肝臟組織來源的製作方法

2023-08-06 20:07:56 3

專利名稱：肝臟組織來源的製作方法
技術領域：
本發明通常涉及從心臟停止跳動的供體屍體的組織獲得包括祖細胞或幹細胞的 二倍體細胞。
背景技術：
從肝臟分離和鑑定未成熟的祖細胞具有極大的臨床和商業利益，因為該細胞群體 在治療肝臟疾病中具有效果。在美國每年有大約300，000例因為肝臟衰竭住院。肝移值對 某些形式的肝衰竭具有療效，且在美國每年進行大約4800例移植。肝臟移植中的一個限制 性因素是供體肝臟的可得性，特別是受到器官移植的供體肝臟必須來自經歷腦死亡但心跳 未停止的病人的限制。儘管最近如果在死亡半小時內獲得該肝臟時使用該供體的努力支持 了使用它們的可能性，但是來自屍體(心搏停止)的供體肝臟尚未成功。將細胞移植進肝臟對於大多數肝臟疾病而言是一種有吸引力的治療選擇。細胞移 植的手術操作相對於完整器官移植所需的那些操作較小，因此，可用於有各種手術危險的 病人，例如，老年人或衰弱病人。使用人肝細胞優於來自其它哺乳動物的肝細胞，因為潛在 的病原體(如果有的話)是人類來源的，病人能更好地耐受且容易在用前篩選。過去為獲得認為是最多用的群體的肝臟祖細胞群體用於肝臟的細胞和基因治療 已作出了嘗試。Reid等的美國專利號5，576，207和5，789，246使用細胞表面標記和側面散 射流式細胞術提供了肝臟中的限定亞群體。肝臟祖細胞是二倍體細胞，它們或其後代能分 化成肝細胞。肝臟祖細胞對於生長因子的生產也非常有用。這與其自身生長或肝臟中其它祖細 胞(例如，造血或間充質祖細胞)的生長相聯繫且也可包括與將肝臟祖細胞供給特定譜系 的早期步驟相關的尚未發現的生長因子。這些新生長因子在治療肝臟疾病或控制肝臟癌症 (現在認為是肝臟祖細胞的轉化突變體)中具有潛力。另外，肝臟祖細胞是基因治療的載體，其中遺傳插入轉化的或正常的肝臟祖細胞 可促進移植該肝臟祖細胞的個體的健康。進行肝細胞移植的嘗試利用了未分離的成熟肝細胞並顯示了一定程度的功效。然 而，該成就需要注射大量細胞(100-200億個)，因為該細胞在體內的生長潛力有限。另外， 導入大量的大型成熟肝細胞(平均細胞直徑25-50 μ m)伴隨著注射時形成大量聚集的傾 向，導致潛在的致命栓塞。而且，這些細胞誘發顯著的免疫學排斥反應，迫使病人靠免疫抑 製藥物來維持餘生。成熟的，分化的肝細胞通過一些標準可與肝臟祖細胞區分開來。分化的細胞傾向 於形成團塊或聚集，如果注射進病人，導致出現栓塞形成的危險。分化的細胞特別耐冷藏且 具有顯著的免疫原性。而且，由於分化細胞的增殖能力有限，用分化細胞移植與器官移植相 比具有較小的優勢(如果有的話)，且具有包括製備程序更精細的缺點。
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需要供體組織的用於移植或其它醫學目的的重要器官，例如，心臟，肝臟，胰腺，肺 和腎的矩缺是由於仍然具有功能的器官的可獲得性有限。當前，用於移植的器官從心臟仍 在跳動的腦死亡的供體取得。如果心跳停止，血液循環就停止(局部缺血)，它中斷了組織 的氧合作用(缺氧)，因此，器官在極短的時間期間內受到局部缺血損傷導致出現這樣一 種幾乎確定的可能性，即移植時該器官不發揮功能。一般來說，不使用心跳停止後的器官， 在實驗上，沒有使用心跳停止或心搏停止時間超過1個半小時後的器官。通常，醫院只有 1-2%的死亡滿足腦死亡有心跳的標準。然而，可獲得大量且尚未利用的器官來源用於移 植，其中許多來自事故的遇難者，他們或者在受傷時死亡，或者具有較短的傷後存活時間。 這些事故遇難者由於局部缺血損傷而未被用作器官供體。諸如肝臟，腦和心臟的器官屬於 局部缺血最敏感的組織。例如，由於心跳停止的缺氧和局部缺血腦損傷在大約4分鐘後導 致腦和有關神經組織的損傷。心跳停止後心臟可完整存活達4小時。肝臟可有功能地存 活不超過1小時，且來自無心跳的供體(NHBDs)的移植建議優選在出現暖局部缺血的前35 分鐘內進行[參見Ong HS, Soo KC, Joseph VT, Tan SY, Jeyaraj PR的文章(作為參考文 獻引用)的摘要。Ann Acad Med Singapore 1999年1月；28(1) :25_30，暖局部缺血延遲 後用於移植的肝臟移植物的活力；Hong HQ, Yin HR, Zhu SL, Lin YT，來自選擇的無心跳屍 體供體的移植肝臟的結果，Hiroshima J Med Sci，1991年9月；40(3) :87_91]。在目前的 醫學法規下，在可搶救潛在可移植器官的時間之前的時間通常被耽擱。這是因為潛在的供 體必須首先被帶到醫院或停屍室。然後家屬必須填寫器官捐贈表格。只有在器官捐贈程序 完成後，才許可手術小組接近屍體以獲取器官。在許多場合下由於這些程序導致時間流逝， 器官已經不可逆地受到損傷或者不再有活力。因此，現有技術提供了大量方法和程序用於 防止供體器官局部缺血損傷。參見，例如美國專利號5, 702,881 ；5, 660, 976 ；5, 752,929 ； 5，863，296 ；5，855，617 ；5，843，024 ；5，827，222 ；5，723，282 ；5，514，536 ；和 4，723，939 等並 以參考文獻的形式在本文中引用。儘管大量的現有技術文獻針對防止供體器官喪失功能的 方法，但對於使用心跳停止超過不可逆時間點的屍體的情況現有技術沒有記載。只有3篇 美國專利(5，843，024 ；5, 702，881 ；4, 723，939)似乎涉及無心跳的供體。但該現有技術沒有 教導使用「不可修復的」器官用於從其中分離祖細胞。儘管分離肝臟前體細胞的方法在本 領域是已知的(參見，例如美國專利號5，576，207和5，789，246，本文作為參考文獻引用)， 但直到本發明付諸實踐時還不知道可從現有技術認為「無用」的器官分離前體肝臟細胞。由本文所述的本發明的發明人開創的，從對人肝臟祖細胞及其分離和擴增的認識 進展建立的技術通過提供對細胞移植進肝臟非常有用的新細胞群體產生對與肝臟疾病相 關的發病率和死亡率的重要影響。因此，對於使用來自血液循環停止或無心跳的屍體的器官作為醫學目的的器官或 器官等同物來源的有效方法存在長期需要。發明概述本發明涉及提供具有至少一種二倍體細胞群體的組織作為二倍體細胞來源的方 法。該方法包括(a)從獲取組織時無心跳的供體獲取組織，所獲取的組織被認為具有至 少一種二倍體細胞群體；(b)處理獲取的組織以獲得基本上富含二倍體細胞的一種細胞群 體。優選的是，供體不是胎兒且選自新生兒，嬰兒，兒童，少年人或成年人。從該方法獲得的 二倍體細胞包括祖細胞。
在本發明的一個具體實施方案中，處理步驟包括處理獲取的組織以提供基本上的 單細胞懸液。經過將基本上的單細胞懸液分成兩個或多個部分，一般三個或多個，優選4個 或多個來進一步處理該單細胞懸液。在該分離步驟中，將大細胞與小細胞分離，高密度細胞 與低密度細胞分離，或兩種情況都分離。可使用本領域的普通技術人員已知的將細胞分成 小部分的任何方法。一個方便的方法是離心，首先以較低速度，然後逐漸加快速率。進一步 處理基本上由小細胞，低密度細胞，或兩者組成的部分以提供基本上富含二倍體細胞的細 胞群體。具體地說，所需的二倍體細胞的例子包括表達甲胎蛋白的祖細胞，特別是肝臟祖細 胞。本發明的優選組織是在供體心跳停止後大約6小時內，優選心跳停止後大約3小 時內，更優選心跳停止後大約2小時內，最優選心跳停止後大約1小時內獲取的那些組織。 然而，供體心跳停止後獲取該組織的時間越早越好。因此，在供體心跳停止後大約45，30或 15分鐘內獲取的組織仍然是較優選的。可獲取各種組織並進行處理以獲得二倍體細胞，包 括腎上腺，血管，骨髓，角膜，視網膜，胰島，膽管，晶狀體，肺，腎，心臟，腸，卵巢，胰腺，前列 腺，甲狀旁腺，松果體，腦垂體，皮膚，睪丸，膀胱，腦，脊髓，脾臟，胸腺，甲狀腺或者肝臟。本發明還涉及一種組合物，它含有一種基本上富含二倍體細胞的細胞群體，特別 是用本發明的方法獲得的，表達甲胎蛋白的那些細胞。本發明在獲得供體器官和組織的領域中取得了重要突破並提供了獲得祖細胞和 二倍體成年細胞的組織來源的方法。本發明是完全意想不到的，因為所有已知的現有技術 文獻都認為局部缺血損傷的器官對於任何有意義的目的都是完全無用的。優選的方法包括 從供體獲取組織，其中該供體無心跳，並處理該組織以提供包括祖細胞或幹細胞的二倍體 細胞。優選的是，本發明包含提供包括祖細胞的肝臟二倍體細胞的組織來源的方法，它 包括從供體獲取肝臟組織，其中該供體無心跳，並處理該組織以提供二倍體細胞和/或肝 髒祖細胞。例如，該細胞可用於在需要的宿主中恢復損傷的肝臟實質群體或重建肝臟。盡 管任何動物供體是同樣合適的，但優選的供體是人類。諸如豬和靈長類的動物是同樣合適 的。因此，本發明的目的是在心跳停止後大約24小時或更長的時間內獲得該器官或 組織。即使該時間限制不受約束，也優選在心跳停止後大約16小時內獲得該組織。更優選 的是在心跳停止後大約10小時內獲得該組織。另外更優選在心跳停止後大約6小時內獲得 該組織。甚至更優選在心跳停止後大約3小時內獲得該組織。另一優選的時間期限是在心 跳停止後大約1小時內獲得該組織。儘管在該時間期限二倍體細胞和祖細胞耐局部缺血。 獲取的組織或者用合適的灌流培養基灌流或者不作灌流而用於進一步處理。儘管優選將組織冷卻到大約室溫，但將組織冷卻到大約4°C同樣是具有優勢的。組 織可在全部或部分局部缺血時間內冷卻。即，對器官可進行暖和冷局部缺血的組合。在本發明範圍內，優選供體是新生兒，嬰兒，兒童，少年或成年人，在本發明範圍內 也包括由於推測的局部缺血而認為不合適的胎兒組織。儘管供體的年齡不是關鍵的，但需 要供體在大約0歲至大約77歲之間，更優選不超過大約50歲。用於本發明的優選組織包括腎上腺，血管，骨髓，角膜，胰島，晶狀體，肝臟，卵巢， 胰腺，甲狀旁腺，松果體，腦垂體，皮膚，睪丸，胸腺，甲狀腺或者其組含。優選的組織是肝臟。
本發明的另一實施方案是提供了導致從該組織產生基本上的單細胞懸液的處理 方法。優選的處理方法還包括壓實(debulking)的步驟，它大量減少了懸液中多倍體細胞 或成熟細胞的數目以提供富含表現出與至少一種細胞譜系相關的至少一種標記的二倍體 細胞和/或祖細胞的壓實的懸液。不作為對該方法的限制，處理步驟包括以大小或密度分 離細胞。優選的處理還包括從懸液選擇那些表達與至少一種細胞譜系相關的至少一種標 記的細胞，其中至少一種細胞譜系包括至少一種肝臟，造血，或間充質細胞譜系。本發明還 有一個目的是提供具有發育成肝細胞，膽細胞，或其組合之能力的二倍體細胞和/或祖細 胞。優選的是本發明的供體細胞單獨或者以有益組合表達包括甲胎蛋白，白蛋白，骨 唾液蛋白，⑶14，⑶34，⑶38，⑶90，⑶45，CD 117，ICAM-1，I型膠原蛋白，II型膠原蛋白， III型膠原蛋白，血型糖蛋白A，或骨橋蛋白的至少一種標記。作為本發明的另一目的，提供了一種治療方法，其中祖細胞用作細胞移植物，生物 反應器，人造器官等。優選的醫學症狀和需要包括克_納二氏症候群，酪氨酸血症，肝硬化， 急性肝衰竭，糖尿病，和本領域已知的其它肝臟和肝臟相關性症狀。一般來說，治療的患者 可患有至少一種肝臟疾病，該疾病選自肝臟炎症，病毒性肝炎，中毒性肝細胞損傷，肝臟纖 維變性，肝硬化，肝充血，肝營養障礙，肝細胞脂肪變性，脂肪肝，解毒功能障礙，肝分泌功能 障礙，肝接合功能障礙，由肝疾病引起的肝門高血壓合成功能障礙，或肝衰竭昏迷，蛋白降 解產物或氨中毒。這些機能障礙導致諸如阿拉惹症候群，酒精肝疾病，α-1-抗胰蛋白酶缺 陷，自身免疫肝炎，膽閉鎖，膽管缺乏，骨髓衰竭，巴德-希阿里症候群，Byler疾病，克-納二 氏症候群，Caroli疾病，膽汁鬱積瘙癢症，膽石病，接合高膽紅素血症，慢性移植物與宿主疾 病，原因不明性肝疾病，糖尿病，杜-約症候群，紅細胞肝性原卟啉症，肝外膽管癌，家族性 高膽固醇血症，半乳糖血症，吉爾伯症候群，糖原存儲疾病，血管瘤，血色病，肝腦病，肝膽管 炎，肝軟化，肝大，肝癌，肝胚細胞瘤，遺傳性血色病，黃膽，肝內膽汁鬱積，肝囊腫，肝移植， 與Bacillus cereus相關的肝衰竭，混合型冷球蛋白血症，鳥氨酸轉氨甲醯基酶缺陷，紫癜 肝病，遲發性皮膚血卟啉病，原發性膽肝硬化，頑固性腹水，羅託症候群，肉樣瘤病，硬化性 膽管炎，皮脂腺病，Summer ski 11症候群，血小板減少症，酪氨酸血症，靜脈曲張性出血，肝臟 靜脈閉合疾病，和肝豆狀核變性等的疾病，且用本發明的方法和組合物治療是有益的。不局限於上述實施方案，還包括基因治療的方法，它包括本領域熟知的方法，包括 但不限於將載體導入二倍體細胞和/或祖細胞，然後移植進需要的宿主中。症狀和靶基因 可包含家族性高膽固醇血症中的LDL受體基因，血友病中的因子VIII和IX的凝血因子基 因，肺氣腫中的α-1-抗胰蛋白酶基因，苯丙酮酸尿中的苯丙氨酸羥化酶基因，血氨過多中 的鳥氨酸轉氨甲醯酶基因，和在各種補體缺陷形式中的補體蛋白基因，可藉助於基因治療 進行有益治療或治癒的其它醫學症狀。其它所需的實施方案包括編碼甲氨醯合成酶1，鳥氨酸轉氨甲醯酶，精氨琥珀酸合 成酶，精氨琥珀酸裂解酶，精氨酸酶，延胡索醯乙醯乙酸水解酶，苯丙氨酸羥化酶，α "I"抗 胰蛋白酶，葡萄糖-6-磷酸酶，低密度脂蛋白受體，膽色素原脫氨酶，甲氨醯合成酶I，鳥氨 酸轉氨甲醯酶，精氨琥珀酸合成酶，精氨琥珀酸裂解酶，精氨酸酶，因子VIII或IX，胱硫醚 β -合成酶，支鏈酮酸脫羧酶，白蛋白，異戊醯-CoA脫氫酶，丙醯CoA羧化酶，甲基丙二醯CoA變位酶，戊二醯CoA脫氫酶，胰島素，轉鐵蛋白，β -葡萄糖苷酶，丙酮酸羧化酶，肝臟磷 酸化酶，磷酸化酶激酶，甘氨酸脫羧酶，H-蛋白，T-蛋白，Menkes疾病蛋白，或肝豆狀核變性 基因產物的基因。本發明還涉及從人肝臟分離和冷藏二倍體細胞和/或祖細胞的方法，包括(a)處 理人肝臟組織以提供一種基本上的單細胞懸液，該懸液包括二倍體成年細胞，祖細胞和在 人肝臟中發現的一種或多種細胞譜系的非祖細胞；(b)對該懸液進行壓實的步驟，它大量 減少了懸液中非祖細胞的數目，以提供富含表現出與至少一種細胞譜系相關的一種或多種 標記的祖細胞的壓實的懸液；和(c)從壓實的懸液選擇那些其自身，其後代或其更成熟的 形式表達與一些肝臟細胞譜系相關的一種或多種標記的細胞；及(d)在對於冷藏最佳的條 件下懸浮該細胞。更優選的是選擇表達諸如甲胎蛋白的胞質蛋白的肝臟祖細胞。本發明的 處理或壓實的步驟優選包括根據與具有低浮力密度的一個或多個梯度部分相聯繫的其浮 力密度和大小對肝細胞懸液進行密度梯度離心以分離該細胞。肝細胞懸液的非祖細胞包括成熟的肝臟，造血，和間充質細胞。非祖細胞的負選擇 包括使用諸如連接蛋白32的與成熟肝細胞相關的標記，諸如血型糖蛋白A和CD45的與造 血細胞相關的標記，諸如視網膜樣蛋白(retinoids)或馮·維勒布蘭德氏因子的與成熟間 充質細胞相關的標記。本發明的另一方面提供了肝臟，造血，或間充質來源的肝臟祖細胞。通過選自 ⑶14，⑶34，⑶38，⑶45，⑶117，ICAM，血型糖蛋白A的抗原標記，和/或諸如甲胎蛋白樣免 疫反應性，白蛋白樣免疫反應性的胞質標記，或者兩者來選擇這些細胞譜系，其後代或其更 成熟的形式。甲胎蛋白來自mRNA的變異體形式。其中的一些是肝臟祖細胞特有的且一些 是造血祖細胞特有的。本發明的肝臟相細胞可從胎兒，新生兒，嬰兒，兒童，少年或成年人肝 髒中分離。根據本發明的另一方面，分離的人肝臟祖細胞，即一種二倍體細胞的亞群以高度 富集到基本上純的形式分離。該肝臟祖細胞含有肝臟，造血和間充質祖細胞。肝臟祖細胞 具有發育成肝細胞，膽細胞或其組合的能力；造血祖細胞具有發育成巨噬細胞，噬中性白細 胞，粒細胞，淋巴細胞，血小板，嗜中性白細胞，嗜曙紅細胞，嗜鹼細胞或其組合的能力。間充 質祖細胞具有發育成內皮細胞，基質細胞，肝臟星形細胞(Ito cells)，軟骨細胞，骨細胞或 其組合的能力。本發明的方法可用於選擇表達⑶34，骨橋蛋白，骨唾液蛋白，I，II，或III 型膠原蛋白或其組合的間充質祖細胞。本發明人克服了許多上述困難來製備包括祖細胞的二倍體細胞，理想地用於細胞 和基因治療及用於人造生物器官。由於細胞較小，因此使大型栓塞的形成最小化。另外，該 細胞具有廣泛的生長潛力，意味著在患者中重建肝臟組織需要較少的細胞。最後，祖細胞 具有最少的可誘發免疫學排斥的抗原標記，這給需要較小或沒有免疫抑制的藥物提供了希望。本發明的另一方面提供了含有外源性核酸的肝臟祖細胞。該外源性核酸可編碼一 個或多個目的多肽，或者可啟動一個或多個目的多肽的表達。根據本發明的另一方面，提供了經過給遭受負效應的個體施用有效量的分離的人 二倍體肝細胞和/或祖細胞減輕一種或多種人類疾病或機能障礙的負效應的方法。祖細胞 可通過血管進行腸胃外給藥，或者直接施用進肝臟。直接施用可通過門靜脈，腸繫膜靜脈，肝膽管，或其組合經手術實現。另外，肝臟祖細胞可施用進個體的異位位置，例如脾臟。可用本發明的方法減輕的人類病症或機能障礙包括肝膽管炎，肝軟化，肝大，肝 硬化，纖維變性，肝炎，急性肝衰竭，慢性肝衰竭，或代謝先天錯誤，肝癌，或肝胚細胞瘤。肝 癌可以是癌的原發性部位或者是轉移進肝臟的癌。轉移瘤可來自任意數量的原發性位點， 包括腸，前列腺，胸部，腎，胰腺，皮膚，腦，肺或其組合。可用該方法治療的肝臟疾病或機能 障礙還包括與肝組織線粒體區室的損傷相關的肝臟疾病或機能障礙且可由慢性肝臟疾病， 爆發性肝衰竭，病毒誘導的肝臟疾病，代謝型肝臟疾病和與膿毒症或肝臟創傷相關的肝臟 機能障礙組成。根據本發明的另一方面，提供了一種生物反應器，它包括(i)含有(a)從人肝臟， 其後代，其成熟中的或分化的後代，或其組合分離的祖細胞，(b)細胞外基質，和(c)培養 基的生物材料；(ii)容納所述生物材料的一個或多個區室或含有所述生物材料的組件；和 (iii) 一個或多個連接口。該生物反應器的生物材料可任選還包括(d)激素，生長因子，或 營養補充物，或(e)血漿，血清，淋巴，或由其產生的產品。生物反應器適用於將所述祖細胞維持在一種有活力的，有功能的狀態，且可維持 肝臟祖細胞大約一周或更長的時期。具體地說，該生物反應器適用於用作人造肝臟，用於產 品生產，毒理學研究，或代謝研究，包括涉及細胞色素P450的活性，或其它類型的藥物代謝 的研究。根據本發明的另一方面，提供了分離的人肝臟祖細胞的組合物，或從人類肝臟獲 得的富含祖細胞的懸液。該細胞懸液在藥用上可接受的載體或稀釋劑中提供且施用給需要 治療的受試者。本發明的組合物包含表現出與在人類肝臟中發現的一種或多種細胞譜系中 的至少一種相聯繫的一種或多種標記的肝臟祖細胞且基本上不含成熟細胞。更具體的說， 分離的肝臟祖細胞來自一種或多種肝細胞譜系，包括肝臟，造血，或間充質細胞譜系且它們 自身，其後代，或該祖細胞的更成熟形式表達抗原標記⑶14，⑶34，⑶38，⑶90，或⑶117， CD45，血型糖蛋白A，和甲胎蛋白樣免疫反應性，白蛋白樣免疫反應性的胞質標記，或者兩者 中的至少一種或多種。根據本發明的另一實施方案，提供了一種肝臟祖細胞的細胞培養物，它包括來自 人肝臟的分離的祖細胞，其後代，其成熟中的或分化的後代，或其組合。該細胞培養物還包 括細胞外基質，該基質包括一種或多種膠原蛋白，一種或多種粘連蛋白(層粘連蛋白，纖連 蛋白)，和其它組分，例如蛋白聚糖(例如硫酸乙醯肝素蛋白聚糖)；或獨特的基質成分。所 述基質成分包括基質成分的片斷；基質模擬物，該模擬物可以是用來自一類細胞外基質的 一種或多種因子包裹的合成的和/或可生物降解的材料(即微球體)。細胞培養物還包括 基礎培養基和其它營養成分；激素和/或生長因子，含有或不含諸如血清，血漿或淋巴的生 物學液體。另外，該培養基可含有一個或多個區室以容納諸如培養皿，瓶，轉瓶，轉移孔或其 它這類容器的生物學材料。本發明的培養物或生物反應器可用於產生各種醫學上重要的細胞分泌因子，包 括但不限於酶，激素，細胞因子，抗原，抗體，凝血因子，反義PNA，調控蛋白，核酶，融合蛋白 等。該培養物適合於提供治療性蛋白，例如因子VIII，因子IX，因子VII，紅細胞生成素， α-1-抗胰蛋白酶，降鈣素，生長激素，胰島素，低密度脂蛋白，載脂蛋白E，IL-2受體和其拮 抗劑，過氧化物歧化酶，免疫反應修飾劑，甲狀旁腺激素，幹擾素(IFNci，β，或Υ)，神經生長因子，葡糖腦苷脂酶，集落刺激因子，白介素(IL)I至15，粒細胞集落刺激因子(G-CSF)， 粒細胞，巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)，成纖維細胞生 長因子(FGF)，血小板產生的生長因子(PDGF)，腺苷脫氨酶，胰島素樣生長因子(IGF-1和 IGF-2)，巨核細胞啟動配體MPL，血小板生成素等。作為本發明的另一實施方案，提供了一種用於治療和預防肝臟疾病的藥物組合 物。該組合物包含有效量的屍體肝臟祖細胞和藥用載體。目的肝臟疾病包括中毒性，代謝 性，遺傳性，和/或傳染源性或變性性質的急性或慢性肝臟疾病，或由於使用藥物或對肝臟 的物質損傷引起的肝臟損傷。其中優選的症狀和疾病是肝臟炎症，病毒性肝炎，中毒性肝細 胞損傷，肝臟纖維變性，肝硬化，肝充血，肝營養障礙，肝細胞脂肪變性，脂肪肝，解毒功能障 礙，肝分泌功能障礙，肝接合功能障礙，由肝疾病引起的肝門高血壓合成功能障礙，或肝衰 竭昏迷，和蛋白降解產物或氨中毒。更具體的說，這些包括但不限於阿拉惹症候群，酒精肝 疾病，α-1-抗胰蛋白酶缺陷，自身免疫肝炎，膽管缺乏，骨髓衰竭，巴德-希阿里症候群，膽 閉鎖，Byler疾病，克-納二氏症候群，Caroli疾病，膽汁鬱積瘙癢症，膽石病，接合高膽紅素 血症，慢性移植物與宿主疾病，原因不明性肝疾病，糖尿病，杜-約症候群，紅細胞肝性原卟 啉症，肝外膽管癌，家族性高膽固醇血症，半乳糖血症，吉爾伯症候群，糖原存儲疾病，血管 瘤，血色病，肝腦病，肝膽管炎，肝軟化，肝大，肝癌，肝胚細胞瘤，遺傳性血色病，黃膽，肝內 膽汁鬱積，肝囊腫，肝移植，與Bacillus cereus相關的肝衰竭，混合型冷球蛋白血症，鳥氨 酸轉氨甲醯基酶缺陷，紫癜肝病，遲發性皮膚血卟啉病，原發性膽肝硬化，頑固性腹水，羅託 症候群，肉樣瘤病，硬化性膽管炎，皮脂腺病，Summerskill症候群，血小板減少症，酪氨酸血 症，靜脈曲張性出血，肝臟靜脈閉合疾病，和肝豆狀核變性及其組合。參照下面的詳細說明完成其它的主題對本領域的技術人員而言是已知的。附圖的簡要描述圖Ia和Ib顯示了暖局部缺血對具有小核和大核的分離細胞的比率的影響。圖2a和2b顯示了對造血細胞中截短的甲胎蛋白(AFP)的PCR分析。圖3顯示了在-170°C的貯存時間與復甦的胎兒肝細胞活力之間的關係。圖4a和4b顯示了以螢光激活的細胞分選(FACS)分析的胎兒肝細胞懸液的典型
單變量直方圖。圖5顯示了在未分離的肝細胞懸液中表達表面標記⑶14，⑶34，⑶38，⑶45和血 型糖蛋白A(GA)的細胞的百分數。圖6顯示了在原始細胞懸液中表達甲胎蛋白和其它抗原標記的細胞百分數。圖7a，7b和7c顯示了在排除紅血細胞之前和之後的甲胎蛋白表達。圖8￡1，8比8(3，8(1，86和8€顯示了胎兒肝細胞懸液中0)14，CD38和AFP共表達的 FACS分析。圖9顯示了 AFP-陽性細胞的⑶14和⑶38富集。

圖10a，10b, IOc和IOd顯示了人肝臟祖細胞的螢光顯微鏡檢。圖11a，11b，Ilc和Ild顯示了用表達AFP選擇的代表性細胞。圖12a，12b和12c顯示了在該視野中有兩個AFP陽性細胞。圖13a和13b顯示了用鈣黃綠素㈧標記的細胞以顯示所有細胞類型。本發明的詳細描述
在下面的描述中，使用了許多術語廣泛描述了本發明。為了提供對說明書和權利 要求書的清楚和一致的理解，提供了下列定義。甲胎蛋白樣免疫反應性由甲胎蛋白引起的任何免疫反應。甲胎蛋白由mRNA的變 異體形式產生，其中一些變異體是肝臟祖細胞所特有的且有些是造血祖細胞所特有的。定向祖細胞具有單一命運的未成熟細胞，例如肝細胞定向祖細胞(產生肝細胞) 或膽定向祖細胞(產生膽管)。定向過程在分子水平上尚不清楚。而且，認為當細胞命運從 其祖先命運變窄時僅以經驗發生該定向過程。肝細胞肝臟細胞的亞群體，包括肝細胞和膽細胞。肝臟細胞本文使用的術語「肝臟細胞」是指正常肝臟中存在的所有類型的細胞， 不論其起源或命運。幹細胞本文所用的術語「幹細胞」是指可產生具有一種以上命運的子代細胞的未 成熟細胞。一些子代細胞與親代相同且一些「定型」為一種特定的命運。全能幹細胞具有 自我更新(自我維持)能力，而定向幹細胞的自我更新能力有問題。幹細胞在再生性增殖 過程期間更新。肝祖細胞這些細胞產生肝細胞和膽細胞。肝祖細胞包括三種亞群體「肝幹細 胞」，「定向肝細胞的祖細胞」，和「定向膽祖細胞」，後兩種細胞是未成熟細胞，它們是肝幹細 胞的後代且具有單一命運，即或者肝細胞或者膽細胞，而不是兩者。肝幹細胞肝祖細胞的一種亞群體。肝臟祖細胞一種來自肝臟的細胞群體，包括肝祖細胞，造血祖細胞和問充質祖細 胞。卵形細胞具有卵形核的小細胞(< 15微米)，在動物接觸致癌損傷時增殖。據 認為這些細胞來源於肝臟祖細胞且部分或完全轉化。「肝臟」是位於腹部最前部位的大型器官，安置在腹腔和胸腔之間的肌肉隔膜上。 肝臟是生命所必需的且完成100種以上的重要功能，例如解毒毒物和藥物，代謝脂肪，存儲 糖類，生產膽汁，血漿蛋白和其它物質，並輔助凝血。肝臟疾病通常難以檢測，直到形成嚴重 疾病，因為存在過多的肝臟組織，且肝臟能部分自我再生。肝臟疾病的徵兆隨損害的程度和 位置而變化。各種血液化驗對發現肝臟損傷的程度和性質是必須的。本文使用的術語「生長因子」是指調節發育事件所需的或者調節編碼可參與細胞 通信和發育協調的其它分泌蛋白的基因表達所需的那些因子，且包括但不限於肝細胞生長 因子(HGF)，胰島素樣生長因子-I和IKIGF-I和II)，表皮生長因子(EGF)，a型和b型轉 化生長因子(TGF-α和TGF-β)，種經生長因子(NGF)，成纖維細胞生長因子(FGF)，血小板 衍生生長因子(PDGF)，肉瘤生長因子(SGF)，粒細胞巨噬細胞集落刺激生長因子(GM-CSF)， 血管內皮生長因子(VEGF)，催乳激素和生長激素釋放因子(GHRF)和各種造血生長因子，例 如白介素(IL)IL-I, IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-T, IL-8，IL-10，IL-11，等，紅細胞分 化因子(EDF)或促卵泡激素釋放蛋白(FRP)，抑制素，幹細胞增殖因子(SCPF)及這些蛋白質 的活性片斷，亞基，衍生物和其組合等本領域已知的許多其它因子。一般來說，下文所用的 生長因子是指選自細胞因子，淋巴因子，自介素，集落刺激因子，激素，趨化因子，抗趨化因 子，凝血因子，溶栓蛋白，補體蛋白，酶，免疫球蛋白和抗原的分泌蛋白。血細胞生成產生具有淋巴細胞(B和T)，血小板，巨噬細胞，嗜中性白細胞和粒細
11胞的細胞命運的血細胞。間充質形成產生具有內皮細胞，脂肪細胞，基質細胞，軟骨細胞，甚至骨細胞的細 胞命運的間充質衍生物(僅在疾病裝態下在肝臟中出現後兩種)。細胞治療本文所用的術語「細胞治療」是指體內或離開體內轉移限定的細胞群體 用作自身或同種異體材料並移植到患者特定靶細胞或其附近。細胞可在任何合適的的培養 基，載體或稀釋劑，或者包括微載體，珠，微粒體，微球體，囊泡等的任何類型的藥物傳遞系 統中移植。基因治療本文所用的術語「基因治療」是指將確定的遺傳材料體內或離開體內轉 移到需要它的患者的特定靶細胞，從而改變基因型，且在大多數情況下，改變那些靶細胞的 表型達到預防或改變特定疾病狀態的最終目的。按照這一定義規定，隱含的前提是設計這 些治療性遺傳操作最終預防，治療或改變明顯的或隱蔽的病理學狀態。在大多數情況下，基 因治療操作的最終治療目的是改變特定靶細胞群體的表型。CD: 「分化簇」或「共有決定簇」在本文中用於指被單克隆抗體識別的細胞表面分 子。一些⑶s的表達對於特定譜系或成熟途徑的細胞是特異性的，其它⑶的表達根據激活 的狀態，位置，或相同細胞的分化而變化。倍性；細胞內的染色體數。二倍體每個細胞兩組染色體。四倍體每個細胞4組染色體。八倍體每個細胞8組染色體。多倍體每個細胞有兩組以上的染色體。正常胎兒或新生兒肝臟的細胞是二倍體。到青年時期，肝臟是二倍體和多倍體細 胞的混合物。在嚙齒類中，肝臟大約90%是多倍體且僅有大約10%是二倍體細胞。在人類， 青年人的肝臟由大約50%的二倍體和50%的多倍體細胞組成。不限於肝臟，本發明公開並要求保護來自各種屍體組織的其它祖細胞。下文所用 的術語「屍體組織」不包括來自經過手術方法以諸如成熟前終止妊娠的方式獲得的死亡胎 兒的組織。以自然或協助分娩生產的人類認為是新生兒或嬰兒而不是胎兒。因此，人類的 年齡在分娩或生產時開始為「0」，而不是從受孕的開始。因此在分娩時死亡的新生兒認為是 屍體而不是胎兒。剛獲得的胎兒組織已被用作一些祖細胞的來源且因此它們被排除在本發 明的權利要求的範圍之外。然而，由於推測的局部缺血效應而被認為不適合於進一步的醫 療用途的胎兒組織仍然適合於本發明的目的。當在本說明書中使用術語「一」時，是指「至少一個」或「一個或多個」，除非另有說明。圖2a和2b顯示了在造血細胞中截短的AFP的PCR分析。使用引物組合hAFPl， hAFP2，hAFP3，和hAFP4進行RT-PCR。泳道1-3相應於H印3B-細胞；泳道10-12相應於STO 細胞；泳道13-15沒有RNA或cDNA。注意，在泳道2，5，和8中有一條共有帶，即截短的AFP 同種型。在泳道1和4中明顯有一條肝臟細胞特有的截短的AFP同種型。在泳道3和6中 觀察到完整的AFP種類。圖3顯示了在-170°C下貯存時間與復甦的胎兒肝臟細胞活力之間的關係。數據表 示為在處理時與復甦時測量的活力的改變百分數。這些數據表示冷藏方法不明顯影響細胞
12的活力。貯存時間延長到550天時活力無明顯改變。圖4a和4b顯示了以螢光激活細胞分選法(FACS)分析的胎兒肝臟細胞懸液的典 型單變量直方圖。製備細胞懸液用於免疫螢光分析，使用與紅色染料，Cy5偶連的抗體分析 甲胎蛋白(AFP)，使用偶連到藍色染料(AMCA)上的抗體分析白蛋白。篩選了 3萬個細胞的 紅色(AFP)和藍色(白蛋白)螢光。結果顯示了清楚的各蛋白質陽性的細胞組。進一步分 析表明大約80%的各蛋白質的陽性群體是相同的細胞(即，共表達兩種蛋白質)。圖5顯示了在未分離的肝臟細胞懸液中表達表面標記⑶14，⑶34，⑶38，⑶45和 血型糖蛋白A(GA)的細胞的百分數。注意GA數據在右軸上繪圖以保護刻度。圖6顯示了在原始細胞懸液中表達甲胎蛋白和其它抗原標記的細胞百分數。平均 值士SFM表示甲胎蛋白(AFP)和特異性細胞表面標記(⑶14，34，38，45和血型糖蛋白A) 陽性的細胞百分數。圖7a，7b和7c顯示了去掉紅血細胞之前和之後的甲胎蛋白表達。圖7a顯示了使 用Percoll分離法選擇性去掉紅細胞或者沒有去掉紅細胞的胎兒肝臟細胞懸液中的甲胎 蛋白的表達且圖7b顯示了白蛋白的表達。圖7c顯示了表達甲胎蛋白和白蛋白兩者的細胞 比例，表示為AFP或白蛋白陽性細胞百分數。顯示了使用Percoll分離法去掉紅細胞的細 胞的數據。圖8 813，8(3，8(1，86和8€顯示了胎兒肝臟細胞懸液0)14，CD38和AFP共表達的 FACS分析。雙變量散點圖(8a)顯示了 Tricolor染色的⑶14(縱坐標)與FITC染色的 ⑶38 (橫坐標)的分布。根據⑶14和⑶38信號產生通道以選擇特異性細胞分組。然後用 於顯示各亞組中AFP染色的強度(圖8b，8c，8d和8e)。AFP結果表明通過選擇⑶38或者 ⑶14陽性的細胞產生了 AFP的高水平富集。全部細胞懸液(30，000個細胞)產生的AFP信 號在圖8f中顯示。圖9顯示了 AFP-陽性細胞的⑶14和⑶38富集。通過選擇具有陽性表面標記的 細胞的標記CD38和CD14可顯著增大從胎兒肝臟製備的細胞懸液中AFP-陽性細胞的比例。 兩種標記的組合產生的含有AFP的細胞的富集比用單一標記獲得的富集明顯更好。圖10a，10b, IOc和IOd顯示了人肝祖細胞的螢光顯微鏡檢。來自胎兒肝臟的代表性肝祖細胞的AFP成分被染色。細胞大小表示同時存在早期 的祖細胞和更進化的肝祖細胞。圖11a，11b，Ilc和Ild顯示了以表達AFP選擇的代表性細胞。⑶14染色陽性的細 胞(lib和lid)是成肝細胞的特徵。表面標記染色陰性的細胞(圖Ila和lie)較小且大 小和形態與早期肝祖細胞一致。圖12a到12c是相同的視野且顯示了在該視野中有兩個AFP陽性細胞。圖12a顯 示了一個聚焦相的圖像。圖12b顯示了用AFP抗體的免疫螢光。圖12c顯示了(a)和(b) 的覆蓋圖，顯示了在肝臟細胞組中AFP陽性細胞的形態學。發現不論從胎兒還是從成年肝 髒中分離的AFP陽性細胞都具有相似的細胞大小和形態學。圖13a和13b顯示了用鈣黃綠素標記的細胞(a)以顯示所有細胞類型。圖13(b) 由共表達AFP的相同細胞組成並顯示了只有兩個細胞為AFP-陽性。細胞大小不是AFP陽 性的要素。肝臟的再生能力是廣泛公認的，且通常通過正常情況下增殖靜息的肝細胞進入細胞周期來實現這點。然而，當肝細胞再生受損時，小膽管增生並侵入相鄰的肝細胞實質中。 在人類和實驗動物中，這些管細胞稱為卵形細胞，其與缺陷型再生的聯繫導致相信它們是 轉化的幹細胞或祖細胞。這些細胞具有極大的生物學益處，因為其正常相應細胞，即肝祖細 胞可用作肝臟移植的替代選擇且它們也可用作基因治療以矯正先天性代謝錯誤的載體。盡 管已經明確地證實了祖細胞分化成肝細胞的能力，但是由於供體肝臟組織的缺乏，對所述 細胞的要求還不能滿足所需的供應。正如本文所公開的，從人屍體肝臟分離肝臟祖細胞是新的且是意想不到的，因為 本領域流行的觀點是由於局部缺血肝臟喪失了其實用性。通過應用本發明人首次用於從屍體獲得本發明的獨特細胞群體的獨特方法，標記 和參數的組合獲得了從本文所述的屍體供體分離人肝祖細胞。甲胎蛋白和白蛋白這兩種胞質蛋白質認為是肝細胞譜系特別可靠的標記。它們已 成為從肝臟中的其它細胞類型鑑定肝細胞亞群體的策略的基礎。在肝細胞的鑑定中兩者都 是關鍵性嚮導，但甲胎蛋白尤其是在經過流式細胞術純化後的肝祖細胞的鑑定特徵。甲胎 蛋白，即AFP也已經被用於在任何類型的分離策略後評估肝祖細胞的純度。然而，在證實這兩種標記在鑑定肝細胞譜系中的有效性的嚴格對照中，進行了 PCR 分析以檢測在肝臟組織中已知的多種細胞類型中的表達。PCR分析是檢測即使微量的特定 mRNA種類的表達時最敏感的測定法。本文公開的本發明證實了在造血祖細胞中可發現AFP 和白蛋白兩者mRNA的具體同種型意味著當使用該敏感測定法時，必須使用其它標準，例如 使用AFP的外顯子1探針用於從造血細胞群體限定肝細胞。儘管PCR分析揭示了造血祖細 胞可表達AFP和白蛋白mRNA種類，但mRNA表達水平極低。事實上，當在蛋白質水平上測量 AFP和白蛋白時，在造血祖細胞中不致發現可檢測的AFP或白蛋白。因此，對於常規蛋白測 定法(免疫螢光，Western印跡等)和高水平表達mRNA的測定法(Northern印跡)，AFP和 白蛋白仍然是確定肝細胞譜系的有價值的標記。本發明還公開了 RT-PCR特異性引物的設計和製備以測定肝細胞與造血細胞群體 中AFP mRNA同種型的表達方式。人AFP RT-PCR引物的三種不同組合用於區別肝細胞和造 血細胞譜系中AFP mRNA的表達。為了檢測造血細胞中AFP的表達，如實施例1所舉例，本 發明人篩選了肝細胞與造血細胞來源的一些細胞系中AFP的完全與截短形式。在這些試驗 中使用RT-PCR，它是已知鑑定特定RNA模板時最敏感的技術。迄今的數據表明人AFP在來 自肝祖細胞的兩個人細胞系(HepG2和H印3B)中以完全形式存在，在來自造血祖細胞的人 細胞系K562中以截短形式存在。外顯子1是肝祖細胞亞群體所特有的事實使得人們能夠 使用它作為鑑定肝細胞與造血祖細胞類型的探針。該試驗用於鑑定本發明的肝臟祖細胞中 的特定亞群體。因此，為了檢測肝臟祖細胞中人AFP mRNA的存在，本發明人設計了 9個PCR引物。 所有的引物組合檢測人肝細胞系H印G2和H印3B中的AFP mRNA。然而，除了用於全長hAFP mRNA的一個外所有的引物組合在人紅白血病細胞系K562中都擴增AFP mRNA的部分。如 上推測，這證實了在K562中表達AFP的一種截短形式，而不是全長形式。該結果表明鑑定 肝細胞的有用引物僅僅是檢測全長AFP的那些引物，更多證明其表達以組織特異性方式受 到限制。篩選肝細胞與造血細胞來源的一些細胞系和原始組織中AFP的完全與截短形式。 儘管在一些造血組織中發現了 AFP的截短形式，但組織中哪一種細胞類型表達它仍是未知的。由於在造血細胞的一些亞群體中發現了 AFP的截短形式，所以也分析了肝細胞和 造血細胞中的白蛋白。白蛋白的引物以類似於AFP(見上文)的方式形成並用於評估肝細 胞與造血細胞系中白蛋白的表達(見圖4)。對於AFP，在造血細胞系K562中發現了一種截 短的形式，一種可被外顯子12-14的引物檢測的轉錄子。在本文所述的研究之前，在關於造血祖細胞的大量文獻中，沒有一個曾報導在人 的正常造血祖細胞中成熟的或截矩的AFP或白蛋白的表達。人肝臟祖細胞的處理和冷藏為了最理想地從胎兒或成年肝臟產生分離的人肝臟祖細胞，本文公開的方案使用 密度梯度的上面部分並去掉沉澱。本文所公開的密度梯度離心的新變化是棄去沉澱並保留 具有低浮力密度的細胞(即在梯度頂部收集的細胞)並用於進一步研究。本發明人發現了 在Percoll密度梯度內或其頂部存在年幼的細胞(S卩，二倍體)和對於冷藏更健康的細胞。本文所述的培養方法學是特有的且被進一步改良用於人和/或嚙齒類肝臟細胞。 另外，培養基可包括用純化的細胞外基質成分包裹的可生物降解珠，然後可用於接種結合 到珠上的細胞以用於生物反應器。本發明的冷藏方法學是特有的且不同於現有技術中使用的方法。主要區別是由於 使用了不同的緩衝液且冷藏包括祖細胞群體的二倍體肝細胞群體，該細胞密度低，因此在 梯度離心中上浮。成熟的人肝臟細胞的成功冷藏是非常需要的，但在本領域中從未實現。一般來說， 成功冷藏定義為在液氮溫度(-160°C到180°C)下冷凍細胞，然後復甦它們並獲得>75%的 活力的能力且具有附著到培養皿上的能力。任何來源的細胞系，例如精子和卵子和來自胎 兒組織的細胞可在含水緩衝液(即，諸如DME，DulbeCC0’s改良的Eagle's培養基，或RPMI 1640的培養基)並補充10%血清+冷凍保護劑(最常見的是二甲基亞碸DMS0)中成功冷 凍並在復甦時70-90%有活力且具有極好的貼壁能力。本發明的特殊冷藏方法學通過使用新緩衝液，新細胞群體和包括以細胞外基質的 形式包埋細胞的改變來實現。該方法學首次實現了復甦時的活力與冷凍前細胞分散後立即 測量的活力沒有不同(參見圖3)。實際活力由於到達時組織的狀況而可變，在本試驗中胎 兒屍體肝臟細胞平均為77%。該冷藏方法學導致冷凍過程後的活力和復甦後離開體內的可 貼壁和增殖的細胞不明顯損失。細胞標記和流式細胞術使用我們現在的定義，即肝臟祖細胞是表達甲胎蛋白且表達或不表達白蛋白的未 成熟細胞群體，評價了特異性選擇這些細胞的標記。一個令人驚奇的發現是許多作為造血 祖細胞傳統標記的標記(即CD34)也可鑑定肝祖細胞亞群體。因此，對CD34的單一顏色分 選導致明顯富集(至少9-倍)表達AFP的細胞。然而，不是所有的這些AFP陽性細胞都被 證實是肝祖細胞。根據白蛋白陽性的百分數，大約80-90%的細胞是肝祖細胞，其它是未成 熟以致尚未表達白蛋白的肝祖細胞或者可能是表達甲胎蛋白的造血亞群體。本發明使用了獨特的流式細胞分選策略。使用AFP和白蛋白表達的組合作為肝祖 細胞的兩個獨特限定特徵，鑑定了限定肝祖細胞的抗原標記和其它流式細胞術參數。目前 的分選策略包括分選小細胞(通過前向散射測量為< 15微米)，它是二倍體(使用Hoechst染料33342產生的螢光)，側面散射無顆粒，且對某些造血細胞抗原(即血型糖蛋白A，紅血 細胞抗原和CD45)為陰性，接著是肝細胞亞群體和造血細胞亞群體共有的標記(即CD14和 /或⑶38)為陽性。在本文所述的實驗中，本發明人通過分選高度表達甲胎蛋白，表達已知是特異性 造血幹細胞標記的CD34，和任選微弱表達白蛋白的那些細胞來鑑定肝祖細胞。本文還描述 了造血細胞也可表達AFP，儘管是一種截短形式的證據。本發明人描述了一種新細胞群體和 分離、鑑定、培養的方法，以及使用該細胞群體的方法。本發明的特定細胞群體的分離、鑑定 和培養的成功部分通過先進的分離方法，親和壓實，具有更大速度和精確度的高速螢光激 活細胞分選，和改進的冷藏和培養技術實現。設計流式細胞分選策略從新分離的細胞懸液或從復甦的冷藏肝臟細胞中純化肝 髒祖細胞，它包括1)用一些抗特異性細胞表面標記的螢光探針標記的抗體染色細胞和2) 在多參數流式細胞技術中使用陰性和陽性分選的聯合。從人肝細胞群體純化特定譜系階段 的方法可用於來自任何年齡供體的肝臟，因為該標記似乎是譜系-位置特異性的。改進的標記細胞的方法，和相對於過去使用的流式細胞儀(Becton Dickenson' s FACSTAR PLUS,以2000-6000個細胞/秒分選細胞且進行2_4種顏色分選)顯著改進的流 式細胞儀(來自Cytomation的「aMoFlo」流式細胞儀，以40，000個細胞/秒分選細胞且進 行8種顏色分選)幫助成功分離，和鑑定了這一新的細胞群體。在細胞懸液中完全確定了 AFP和白蛋白樣免疫反應性的表達，有清楚的一群細胞 與背景信號表現出明顯的區別(圖6)。在未分離的細胞懸液中6. 9士0.86%的細胞表達甲 胎蛋白，而在7.7士 1. 中存在白蛋白。在AFP陽性細胞中，75. 6士4. 9%共表達白蛋白，而 80 士 5. 5 %的白蛋白陽性細胞也表達AFP。因此，大約25 %的表達甲胎蛋白的細胞不表達白 蛋白且20 %的表達白蛋白的細胞不表達甲胎蛋白。完全細胞懸液(即包括紅細胞)中帶有本研究中使用的原則性表面標記的細胞比 例在表1中顯示(其中GA是血型勝蛋白A，紅血細胞上的一種表面標記)表1 原始肝臟細胞懸液中CD陽性群體的百分數和AFP陽性的百分數CD14CD34CD38CD45GA未分離的懸液佔群體％ 3. 7士0.8(8) 2. 8士0.5 2. 2士0.4 2. 6士0.5 36. 8士5AFP 陽性％ 81. 7士2. 2 72. 6士4. 2 57. 6士4. 6 22. 2士4. 4 2. 3士0.6很明顯，血型糖蛋白A(GA)陽性細胞(即紅細胞)是細胞群體的主要組分，但 AFP-陽性細胞是微小部分。因此，當通過Percoll分離法去掉細胞懸液中的紅細胞時，表 達AFP的細胞比例顯著增加到12. 9士 1.9%且表達白蛋白的那些細胞增加到12. 1 士2. 3%。 共表達白蛋白的AFP陽性細胞百分數也增加到80. 5+8. 2%且共表達AFP的白蛋白陽性細胞 比例增加到89+3. 1%，儘管沒有統計學上顯著的改變。該操作對攜帶表面標記的細胞比例 的結果與顯示AFP染色陽性的各亞組的比例一起在表2中顯示。表2 去掉紅細胞後肝臟細胞懸液中CD陽性群體的百分數和AFP陽性的細胞百分 數CD14CD34CD38CD45GA去掉紅細胞
% 佔群體 7. 4 士 1.3 3. 4 士 0.5 4. 8 士 0.9 8. 2 士 0. 3 27. 5 士 4. 7% AFP 陽性 89. 8士 1.3 77. 1 士2. 9 53. 5士7. 2 32. 5士 1.3 1.8士0.9在大多數情況下，在以細胞表面標記選擇的亞組中AFP的存在連續分布，顯示出 染色強度在陽性範圍內的細胞明顯佔優勢。然而，對於共表達AFP的CD38陽性細胞的分布 是獨特的。在⑶38-陽性細胞中，AFP共表達明顯呈雙峰分布，其中明顯有兩個不同組的細 胞，一個為AFP陽性組，另一個為陰性。這點在圖8a中顯示，它顯示了表達CD14和CD38的 染色細胞的散點圖以及在CD14和/或CD38陽性細胞中甲胎蛋白表達的單變量直方圖。結果表明甲胎蛋白(AFP)在胎兒肝臟組織的單細胞懸液(即原始細胞懸液)中 的7%的細胞中存在。發現抗血型糖蛋白A(在紅血細胞，即紅細胞上的一種抗原)的抗體 鑑定出不表達AFP的細胞亞群體。因此，從打算鑑定肝祖細胞的細胞中排除表達該抗原的 細胞(即，紅細胞)。CD38抗原鑑定了一群細胞，它們表現出AFP陽性細胞的比例顯著提高 (即，比未分離樣品中的比例高7倍)。兩種抗原都具有許多同種型，取決於是否有剪接變 異體編碼的分子片斷存在。鑑定各種同種型的抗體是可獲得的。造血祖細胞的傳統標記，即⑶34存在於許多也表達AFP的細胞上。⑶34陽性細 胞的分選導致AFP陽性細胞的富集比原始細胞懸液中發現的高至少9倍(在CD34-陽性細 胞中的67%與在原始細胞懸液中的7% )。然而，富集AFP陽性細胞最有效的單一抗體是 ⑶14，它導致這些細胞的比例比原始群體增加11倍(81%相對於7%)。因此，通過使用表面標記的組合提高了 AFP陽性細胞的產率。因此，測定AFP與表 面標記的選定組合共表達的程度以建立增加細胞內標記的選擇程度。該數據表示為表達表 面標記的AFP陽性細胞的比例(稱為AFP陽性細胞的「產率」)和在表面標記限定的群體中 出現的所有AFP陽性細胞的比例(稱為AFP陽性細胞的「富集」係數)。⑶14，⑶34與⑶38 組合的結果以及用於比較的單個結果在表3中表示。表3.CD14CD34CD38CD14 士 CD38 CD14 士 CD34富集 80. 6 士 2. 6 66. 7 士 4. 7 53. 8 士 4. 5 66. 9 士 3. 5 68. 2 士 3. 9產率39. 8 士 2. 6 26. 9 士4. 4 22. 0 士 2. 7 50. 6 士 2. 7 52. 2 士 5. 5富集表達任一(或兩種)表面標記且同時為AFP陽性的細胞百分數。產率同時表達一種或兩種表面標記組合的AFP陽性細胞百分數。對於⑶14/⑶38標記組合的這些數據還顯示在圖9中。AFP染色陽性的細胞形態學是可變的且包含來自胎兒肝臟而不是成人肝臟的細胞 懸液中的細胞大小和形狀的全部範圍。最大的AFP-陽性細胞大約12-15微米，比大小範圍 為20-50微米的成熟肝細胞小得多。這點在圖10中顯示，該圖顯示了一些AFP-陽性細胞 選擇表達特異性抗體。在所有情況下一定比例的AFP-陽性細胞顯示出不表達在本研究中使用的任何表 面抗體。這些AFP陽性「裸」細胞的外觀在圖Ila和Ilc中表示，其中將它們與從相同懸液 分選的⑶14陽性/AFP陽性細胞的外觀(圖lib和lid)進行了比較。圖Ila和lib是微 分幹涉相差顯微鏡照片，圖Ilc和Ild是AFP免疫螢光。很明顯儘管兩種細胞類型都是AFP 陽性，但表面抗原染色陰性的細胞比CD14陽性細胞更小且複雜度更低。總之，分選肝祖細胞的標記是血型糖蛋白A_，⑶45_，ICAM+,⑶14+和/或⑶38+，或
17者除了 ICAM+外所有這些標記都無，且是二倍體，無顆粒(側向散射)，不超過15微米(前 向散射)。這些分選細胞的表型是小細胞(< 15微米)，細胞質較小(核/胞質比率高)， 白蛋白和/或AFP』」。該細胞的形態學見圖10-12。胎兒和成人肝臟中表達甲胎蛋白的細胞的聚焦鑑定使用聚焦顯微鏡以獲得表達甲胎蛋白的人胎兒，小兒，或成人細胞的圖像。該方法 學允許現察這些細胞的形態學和大小並直接顯示諸如AFP和ALB的細胞內蛋白的位置和諸 如CD34和CD38的膜表面標記的位置。表達AFP的細胞在胎兒，小兒，和成人肝臟中都有發 現(圖12a)。正如預期，胎兒肝臟具有最高百分數(6-7% )而成人肝臟具有小百分數(青 年< 4% )且在中年人中隨年齡減少到< 1%。在年齡超過57歲的供體肝臟中沒有發現表 達AFP的細胞。通過Percoll分離過程顯著富集在屍體肝臟中發現的少量肝祖細胞使得在 供體肝臟的Percoll餾分1和2中得到2%的細胞(表4)。表4顯示了來自Percoll-添加緩衝液的餾分的細胞大小和活力。在相同條件下 分離後較小的細胞(餾分1-3)比較大的細胞(餾分4)具有更高的活力。表4
Percoll
餾分活力(％ )細胞大小(μπι)%AFP+細胞
餾分182< 120. 5-1%
餾分28410-152%
餾分38515-25< 0. 2%
餾分45625-50< 0. 01%
這些結果表明優選用於肝臟細胞治療以及器官移植的供體器官包括來自年齡達
到45歲的青年供體的器官且該肝臟優選從心跳停止的前30小時內分離。來自老年病人 (年齡> 71歲)的肝臟對於細胞治療且也許對於完全器官移植，特別是對於兒童不是合適 的供體，因為它們具有較小(如果有的話)的來自肝祖細胞的再生能力且僅具有最小的已 知從成熟細胞獲得的再生能力。成熟譜系本發明的發明人顯示了局部缺血損傷的肝臟含有在正常和疾病狀態下都能生長 並分化成肝細胞和膽細胞的肝祖細胞群體。本發明支持了這樣的觀點，即肝臟譜系中的每 一位置是不同的成熟階段且在肝臟中有多種幹細胞群體。令人驚奇的是本發明的肝臟提供了 3種不同的成熟譜系一種負責肝生成，產生 肝臟組織且具有肝細胞和膽細胞(膽管)的細胞命運；另一種負責造血，產生血細胞，具有 淋巴細胞(B和T)，血小板，巨噬細胞，嗜中性白細胞和粒細胞的細胞命運；第三種負責間充 質形成，產生間充質衍生物且具有內皮細胞，脂肪細胞，基質細胞，軟骨細胞，甚至是骨細胞 的細胞命運。本發明分離的細胞群體具有作為成功地肝臟定向細胞治療和/或基因治療的巨 大潛力。如實施例所述，本發明在非人靈長類以及人肝祖細胞可成功進行細胞培養和維持 同時仍保留其完全分化或成熟的能力的條件鑑定方面取得了巨大進展。按照本文公開的教 導，可以從屍體分離並在培養基中維持未分化的肝祖細胞，然後更換成分化相關培養基用 於移植。
由於其明顯的體外擴增能力，本發明的細胞群體相似於造血譜系中的細胞，可用 作細胞種子用於離開體內的擴增。這可消除對病人肝臟的主要侵入性手術切除術的必要 性。一旦在培養基中建立人肝祖細胞，可進行基因轉移。這可用許多不同基因傳遞載 體系統來實現(見下文提供的實施例)。在這點上的一個重要考慮因素是一些形式的基因 轉移需要迅速生長的細胞，由於本發明的人二倍體細胞和/或祖細胞在正常生理學條件下 有效分裂，因此這些細胞是將基因轉移進肝臟的理想候選者。另外，本發明的細胞群體的生 長特徵允許用於離開體內的基因轉移，其中使用的某些基因傳遞病毒載體需要細胞增殖以 便有效插入和表達基因。本發明的祖細胞群體也適合於自體或同種異體肝臟定向細胞或基因治療。很明 顯，使用自體肝祖細胞可消除有關移植細胞排斥的重要顧慮。本發明的細胞群體對於同種 異體細胞轉移特別有吸引力，因為其抗原分布情況表明它具有最小的免疫排斥現象。而且， 已知具有高度免疫原性的諸如血細胞，內皮細胞，肝巨噬細胞的其它細胞成分通過該純化 過程基本上被剔除。一旦分離和純化了該自體或同種異體肝祖細胞，可對它們進行遺傳修飾或原樣使 用，如果需要可進行增殖，然後移植回宿主。如果需要遺傳修飾，在遺傳修飾後和移植前，可 擴增那些遺傳修飾的細胞和/或根據顯性選擇標記的插入和表達進行選擇。可移植回肝室 或異位位點。為了移植進肝室中，可使用門靜脈輸注或脾內注射。脾內注射是可選擇的施 用途徑，因為經脾內注射移植的大多數肝祖細胞可移動進肝臟。一旦在肝室中，移植的，遺 傳修飾的肝祖細胞成熟成正常肝細胞形態學。另一醫學方法可促進移植的肝祖細胞移入肝的效力。動物模型證實在部分肝切除 術中，施用血管形成因子和其它生長因子幫助移植的肝細胞移入和有活力。一個替代方法 是將遺傳修飾的肝細胞移植進異位位點。至今對於肝臟的細胞治療方法僅顯示出平常的效力。這可能是由於這樣的事實， 即使用的供體細胞主要是成人肝臟細胞且分離和再注射後壽命短。另外，使用成人細胞導 致強烈的免疫排斥。在本案例中，肝祖細胞提供了更大的效力，因為其誘發免疫學排斥現象 的能力有限且因為它們具有廣泛的再生潛力。對於基因治療，正在進行的努力使用了「定向可注射載體」，它是開發中的用於臨 床治療的最流行途徑。這些方法的效力有限，因為免疫學問題和載體的瞬時表達都存在。用 祖細胞進行離開體內的基因治療(或者使用可注射載體以某種方式靶向那些祖細胞群體) 可證實更有效，因為該載體可導入離開體內的祖細胞的純化亞群體；選擇修飾的細胞並重 新導入體內。祖細胞的優勢是它們有巨大的擴增潛力，最小的免疫反應誘導力(如果有的 話)，和分化產生全部譜系的成熟細胞的能力。共同或相互依賴的譜系改進的方法學使得本發明人能夠更嚴密地研究和鑑定肝祖細胞。這些研究揭示了 肝祖細胞與造血祖細胞之間特別密切的關係，表明這兩個譜系之間有近親關係。事實上，這 些研究表明肝祖細胞和造血譜系共有許多抗原標記(⑶14，⑶34，⑶38，c-kit，卵形細胞抗 原)，共有生化特性(即，轉鐵蛋白，穀胱甘肽-S-轉移酶，和甲胎蛋白的截短同種型)，且在 用於離開體內的擴增的培養要求(細胞外基質的形式和特定激素要求)上有廣泛的重疊。兩個譜系的祖細胞位於肝臟腺泡內的相同位點。最後，兩個成熟譜系的細胞中存在旁分泌 信號；它是由各譜系產生的調節另一譜系的細胞的信號。事實上，可推斷在肝細胞和造血細 胞之間有一個共同的譜系或至少是相互依賴的譜系。可純化本文公開的細胞群體並用於根據細胞的分離和培養條件產生骨髓造血細 胞或肝細胞衍生物。因此，如果細胞被再導入體內進入血液中，它們可有效地產生骨髓造血 細胞衍生物；如果被導入肝臟，它們會產生肝臟細胞。在離開體內維持的細胞中應出現相似 的現象。因此，用同時限定肝和造血祖細胞的一組抗原(即，⑶38+，c-kit+，⑶45_)分選的 細胞群體接種的生物反應器系統可導致細胞群體具有多種命運。本發明的細胞群體的另一重要方面是群體中的一些細胞展示出特異性的祖細胞 表面抗原⑶34。⑶34已被用作骨髓造血幹細胞的方便的陽性選擇標記。本文公開的本發 明顯示了純化任何祖細胞群體的更好方法，例如隨後可用於臨床和臨床前期程序的造血和 肝祖細胞群體。人肝祖細胞的用途有許多且變化多樣。它們包括1)對人細胞的研究；2)產生疫 苗或抗病毒劑；3)毒理學研究；4)藥品開發；5)蛋白質生產(使用該細胞作為各種人特異 性因子的宿主)；6)肝臟細胞治療7)肝臟基因治療；8)可用於研究，毒理學和抗微生物試 驗，蛋白質生產，或者臨床上用作肝臟輔助系統的人造生物肝臟。考慮到正如本發明的發明 人所預言的，在造血和肝生成之間有共同譜系的可能性，相同的細胞可同時適合於肝細胞 或者造血細胞命運，這取決於它們所放置的微環境。高度純化的人肝祖細胞的可獲得性允許對人細胞進行更加廣泛的研究，且肯定會 幫助建立肝臟細胞治療和基因治療的成功方式，並允許建立人的人造生物肝臟用於研究和 作為臨床輔助裝置。目前，健康人體組織的供應有限妨礙了在肝臟細胞治療或人的人造生 物肝臟中的臨床計劃。從屍體獲得的包括其祖細胞群體的二倍體細胞具有足夠的擴增潛力 以極大地緩解這種有限的供應。下面的實施例是舉例性的且不打算進行限制性。實施例來自屍體的肝臟獲取來自屍體的肝臟經門靜脈，腔靜脈，或兩者插入導管，用緩衝液灌流以清除血液； 然後用含有膠原酶/蛋白酶的緩衝液灌流以酶促解離細胞。根據肝臟的大小通常進行 15-30分鐘的消化後，將組織擠壓通過乾酪包布或尼龍濾膜或用梳子耙過以機械完成細胞 解離過程。用含有血清的緩衝液清洗解離的細胞以滅活膠原酶和在灌流過程中使用的其它 酶。灌流緩衝液Pl和P2放在37°C水浴中。在Miller型灌流盒中進行灌流，該灌流 盒在整個灌流過程中維持在37°C。灌流期間給緩衝液充氧。盒中的所有管道用70%的 乙醇清洗，接著用蒸餾水清洗，然後用Pl清洗以保證從系統中去掉空氣。對於大塊肝臟 (100-300g)使用在肝臟的切口表面可利用的各種血管，使用配置在60ml注射器上的16號 針頭的Teflon插管進行肝臟插管以便用冰冷的Pl緩衝液流過肝臟。對於可獲得完整肝葉 的情況，可對殘留的腔靜脈做插管。試驗大塊肝臟中的各種血管以獲悉哪一條血管可提供 最佳的組織灌流。該操作也從肝臟中去掉了任何剩餘的血液。對選定的血管做插管並使用 醫療級粘合劑(例如，醫療級「超級膠(superglue)」)密封固定。使用醫療級粘合劑密封所有其它的大血管和表面開口，且如果需要，使用帶粘合劑的Q-滴頭幫助密封開口。一旦 粘合劑乾燥，將肝臟樣品放在合適大小的玻璃杯內的尼龍網上。將Pl緩衝液加入杯中，並 將肝臟浸沒在緩衝液。將裝有肝臟的杯子放在灌流盒內，並連接上插管的輸出管道。用可 接受的反壓開始以大約24mls/分鐘的低速，然後緩慢增加到58ml/分鐘和90ml/分鐘之間 以優化流速將Pl緩衝液再循環15分鐘。必須確認沒有過多的灌流液從肝臟洩露。15分鐘 後，從杯中取出Pl緩衝液並用含有膠原酶的P2緩衝液代替。再循環P2緩衝液直到肝臟被 充分消化(通過肝臟從深色微紅棕色向淡棕色的顏色轉變和通過獲得肝臟的軟糊狀結構 來評估)。P2緩衝液再循環不超過20-25分鐘。一旦結束灌流，從杯中排出P2緩衝液並將 肝臟在杯中轉移到生物學包布上。向杯中加入細胞培養基(DMEM)，去掉插管和粘合劑以及肝臟的任何未消化區。使 用組織鑷子和剪刀破壞肝臟被膜(肝被膜)。這允許將消化的組織釋放進培養基中，剩下結 締組織和任何未消化的材料。將消化的材料放入DMEM中，然後通過一系列不同大小的濾膜 過濾。濾膜放在大型漏鬥的內側以幫助過濾。消化的材料首先用單層幹酷包布過濾，接著 用400μ的尼龍濾膜過濾，然後通過70 μ的特氟隆濾膜。將濾液平分進離心管並以70g離 心4分鐘。離心後，在加入Percoll前，上清稱為餾分I(Fl)。向細胞沉澱中加入DMEM和等滲 的Percoll以得到分別為3 1的最終比率。例如，5ml體積的堆積細胞的小團懸浮於30ml 的DMEM和IOml的等滲Percoll中。將樣品以IOOg離心5分鐘以產生稱為F4餾分的沉澱。 上清以200至400g再離心5分鐘以獲得稱為F3餾分的沉澱。現在上清再以600_800g離 心以獲得稱為F2餾分的沉澱。以1200-1800g進行最後的離心以獲得稱為Fl餾分的沉澱。 懸浮不同餾分的細胞並使用錐蟲藍染料排斥試驗評估其活力。不同餾分的活力在表4中提 {共。保留肝臟灌流後與肝臟組織的血管或膽管樹保持結合的細胞。這些細胞在酶灌流 後獲得的原始細胞懸液中發現，且一般在懸液中的細胞通過後留在濾網(例如，乾酪包布) 的上部。用酶再次處理血管和膽管樹的這些殘留物，所得的細胞與其它細胞合併在一起。大多數研究者在肝臟灌流中通常使用Percoll分餾法以排除他們認為是碎片和 死亡細胞的成分；但這些研究者僅保留了最終的細胞沉澱。本文所公開的對常規灌流的新 變化是，這裡稱為F4的第一細胞沉澱含有發現對局部缺血，無論是暖或冷局部缺血最敏感 的細胞，且具有較低浮力密度的細胞(即，從以較高速度離心獲得的沉澱收集的細胞)對局 部缺血敏感性較小。在Fl，F2，和F3餾分中的這些細胞較小，可能是年幼的實質細胞且具 有更大的冷凍適應性(見冷藏部分)。而且，這些細胞基本上是二倍體細胞，而來自成人F4 餾分中的細胞含有大量多倍體細胞。多倍體細胞可以是雙核或單核的，且可以是四倍體或 八倍體，或者甚至是更高水平的倍性。倍性與細胞群體的分餾相關發現上述成人肝臟細胞的餾分(F1-F4)含有不同的細胞群體；Fl含有碎片， 紅血細胞，肝星形細胞，和含有祖細胞群體(肝譜系或造血譜系的祖細胞)的小肝細胞 ( 400xl06個分離的細胞。暖局部缺血時間不超過1小時時發現總細胞產量 迅速下降到每個肝臟提供150到250xl06個細胞。時間在大約1小時到5小時之間時發現 總細胞產量相對穩定在每個肝臟產生50到150xl06個之間的細胞。暖局部缺血時間不超過 1小時時活細胞產量迅速下降，大於1小時時穩定在每個肝臟大約IOxlO6個細胞。因此，發 現活細胞的比例與暖局部缺血呈雙峰。在不超過1小時時，活細胞和死細胞都急劇降低以 致於活力比不變。在大於1小時和達到5小時時觀察到穩定的活細胞百分數。使用上述大鼠模型測量由於暖局部缺血時間的影響肝臟細胞核的投射區。灌流肝 髒，細胞分離為單細胞懸液，並用碘化丙錠染色。以流式細胞術收集活細胞(PI-陰性)，然 後附著到顯微鏡載玻片上，固定，透化並用PI復染以觀察細胞核。對於無局部缺血灌流的 對照動物，發現細胞核面積具有雙峰分布，相應於單核和雙核活的肝臟細胞都存在。暖局部 缺血1小時後和2小時後，發現雙核細胞的比例降低。由於雙核細胞必定是多倍體，認為這 些數據表明多倍體細胞比二培體細胞對局部缺血更敏感。通過分析單核細胞中細胞核的大小進一步支持了二倍體細胞對局部缺血的抗性。 單核細胞可以是二倍體或者是多倍體，二倍體細胞具有比多倍體細胞更小的細胞核。上述 大鼠模型用於製備測量細胞核面積的活細胞。圖Ia中提供了總細胞核的百分數，表明具有小核的細胞對局部缺血具有相對抗性。由於多倍體核傾向於比二倍體核更大，發現這些數 據表明了二倍體細胞對暖局部缺血具有相對的抗性。發現在對照肝臟和局部缺血2小時後 的肝臟中細胞核大小之間的改變無區別，如圖Ib所示。也有利地檢查了由於低溫局部缺血時間的影響細胞的活力，見表6和7。在該實施 方案中，肝臟基本上在死後立即迅速冷凍到大約10°C。甚至更有利的是，肝臟基本上在死後 立即迅速冷凍到大約4°C。通過本領域的技術人員已知的一些任何方法可實現冷凍，包括但 不限於在供體屍體腹部堆積冰塊或冰冷的液體袋的簡單權宜之計。肝臟保持在一種上述環 境溫度以下，然後在時間達到大約30小時，或更有利的是在時間達到20小時時按所述進行 灌流。處理灌流產生的單細胞懸液以提供祖細胞。觀察到多倍體細胞對即使溫度維持在環 境溫度以下和甚至在4°C的局部缺血敏感。表6人胎兒肝臟
權利要求
一種處理局部缺血性損傷的非胎兒供體組織以獲得富集的祖細胞群體的方法，所述方法包括(a)提供死後約2小時到30小時之間的非胎兒供體組織，所述的供體組織在這期間保持在活體溫度和室溫之間的溫度；和(b)處理所述的非胎兒供體組織以獲得富集的祖細胞群體。
2.權利要求1的方法，其中所述供體組織在心跳停止後大約2-6小時內獲得。
3.權利要求1的方法，其中所述供體組織在心跳停止後大約2-3小時內獲得。
4.權利要求1的方法，其中所述供體組織是冷卻的。
5.權利要求1的方法，其中所述供體組織冷卻到大約4°C。
6.權利要求1的方法，其中所述供體是新生兒，嬰兒，兒童，少年或成人。
7.權利要求1的方法，其中所述供體是豬或靈長類。
8.權利要求1的方法，其中所述組織是肝臟。
9.權利要求1的方法，其中所述處理步驟提供了基本上的單細胞懸液或外植塊。
10.權利要求9的方法，其中所述處理步驟還包括從懸液中選擇那些表達與至少一種 祖細胞譜系陽性或陰性相關的至少一種標記的細胞。
11.權利要求10的方法，其中所述處理步驟還包括壓實的步驟以提供富集表現出與至 少一種祖細胞譜系相關的至少一種標記的祖細胞的壓實的細胞懸液。
12.權利要求10的方法，其中至少一種祖細胞譜系包括肝細胞，造血細胞，基質細胞或 間充質細胞譜系中的至少一種。
13.—種從缺血性損傷的非胎兒肝臟中獲取肝臟祖細胞的方法，所述方法包括(a)提供非胎兒無心跳供體作為肝臟組織來源；(b)從死亡約2-30小時後的所述非胎兒供體中獲得肝臟組織，所述的供體組織在這期 間保持在活體溫度和室溫之間的溫度；以及(c)處理肝臟組織以獲得肝臟祖細胞。
14.權利要求13的方法，其中所述供體是哺乳動物。
15.權利要求13的方法，其中所述哺乳動物是人。
16.權利要求13的方法，其中所述祖細胞具有形成肝細胞，膽細胞或其組合的能力。
17.權利要求13的方法，其中所述供體的細胞表達甲胎蛋白，白蛋白，骨唾液蛋白， ⑶14，⑶34，⑶38，⑶90，⑶45，⑶117，ICAM-1，I型膠原蛋白，II型膠原蛋白，III型膠原蛋 白，血型糖蛋白A，或骨橋蛋白中的至少一種。
18.—種處理具有至少一種祖細胞群體的組織作為祖細胞來源的方法，所述方法包括(a)提供死後約2-30小時的無心跳非胎兒供體，所述的供體組織在這期間保持在活體 溫度和室溫之間的溫度；(b)從該非胎兒供體收穫組織，所述組織具有至少一種祖細胞群體；和(c)進一步處理收穫的組織以獲得祖細胞。
19.一種處理缺血性損傷的非胎兒組織以獲得富集二倍體細胞的細胞群體方法，所述 方法包括(a)收穫組織時從無心跳的非胎兒供體中提供組織，所收穫的組織死後約2-30小時，推測具有至少一種二倍體細胞群體，所述的供體組織在這期間保持在活體溫度和室溫之間 的溫度；(b)處理收穫的組織以獲得富含二倍體細胞的細胞群體。
20.權利要求19的方法，其中所述供體是新生兒，嬰兒，少年或成人。
21.權利要求19的方法，其中所述二倍體包括祖細胞。
22.權利要求19的方法，其中所述處理步驟包括處理收穫的組織以提供單細胞懸液。
23.權利要求22的方法，其中所述處理步驟還包括將單細胞懸液分成2個或多個餾分。
24.權利要求23的方法，其中分離步驟將較大的細胞與較小的細胞分離，較高密度的 細胞與較低密度的細胞分離，或者兩者都分離。
25.權利要求24的方法，其中進一步處理基本上由較小細胞，較低密度的細胞，或兩者 組成的一個或多個餾分以提供富集二倍體細胞的細胞群體。
26.權利要求25的方法，其中所述二倍體細胞包括表達甲胎蛋白的祖細胞。
27.權利要求26的方法，其中所述祖細胞包括肝臟祖細胞。
28.權利要求27的方法，其中所述組織在心跳停止大約2-6小時之間收穫。
29.權利要求19的方法，其中所述組織在心跳停止後大約2-3小時之間收穫。
30.權利要求19的方法，其中所述組織是肝臟。
全文摘要
本發明首次提供了來自心臟停止跳動的供體屍體器官作為用於各種醫學目的的諸如祖細胞或幹細胞的功能性細胞來源的用途。更具體的說，公開了通過其獲得祖細胞的組織來源的豐富，包括從供體獲得組織，其中供體心臟停止跳動長達大約死後30小時並處理屍體組織以提供祖細胞，該祖細胞作為細胞治療、基因治療、人造器官、生物反應器、器官再生等的工具用於各種醫療目的。
文檔編號C12N5/00GK101955906SQ20101013431
公開日2011年1月26日 申請日期2001年1月19日 優先權日2000年1月19日
發明者洛拉·裡德, 愛德華·L·萊克羅茲 申請人:查珀爾希爾-北卡羅萊納大學