉出:Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Ser和Thr等。作為本發明的藥物組合物的有效成分，更優選的本發明的肽的例子是具有SEQ ID NO: 9-15中任一胺基酸序列的肽。進一步優選具有在式(I)的胺基酸序列中I個或多個胺基酸(Gly除外)、或者所有的胺基酸(Gly除外)被對應的D-胺基酸置換的胺基酸序列的肽。本發明的藥物組合物的給予方法可根據疾病的種類、對象的狀態和/或目標部位等的條件適當選擇。該方法可舉出:皮內給予、皮下給予、肌內給予、靜脈內給予、經鼻給予、口服給予、經肺給予、栓劑等，但並不限於這些。本發明的藥物組合物中所含的肽的量、藥物組合物的劑型、給予頻率等可根據疾病的種類、對象的狀態、目標部位等的條件適當選擇。例如一次的肽給予量可以是0.01-100mg/kg,優選0.Ι-lOmg/kg,本發明的肽的給予量並不限於這些。本發明的又一方案涉及由於Clq與免疫球蛋白的結合而引發的疾病的治療或預防方法，該方法包括:將有效量的、具有免疫球蛋白結合能力的肽、含所述肽的融合蛋白、編碼所述肽或融合蛋白的核酸、或者含所述核酸的載體給予對象。本發明的又一方案中，涉及具免疫球蛋白結合能力的肽、含所述肽的融合蛋白、編碼所述肽或融合蛋白的核酸、或含有所述核酸的載體，它們用於由Clq與免疫球蛋白的結合而引發的疾病的治療或預防。本發明的又一方案中，提供具免疫球蛋白結合能力的肽、含所述肽的融合蛋白、編碼所述肽或融合蛋白的核酸、或含有所述核酸的載體在由於Clq與免疫球蛋白的結合而引發的疾病的治療或預防中所使用的藥物製造中的應用。以下給出實施例，具體且詳細地說明本發明，但實施例並不解釋為限定本發明。實施例1 肽的水溶性的研究
本發明人對具有來自Cl·q的胺基酸序列的肽進行研究，發現具有SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列(Pro-Gly-Leu-Tyr-Tyr-Phe)的肽或其修飾物在類風溼性關節炎、以及系統性紅斑狼瘡(SLE)、腎小球腎炎、血管炎、關節炎等免疫複合物病等的、由於Clq與免疫球蛋白結合而引發的疾病中顯示治療和預防效果(參照國際公開第2009/025300號小冊子和國際公開第2010/084851號小冊子)，為了進一步提高上述肽的水溶性，進行了以下的研究。(I)突變導入部位的研究
對於具有具免疫球蛋白結合能力的肽、顯示各種治療和預防效果、具有SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列的肽，通過丙氨酸篩選探究可不涉及上述結合能力地導入突變的部位。委託GL Biochem公司(上海)製作具有表I所示的胺基酸序列的肽。[表I]
]成歎氣基酸序到丨SEQIPNO:
K I_ S' G L Y Y F__I_!
K 2_ Λ CJ L Y \ l..__2_I
K 3F Λ L Y Y K 3 ;
R 4__PGAYYF """""4|
Γ丨
R 「_ P C； L V Λ F (1...................................................1
K VI, 「 L V Y Λ.:
將人 Clq 蛋白(Carbiochem 製造)溶解於 IOmM HEPES、300mM NaCl、40% 甘油(ρΗ7.2)中，製備200 μ g/ml人Clq蛋白溶液。將每2μ 1 (400ng)人Clq蛋白溶液在5mmX 15mm大小的硝基纖維素膜(Hybond C，7 \ Λ製造)上點樣，在室溫下風乾約I小時。將硝基纖維素膜浸泡於TBS中，溫育5分鐘，使用含有5%封閉劑(Amersham ECL封閉劑，GEHealthcare 製造)的 TBS (20mM Tris-HCl ρΗ7.5，150mM NaCl)，在室溫下進行 I 小時封閉。用TBS輕輕洗滌，然後浸潰於20 μ I將鹼性磷酸酶(ALP)標記人免疫球蛋白(IgG) (BECKMANCOULTER製造)用TBS稀釋1000倍、各肽的濃度為500 μ g/ml的混合的溶液中，在室溫下反應I小時。用TTBS溶液(以終濃度0.05%將吐溫20加入到TBS中所得)輕輕洗滌，然後在該液中振蕩洗漆10分鐘，3次。使用ALP標記免疫球蛋白(IgG)檢測人Clq蛋白與IgG的結合物。將硝基纖維素膜用ALP顯色緩衝液(含IOOmM NaCl、5mM MgCl2的Tris-HCl pH9.5)輕輕洗滌，然後浸泡於30 μ I含有BCIP/NBT溶液(口 J力製造)的ALP顯色緩衝液中，在室溫下顯色10分鐘。在得到染色圖像時，將硝基纖維素膜浸泡於足夠量的蒸餾水中，衝洗顯色緩衝液。洗滌後，將硝基纖維素膜風乾，使用Multi Gauge (FUGJI FILM)進行染色圖像的獲取。結果如圖1所示。在SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列中，在將第3_5號胺基酸置換為丙氨酸的肽中，仍保持有免疫球蛋白結合能力。特別是即使將第4號或第5號胺基酸置換為與原有胺基酸不同種類的胺基酸，也顯示對免疫球蛋白結合能力幾乎沒有影響。(2)向肽導入親水性胺基酸的研究
對於(I)中已確認可導入突變的、將第4號和第5號胺基酸置換為各種親水性胺基酸的肽的水溶性進行研究。委託GL Biochem(上海)製作表2所示的胺基酸。在表2所示的肽中，SP1-7是將第4號和第5號胺基酸置換為各種親水性胺基酸所得的肽。[表2]
權利要求
1.具有免疫球蛋白結合能力的肽，具有以下所示的胺基酸序列: Pro-Gly-Leu-X4-X5-Phe (I) 這裡，X4和X5是不同時為Tyr的胺基酸。
2.權利要求1的肽，其中，X4和X5的一方或兩者為親水性胺基酸。
3.權利要求1的肽,其中，X4和X5獨立為選自Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gin、Ser和Thr的胺基酸。
4.權利要求1的肽，該肽具有SEQID NO: 9-15中任一個的胺基酸序列。
5.權利要求1-4中任一項的肽，其中，式(I)的胺基酸序列中的I個或多個胺基酸(Gly除外)被對應的D-胺基酸置換。
6.權利要求1-4中任一項的肽，其中，式(I)的胺基酸序列中的全部胺基酸(Gly除外)被對應的D-胺基酸置換。
7.融合蛋白，該融合蛋白是 權利要求1-6中任一項的肽附加於目標蛋白質的N末端和/或C末端而成。
8.編碼權利要求1-4中任一項的肽的核酸。
9.編碼融合蛋白的核酸，該融合蛋白是權利要求1-4中任一項的肽附加於N末端和/或C末端而成。
10.由於Clq與免疫球蛋白的結合而引發的疾病的治療或預防用藥物組合物，該藥物組合物含有權利要求1-6中任一項的肽、權利要求7的融合蛋白、權利要求8或9的核酸、或者含有權利要求8或9的核酸的載體作為有效成分。
11.權利要求10的藥物組合物，其中，疾病為類風溼性關節炎。
12.權利要求10的藥物組合物，其中，疾病選自系統性紅斑狼瘡(SLE)、腎小球腎炎、血管炎、關節炎。
13.權利要求10-12中任一項的藥物組合物，其中，有效成分為權利要求4-6中任一項的肽。
全文摘要
本發明涉及具有免疫球蛋白結合能力的肽、和含有所述肽的融合蛋白。本發明還涉及由於C1q與免疫球蛋白的結合而引發的疾病的治療或預防用藥物組合物等，該藥物組合物含有具免疫球蛋白結合能力的肽或與所述肽的融合蛋白。由本發明提供的藥物組合物特別對於關節炎或風溼的治療有效。
文檔編號C07K7/06GK103237806SQ20118005819
公開日2013年8月7日 申請日期2011年9月22日 優先權日2010年10月1日
發明者真崎修, 富田哲也 申請人:株式會社Mmt