細胞的評價方法、細胞測定用系統和細胞測定用程序的製作方法
2023-08-06 03:53:16
專利名稱：細胞的評價方法、細胞測定用系統和細胞測定用程序的製作方法
技術領域：
本發明涉及細胞的評價方法、細胞測定用系統和細胞測定用程序。
背景技術：
細胞活性的評價不僅有益於闡明細胞的生物、生化學現象和性質，而且作為化學物質的生理活性、毒性的研究方法也很有效，因此進行了活性評價的方法的研究。
一般的細胞活性的評價方法有用吸光光度計測定錐蟲藍、中性紅等色素進入細胞內的量，根據測定結果，評價細胞活性的方法；對由活性漏出到細胞外的脫氫酶等酶的量進行定量，根據定量結果，評價細胞活性的方法；向細胞懸濁液中插入電極，給電極施加一定的電位，測定來自細胞電運動的電流值，根據測定結果，評價細胞活性的方法等。
但是，由於這些方法均是間接測定細胞活性，根據相關測定結果評價細胞活性的方法，因此，在細胞活性變化微小的情況下，難以進行檢測。並且，難以得知在細胞周期的哪個階段受影響最大等細胞活性與細胞的生物學信息之間的關係。
作為解決這些問題的方法有觀察細胞或細胞內小器官的形態變化的方法。細胞的形態在細胞分裂期發生變化，此時，尤其是作為細胞內小器官的染色體的凝縮狀態發生很大變化，引發染色體的分離·分配。已知，染色體的分離·分配對於細胞分裂而言是必需的，細胞活性的變化對分裂期的染色體分離有影響。因此，根據染色體的形態變化狀態的觀察結果，可評價細胞活性。觀察染色體形態變化的方法已知有使用螢光色素使染色體可見，追蹤染色體的形態變化的方法(參照專利文獻1)。
專利文獻1日本特開平8-136536號公報專利文獻1的方法是對處於細胞分裂期的細胞數目進行計數，將其相對於總數的百分比與對照組比較，由此判斷藥效的方法。此時，使用染色體的螢光圖像判斷細胞是否處於分裂期，但是由於採用肉眼判斷，因此，不僅缺乏可靠性，而且難以做出迅速判斷。另外，儘管在專利文獻1的實施例1中對分裂細胞的分裂階段也進行了判斷，但是，不僅採用目測難以進行進一步詳細階段的判斷，而且不得不說還缺乏可靠性。
並且，在上述專利文獻1的方法中，螢光色素使用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚·二鹽酸，對作為染色體組成要素的DNA進行染色，使染色體可見，但在通常的應用濃度下使用該螢光色素會使細胞死亡。一旦細胞死亡，儘管可觀察到使用螢光色素時死亡狀態下的細胞中的染色體的形態，但是卻無法繼續觀察活細胞中染色體的形態變化。另外，使用螢光色素進行染色的染色體的螢光強度每當細胞分裂即減半，達到檢測極限以下的螢光強度，因此，無法長時間持續觀察。另外，在專利文獻1的方法中，記載了通過跟蹤細胞在分裂期的形態變化，可檢測抗癌劑的藥效的內容，但它是通過計數處於細胞分裂期的細胞數目，將相對於所有細胞的百分比作為對照組判斷藥效的方案，因此，考慮到一般分裂期的細胞的比率為所有細胞的4％以下，該方案是僅在分裂期整體受影響之類的具有較大效果時才可能實現檢測的方法，而在毒物試驗、環境激素試驗等僅有極少量影響的情況下難以檢測。
發明內容
本發明的目的在於，提供一種用於解決上述問題，能迅速地並以高可靠性進行對細胞在細胞周期中的階段判斷的方法。本發明目的還在於，提供一種可在不使細胞死亡的存活狀態下進行階段判斷的方法。並且，本發明目的還在於，提供自動判斷上述細胞的階段判斷的細胞測定用系統，以及在計算機上運行細胞的階段判斷的細胞測定用程序。
本發明涉及一種細胞的評價方法，具有(a)取得反映細胞內的染色體狀態的圖像的工序，和(b)根據上述圖像，計算與染色體狀態相應的參數，根據上述計算結果，判斷上述細胞在細胞周期中的階段的工序。
上述參數優選包括染色體的圓形度、染色體的圓度、染色體的長軸與短軸的長度之比、染色體的正圓度、染色體的費萊特直徑(Feret)、染色體和與其鄰近的染色體的重心之間的距離、染色體長軸和與其鄰近的核染色體的長軸之間的角度，或其中的多項。本說明書所述的染色體如無特別聲明，是指染色體組。並且，處於細胞分裂間歇期的染色體組也被稱為「核」，本說明書所述的染色體也包括該「核」。
上述細胞的評價方法的優選實施方式之一具有(c)在上述工序(a)之前，在上述細胞內表達染色體蛋白質與發出螢光的蛋白質的融合體的工序。在此情況下，上述工序(a)中的上述圖像為來自上述細胞發出的螢光的螢光圖像。採用該方法，可在細胞沒有死亡的情況下，取得來自染色體狀態的螢光圖像。
在上述細胞的評價方法中，也可以還具有(d)根據上述工序(b)的判斷結果，評價上述細胞的活性度的工序。
在上述細胞的評價方法的實施方式之一中，在上述工序(a)中，取得與試樣中的多個細胞對應的圖像，在上述工序(b)中，針對多個細胞分別判斷上述階段，在上述工序(d)中，計算處於各階段的細胞數的比例，根據上述計算結果，評價細胞活性度。
此外，在上述細胞的評價方法的實施方式之一中，在上述工序(a)中，每隔規定的時間間隔，取得與特定細胞對應的圖像，在上述工序(b)中，判斷特定細胞每隔規定的時間間隔的階段，在上述工序(d)中，根據特定細胞的階段變化相對於時間變化的信息，評價細胞活性度。
此外，本發明還涉及一種細胞測定用系統，其具有檢測反映細胞內染色體狀態的螢光的螢光檢測裝置；取得來自上述螢光檢測裝置檢測出的螢光的螢光圖像的攝像裝置；根據由上述攝像裝置取得的螢光圖像，計算與染色體狀態相應的參數，根據上述計算結果，判斷上述細胞在細胞周期中的階段的圖像解析裝置。
在上述細胞測定用系統的實施方式之一中，上述螢光檢測裝置對來自試樣中多個細胞的螢光同時進行檢測，上述攝像裝置取得含有試樣中多個細胞發出的螢光的信息的螢光圖像，上述圖像解析裝置根據由上述攝像裝置取得的螢光圖像分隔出與各細胞對應的螢光圖像，判斷各細胞在細胞周期中的階段。
在上述細胞測定用系統的實施方式之一中，上述攝像裝置每隔規定的時間間隔，取得與特定細胞相應的螢光圖像，上述圖像解析裝置，判斷特定細胞的細胞每隔規定的時間間隔在細胞周期中的階段。
此外，本發明涉及細胞測定用程序，該程序在計算機上進行下述操作順序檢測反映細胞內的染色體的狀態的細胞發出的螢光，以螢光圖像取得上述螢光，根據上述螢光圖像，計算與染色體狀態相應的參數，根據上述計算結果，判斷上述細胞在細胞周期中的階段。此外，本發明還涉及存儲有上述細胞測定用程序的計算機可讀取存儲介質。
採用本發明，由於根據與染色體狀態相應的參數對細胞進行評價，因此，可迅速、簡便並能以高可靠性進行評價。並且，由於可得到與細胞分裂期階段相關的信息，因此，即使在對分裂期整體沒有影響的微小變化下，仍可以進行檢測。同樣，即使在低濃度下，也可以評價阻礙物質對細胞活性的影響。
根據權利要求3所述的發明，則可以在不從細胞外部引入可能對細胞生死有影響的化合物的情況下取得細胞的螢光圖像。即不是對死亡的細胞，而是可以對活細胞的活性進行評價。
此外，根據本發明的細胞測定用系統和細胞測定用程序，可簡便判斷活細胞的細胞周期的階段，該判斷結果有益於評價細胞的活性度。
圖1為HeLa細胞在細胞周期各階段中的螢光顯微鏡圖像的示意圖。
圖2為實施例中細胞測定用系統的電結構的示意框圖。
圖3為實施例中細胞測定用系統的外觀結構的一例示意圖。
圖4為實施例中細胞測定用系統的處理順序示意圖。
圖5為實施例中細胞測定用系統中的階段判斷的處理順序示意圖。
圖6為實施例中階段判斷結果顯示的一例示意圖。
圖7為實施例的細胞測定用系統中階段判斷的其它處理順序的示意圖。
圖8為實驗中時移(time lapse)解析結果示意圖。
符號說明
1、1a細胞測定用系統；2螢光檢測裝置；2a螢光顯微鏡；3攝像裝置；3a攝像機；4圖像解析裝置；4a個人計算機；5輸出裝置；5a監視器；6輸入裝置；6a鍵盤；6b滑鼠；7輔助存儲裝置；8程序存儲介質；41控制部；42存儲部具體實施方式
下面，參照附圖，說明本發明的實施方式。
本發明的細胞評價方法是取得反映細胞內的染色體狀態的圖像，根據上述圖像，計算與染色體狀態相應的參數，根據上述計算結果，判斷上述細胞在細胞周期中的階段的細胞的評價方法。根據該評價，可進行細胞活性的評價。
取得反映細胞內染色體狀態的圖像的方法可採用公知的各種方法，優選方法之一可舉出在上述細胞內表達染色體蛋白質和發出螢光的蛋白質的融合體，以螢光圖像取得上述細胞發出的螢光的方法。根據該方法，無需從細胞外部引入有可能使細胞遭受毒性的化合物，易於將活細胞用作評價對象。下面，對採用本發明的情況進行說明。
作為評價對象的細胞是即使引入螢光蛋白質，也不會死亡，具有細胞分裂活性，上述融合體正常存在於染色體上的局部的細胞。本發明方法用於例如對HeLa細胞等人體子宮頸癌細胞、CHO細胞等中國倉鼠卵巢纖維芽細胞、BY-2細胞等菸草懸濁培養細胞、Hep細胞等來自人體喉癌的細胞等的評價。
作為上述染色體蛋白質，示為在細胞分裂期，在染色體局部存在的蛋白質，通過螢光蛋白質的加成，形成上述局部分布無變化的染色體蛋白質。例如，優選使用組蛋白、凝集蛋白(condensin)、拓撲異構酶(topoisomerase)。
上述螢光蛋白質可舉出綠色螢光蛋白質(GFP)、黃色螢光蛋白質(YFP)、紅色螢光蛋白質(dsRed)及其突變體等。
表達染色體蛋白質與螢光蛋白質的融合體的細胞的構建方法可舉出公知的方法。
由於染色體由DNA和染色體蛋白質構建，因此，由DNA的螢光圖像，可得到與染色體凝集度、形態變化等相關的信息。另一方面，儘管直接觀察染色體蛋白質比較困難，但如本實施方式所示，利用與染色體蛋白質融合的螢光蛋白質的螢光圖像，與DNA的螢光圖像相同，可得到與染色體凝集度、形態變化等相關的信息。下述說明為闡明該內容的實施例。
圖1為HeLa細胞在細胞周期各階段中的螢光顯微鏡圖像示意圖。在本說明書中，細胞周期分為間歇期和分裂期，且分裂期又進一步分為前期、前中期、中期、後期、終期等階段。在圖1中，表示的是間歇期、前中期、中期、後期的螢光顯微鏡圖像。在取得圖1的螢光顯微鏡圖像的實驗中，在細胞內表達GFP-組蛋白H1融合體，同時，用Hoechst(Hoechst33342)對細胞內的DNA進行染色。圖1(a)為激發Hoechst，通過與Hoechst的螢光波長相應的濾光器取得的螢光顯微鏡圖像，即DNA的螢光顯微鏡圖像。圖1(b)為激發GFP，通過與GFP的螢光波長相應的濾光器取得的螢光顯微鏡圖像。圖1(c)為將圖1(a)的螢光顯微鏡圖像與圖1(b)的螢光顯微鏡圖像重合的螢光顯微鏡圖像。由此可知，圖1(a)的螢光顯微鏡圖像與圖1(b)的螢光顯微鏡圖像基本一致。即，由於染色體由DNA和染色體蛋白質構建，因此，通過得到DNA的螢光顯微鏡圖像，可以知曉染色體的凝集度、形態變化等，而通過GFP的螢光顯微鏡圖像，也可以知曉染色體的凝集度、形態變化等。
此外，染色體凝集度和形態變化的信息在判斷細胞在細胞周期中的階段方面很有用。本發明人等認為，通過將染色體的凝集度、形態變化等染色體的狀態相關信息數值化得到結果，可簡便、迅速、準確地實施細胞在細胞周期中的階段的判斷，探索了與染色體的狀態相應的各種參數，研究了有益於判斷細胞在細胞分裂中的階段的參數。研究結果發現，染色體的圓形度、染色體的圓度、染色體和與其鄰近的染色體的重心之間的距離、染色體長軸和與其鄰近的染色體的長軸之間的角度、染色體的長軸與短軸之比、染色體的正圓度、以及染色體的費萊特直徑可用作有效的參數。另外，還可知，通過選擇適當的參數，將其組合，用作判斷材料，可得到更詳細的染色體狀態的相關信息。
在下述實施例中，將這些參數中的多個用作判斷材料，判斷細胞在細胞周期中的階段。然而，也不限於基於這些參數的判斷。在本實施方式中，在計算與染色體相關的各參數時，以染色體組的輪廓為外周的圖形被認為是與染色體相應的圖形。即，以染色體組的輪廓為外周的圖形的圓形度、圓度等被認為是染色體的圓形度、圓度等。
本說明書所述染色體的圓形度是指用面積的4π倍值除以外周長的2次方的商值。染色體的圓度是指用面積的4倍值除以長軸長度的0.5次方的π倍值的商值。鄰近的染色體是指與作為對象的染色體的重心間距離最小的染色體。染色體的長軸與鄰近的染色體的長軸的角度是指假定與各自染色體的圖形最相近的橢圓，計算出的長軸間的最小角度。染色體的長軸與短軸之比為假定與染色體的圖形最相近的橢圓，計算出的長軸與短軸之比。染色體的正圓度是指與理想的正圓的偏差值，當用兩個同心圓夾持時，相對於使同心圓的半徑之差最小的中心測定的最大半徑與最小半徑之差。染色體的費萊特直徑是指假定染色體的圖形外周上的兩個點，使兩點間的距離最大的長度。
然後，根據細胞在細胞周期中的階段的判斷結果，對評價細胞的活性度的本發明中的方法的具體例進行說明。例如，可舉出以同一試樣內所含多個細胞為對象，判斷各細胞在細胞周期中的階段，求取相對於全體細胞數的處於各階段的細胞數的比例(下文稱為「計數模式」)，根據該比例評價細胞活性度的方法；檢測特定的細胞(既可以是單數，也可以是複數)相對於時間變化的階段轉移的狀態(下文也稱為「時移模式」)，根據上述檢測結果，評價細胞活性度的方法。也可將多種方法組合使用。這些方法種的任一種方法也可通過與對照數據的比較評價細胞的活性度。例如，對為了檢測細胞對試劑的響應性，適用本發明的細胞的活性評價方法的情況進行說明。在利用計數模式的情況下，求取與試劑接觸的細胞相關，相對於總體的細胞數，處於各階段的細胞的數目的比例，製作根據該比例的細胞分布圖，與未經與試劑接觸的細胞相關的細胞分布圖比較。可知，在細胞分布圖產生有效差的情況下，因試劑使細胞受到何種影響。例如，可知，在處於間隔期的細胞比例增大，處於分裂期的細胞的比例減小的情況下，細胞的細胞分裂活性降低。
上述細胞在細胞周期中的階段的判斷工序、隨後的細胞的活性度的評價工序既可以利用自動實施的裝置進行，也可以由觀察者目測進行。在下述實施例中，表示用自動細胞測定用系統進行細胞在細胞周期中的階段的判斷，然後由觀察者目測進行此後的細胞活性度的評價工序的情況。
實施例[自動細胞測定用系統]下面，對本實施例的細胞測定用系統進行說明。
圖2為本實施例中細胞測定用系統1的電結構的示意框圖。本實施例的細胞測定用系統1具有檢測螢光的螢光檢測裝置2、對來自螢光檢測裝置2檢測出的螢光的螢光圖像進行攝影的攝影裝置3、對用攝影裝置3攝影的螢光圖像進行解析的圖像解析裝置4、輸出圖像解析裝置4的解析結果的輸出裝置5、和用於實施各種操作的輸入裝置6。圖像解析裝置4具備控制部41和存儲部42，用於實施後述處理的細胞階段判斷程序存儲在存儲部42中，用控制部41根據該程序進行圖像解析等，同時對各裝置進行控制。
圖3為圖2所示的細胞測定用系統的外觀結構的一例示意圖。圖3的細胞測定用系統1a具有檢測螢光的螢光顯微鏡2a、對螢光檢測裝置2a檢測出的螢光以螢光圖像進行攝影的攝像機3a、對用攝像機3a攝影的螢光圖像進行解析的個人計算機(下文稱為PC)4a、輸出PC4a的解析結果的監視器5a、用於實施各種操作的鍵盤6a和滑鼠6b。在細胞周期的階段判斷時，將試樣載置於螢光顯微鏡2a的載置臺上。
作為細胞測定用系統1中的螢光檢測裝置2，只要是可檢測由試樣發出的螢光強度的裝置即可，優選使用螢光顯微鏡2a，另外也可使用螢光掃描儀。攝影裝置3可使用例如將來自螢光檢測裝置2的圖像信號攝成二維黑白圖像的攝像機3a。圖像解析裝置4包括可實時處理每隔規定間隔的攝影畫面的圖像處理電路，以及包括CPU、ROM、RAM和I/O接口的微型計算機。圖像解析裝置4也可由例如PC4a構成。圖像解析裝置4的存儲部42包括ROM、RAM等，存儲有解析用程序，也可利用作為機械讀取/寫入程序存儲介質8的裝置(Floppy(註冊商標)軟盤驅動器、CD-ROM驅動器)的存儲介質裝置7，將在Floppy(註冊商標)軟盤或CD-ROM等的程序存儲介質8中存儲的解析用程序讀入存儲部42。輸出裝置5可使用例如在CRT或液晶顯示器等上顯示的監視器5a，或雷射印表機等列印在紙上的列印裝置。輸入裝置6可使用鍵盤6a或滑鼠6b等。
圖4為細胞測定用系統1的處理順序示意圖。並且，在細胞測定用系統1中的控制開始之前，操作人員可使用輸入裝置6選擇時移模式、計數模式中的任一種模式。並且，在已選擇時移模式的情況下，輸入追蹤時間。將試樣裝配在螢光檢測裝置2上。首先，在步驟S1中，對來自螢光檢測裝置2檢測出的螢光的螢光圖像進行攝像，將該螢光圖像作為圖像數據引入。然後在步驟S2中，實施由圖像數據分隔出細胞圖像，將分隔出的細胞圖像儲存在圖像解析裝置4的存儲部42的圖像存儲器中。通常，一份試樣中含有多個細胞，但在該步驟S2中，對各細胞從No.1開始依次賦予其識別編號，將分隔出的各細胞圖像與識別編號相對應儲存在圖像存儲器中。此時，也可對各細胞的染色體的重心進行推算，與識別編號相應，將重心位置儲存在圖像存儲器中。至於處於細胞分裂期的後期及終期的細胞，一個細胞內存在有兩條染色體圖像，在這種情況下，對與各染色體圖像相應的重心進行推算，儲存在圖像存儲器中。另外，當兩條染色體圖像的重心間距離小於規定值時，該兩條染色體圖像進行判斷為來自一個細胞的處理，也可根據該判斷，實施細胞圖像的分隔。在下述步驟S3中，實施各細胞的階段判斷。
圖5為步驟S3中各細胞的階段判斷的具體處理順序的示意圖。另外，圖5表示作為表達GFP-組蛋白H1融合體的細胞情況下的控制順序。細胞測定用系統1的優選實施方式是根據細胞的種類，選擇各參數作為判斷基準的數值。如圖5所示，一旦開始階段判斷，首先根據識別編號No.1的細胞圖像對識別編號No.1的細胞進行下述處理。
首先，在步驟S101中計算圓形度。然後，在步驟S102中，判斷圓形度是否在0.8以下，而在判斷為否(NO)的情況下，在步驟S112中，判斷細胞的階段為間歇期。作為步驟S101中的圓形度的基準值，在本例中採用0.8，可優選使用0.60～0.99範圍內的數值。圓形度在0.8以下的情況下(YES)，在步驟S103中，計算染色體和與其鄰近的染色體的重心間的距離。鄰近的染色體既有為在同一細胞內的染色體的情況，也有為不同細胞的染色體的情況。然後，在步驟S104中，判斷步驟S103中計算的染色體的重心間的距離是否在基準值以上。在步驟S104中判斷不在基準值以上的情況下(NO)，進展到步驟S107。在步驟S104中的基準值根據使用的每個細胞而定。例如，在使用HeLa細胞的情況下，優選使用15～21μm範圍內的值，特別優選為18μm作為基準值；而在使用CHO細胞的情況下，優選使用14～20μm範圍內的值，特別優選為17μm作為基準值；在使用BY-2細胞的情況下，優選使用17～23μm範圍內的值，特別優選為20μm作為基準值。另一方面，在步驟S103中計算的重心間的距離在基準值以上的情況下(YES)，在步驟S105中，計算染色體的長軸和與其鄰近的染色體的長軸之間的角度。
在步驟S106中判斷在S105中計算的角度是否在20度以上，在否的情況下(NO)，進展到步驟S107。另一方面，在S105中計算的角度在20度以上的情況下(YES)，進展到步驟S109。在步驟S107中，計算染色體的圓度。在步驟S108中，進一步判斷圓度是否在0.5以上。在圓度為0.5以上的情況下(YES)，在步驟S115中，判斷細胞階段為終期。在圓度不在0.5以上的情況下(NO)，在步驟S114中，判斷細胞階段為後期。
在步驟S109中，計算染色體的長軸與短軸之比(長軸/短軸)，在步驟S110中，判斷長軸/短軸是否在1.5以上，在否的情況下(NO)，在步驟S116中判斷細胞的階段為前期。在長軸/短軸為1.5以上的情況下(YES)，在步驟S111中計算染色體的圓度，在步驟S112中判斷圓度是否在0.5以上。在圓度不在0.5以上的情況下(NO)，在步驟S117中，判斷細胞階段為中期。在圓度為0.5以上的情況下(YES)，在步驟S118中判斷細胞階段為前中期。
用步驟S113、S114、S115、S116、S117、S118中的任一步驟判斷細胞的階段之後，在步驟S119中，將判斷結果與細胞的識別編號對應，存儲在存儲部42中，進展到步驟S120。在步驟S120中，判斷是否完成了對所有細胞圖像的判斷，在未完成的情況下(NO)，再次回到步驟S101，對下一個識別編號的細胞實施同上所述的處理。在完成了對所有細胞圖像的判斷的情況下(YES)，結束階段判斷的處理。另外，在步驟S107中，對處於後期或終期的細胞計算染色體的圓度，因此，通常一個細胞圖像中，包括兩條染色體圖像，其中，圓度既可以是兩個染色體圖像的平均值，也可以是基於一個染色體圖像的值。在步驟S101中一個細胞圖像中包括兩條染色體圖像的情況也同上所述。
回到圖4，在步驟S3中，完成階段判斷之後，在步驟S4中顯示判斷結果。並且，在作為輸出裝置5使用監視器5a的情況下，如步驟S4所示，判斷結果顯示在監視器上，而在輸出裝置5使用列印裝置的情況下，列印判斷結果。圖6為步驟S4中判斷結果顯示的一例的示意圖。在圖6中，處於各階段的細胞的比例用餅圖表示。由於在步驟S3中，完成對所有細胞的階段判斷，因此，根據該階段判斷的結果，如圖6所示，可用餅圖表示處於各階段的細胞數的比例。
然後，在步驟S5中，由操作者判斷設定的模式是時移模式還是計數模式，在計數模式的情況下，完成處理。另一方面，在時移模式的情況下，在步驟S6中，判斷是否經過了設定的追蹤時間。在未經過的情況下(NO)，回到步驟S1，實施同樣的處理。另外，在步驟S1中的攝像設定為每隔規定時間實施一次，例如設定為一秒實施一次。在步驟S6中，判斷經過了設定時間的情況下(YES)，進展到S7，對所有細胞實施時移解析。然後，根據時移解析結果，判斷經過了分裂期的所有工序的細胞，僅對這些細胞在步驟S8中顯示分裂期部分的時移解析結果。並且，在步驟S8中，顯示的是這些細胞時移解析結果的平均值。
在圖4的處理中，在計數模式的情況下，通過將步驟S4中顯示的判斷結果與作為對照的細胞的數據比較，可由操作者肉眼判斷對象的活性程度(例如，對象是否呈活性)。另外，在圖像解析裝置4中，可自動實施與對照物的比較，自動判斷活性的程度。
在圖4的處理中，在時效模式的情況下，通過將步驟S8中顯示的判斷結果與作為對照的細胞的數據比較，可由操作者肉眼判斷對象的活性程度(例如，對象是否呈活性)。另外，在圖像解析裝置4中，可自動實施與對照物的比較，自動判斷活性的程度。另外，在時效模式中，也可與上述計數模式同樣，根據步驟S4中顯示的判斷結果，判斷對象的活性度。
下面，對圖4的流程圖的步驟S3中的處理與按照圖5所示流程圖的處理的不同之處的實施例進行說明。在本實施例中，僅步驟S3中的處理與上述例不同，其它部分可共用，省略對可共用部分的說明。
圖7為圖4的流程圖的步驟S3中的各細胞階段判斷的本實施例中的具體處理順序的示意圖。另外，圖7表示評價對象的細胞為HeLa細胞時的控制順序。如圖7所示，一旦開始階段判斷，首先根據識別編號No.1的細胞圖像對識別編號No.1的細胞進行下述處理。在步驟S201中計算正圓度。然後，在步驟S202中，判斷正圓度是否在0.875以下，而在判斷為否(NO)的情況下，在步驟S212中，判斷細胞的階段為間歇期。在正圓度在0.875以下的情況下(YES)，在步驟S203中，計算染色體和與其鄰近的染色體的重心間的距離。然後，在步驟S204中，判斷步驟S203中計算的染色體的重心間的距離是否在17μm以上。在判斷為否的情況下(NO)，進展到步驟S207。另一方面，在步驟S203中計算的重心間的距離在17μm以上的情況下(YES)，在步驟S205中，計算染色體的長軸和與其鄰近的染色體的長軸之間的角度。然後，在步驟S206中判斷在S205中計算的角度是否在20度以上，在否的情況下(NO)，進展到步驟S207。另一方面，在S205中計算的角度在20度以上的情況下(YES)，進展到步驟S208。
在步驟S207中，判斷步驟S203中計算的重心間的距離是否在12μm以上。在重心間的距離在12μm以上的情況下(YES)，在步驟S214中判斷細胞的階段為終期。分裂期染色體重心間的距離並非在12μm以上時(NO)，在步驟S213中，判斷細胞的階段為後期。在步驟S208中，計算染色體的長軸與短軸之比(長軸/短軸)，在步驟S209中，判斷長軸/短軸是否在2.3以下，在否的情況下(NO)，在步驟S215中判斷細胞的階段為中期。在長軸/短軸為2.3以下的情況下(YES)，在步驟S210中計算染色體的費萊特直徑，在步驟S211中判斷費萊特直徑是否在17μm以上。在費萊特直徑不在17μm以上的情況下(NO)，在步驟S216中，判斷細胞階段為前期。在費萊特直徑在17μm以上的情況下(YES)，在步驟S217中判斷細胞階段為前中期。用步驟S212、S213、S214、S215、S216、S217中的任一步驟判斷細胞的階段之後，在步驟S218中，將判斷結果與細胞的識別編號對應，存儲在存儲部42中，進展到步驟S219。在步驟S219中，判斷是否完成了對所有細胞圖像的判斷，在未完成的情況下(NO)，再次回到步驟S201，對下一個識別編號的細胞實施同上所述的處理。在完成了對所有細胞圖像的判斷的情況下(YES)，結束階段判斷的處理。另外，在步驟S201中，一個細胞圖像中包括兩條染色體圖像，在此情況下，既可以是兩個染色體圖像的平均值，也可以是基於一個染色體圖像的數據的值。
1.GFP-組蛋白H1表達HeLa細胞的構建染色體由DNA和染色體蛋白質構成，在本實施例中，作為主要的染色體蛋白質的組蛋白H1與作為螢光蛋白質的GFP融合，選擇使活細胞中的染色體可見性幾乎在所有的組織中均穩態表現(Meergans etal.，1997)的組蛋白H1.2。
利用PCR，由人體基因組獲得組蛋白H1.2基因，在pUC18進行亞克隆之後，經過利用受限酶處理的分隔，實施向作為對動物細胞中GFP融合蛋白質表達載體的pEGFP-C1(Clontech公司)的克隆。
用Lipofectamine(Invitrogen公司)將構建的載體引入HeLa細胞。進行利用抗生物質G418(最終濃度800mg/mL)的轉化體的選擇。選出的克隆因確認了即使進行4次繼承(每次稀釋到1/10濃度)也可在所有細胞中表達融合蛋白質，由此判斷穩態表達GFP-組蛋白H1融合蛋白質的克隆。另外，確認本克隆即使在實施了液態氮中的冷凍保藏、融解之後，也能維持著融合基因的表達能力。
2.用染色體結構變化識別法進行細胞活性評價對GFP-組蛋白H1表達HeLa細胞，利用上述細胞測定用系統內圖4中的步驟S3的階段判斷採用了圖7所示流程圖的系統，在時移模式下進行測定。圖8表示圖4的步驟S8中的平均值的時移解析結果。圖8(a)表示對照的時移解析結果，圖8(b)表示添加中期抑制劑Nocodazol，使其最終濃度為15ng/ml的目標的時移解析結果，圖8(c)表示添加中期抑制劑Nocodazol，使其最終濃度為150ng/ml的目標的時移解析結果。另外，在圖8(a)～(c)中，橫軸表示時間，P1表示間歇期、P2表示前期、P3表示前中期、P4表示中期、P5表示後期、P6表示終期。由圖8(c)可知，以最終濃度為150ng/ml添加中期抑制劑Nocodazol，則在前中期下呈細胞分裂停止的狀態。且由圖8(b)可知，以最終濃度為15ng/ml添加中期抑制劑Nocodazol，則在前中期發生延遲。這樣，顯示出以處於細胞分裂期的特定的階段的時間的變化捕捉細胞活性的降低，可評價在現有的固定細胞的細胞活性評價法中未能檢測出的對低濃度下的抑制物質的細胞活性的影響。
產業實用性本發明的細胞的評價方法、細胞測定用系統、以及細胞測定用程序在毒物試驗、環境激素試驗、藥品響應性試驗等方面十分有效。
權利要求
1.一種細胞的評價方法，其特徵在於，具有(a)取得反映細胞內的染色體狀態的圖像的工序，和(b)根據所述圖像，計算與染色體狀態相應的參數，根據所述計算結果，判斷所述細胞在細胞周期中的階段的工序。
2.如權利要求1所述的細胞的評價方法，其特徵在於，所述參數包括染色體的圓形度、染色體的圓度、染色體的長軸與短軸的長度之比、染色體的正圓度、染色體的費萊特直徑、染色體和與其鄰近的染色體的重心之間的距離、染色體長軸和與其鄰近的染色體的長軸之間的角度，或其中的多個。
3.如權利要求1或2所述的細胞的評價方法，其特徵在於，具有(c)在所述工序(a)之前，在所述細胞內表達染色體蛋白質與發出螢光的蛋白質的融合體的工序，在所述工序(a)中，所述圖像為來自所述細胞發出的螢光的螢光圖像。
4.如權利要求1～3中任一項所述的細胞的評價方法，其特徵在於，還具有(d)根據所述工序(b)的判斷結果，評價所述細胞的活性度的工序。
5.如權利要求4所述的細胞的評價方法，其特徵在於，在所述工序(a)中，取得與試樣中的多個細胞對應的圖像，在所述工序(b)中，針對多個細胞分別判斷所述階段，在所述工序(d)中，計算處於各階段的細胞數的比例，根據所述計算結果，評價細胞活性度。
6.如權利要求4所述的細胞的評價方法，其特徵在於，在所述工序(a)中，每隔規定的時間間隔，取得與特定細胞對應的圖像，在所述工序(b)中，判斷特定細胞每隔規定的時間間隔的階段，在所述工序(d)中，根據特定細胞的階段變化相對於時間變化的信息，評價細胞活性度。
7.一種細胞測定用系統，其特徵在於，具備檢測反映細胞內染色體狀態的螢光的螢光檢測裝置；取得來自所述螢光檢測裝置檢測出的螢光的螢光圖像的攝像裝置；根據由所述攝像裝置取得的螢光圖像，計算與染色體狀態相應的參數，根據所述計算結果，判斷所述細胞在細胞周期中的階段的圖像解析裝置。
8.如權利要求7所述的細胞測定用系統，其特徵在於，所述螢光檢測裝置對來自試樣中多個細胞的螢光同時進行檢測，所述攝像裝置取得含有試樣中多個細胞發出的螢光的信息的螢光圖像，所述圖像解析裝置根據由所述攝像裝置取得的螢光圖像分隔出與各細胞對應的螢光圖像，判斷各細胞在細胞周期中的階段。
9.如權利要求7所述的細胞測定用系統，其特徵在於，所述攝像裝置每隔規定的時間間隔，取得與特定細胞相應的螢光圖像，所述圖像解析裝置判斷特定細胞每隔規定的時間間隔的階段。
10.一種細胞測定用程序，其特徵在於，在計算機中運行下述操作順序檢測反映細胞內的染色體狀態的螢光，以螢光圖像取得所述螢光，根據所述螢光圖像，計算與染色體狀態相應的參數，根據所述計算結果，判斷所述細胞在細胞周期中的階段。
11.一種計算機可讀取的存儲介質，其特徵在於，存儲有在計算機中運行下述操作順序的細胞測定用程序檢測反映細胞內的染色體狀態的螢光，以螢光圖像取得所述螢光，根據所述螢光圖像，計算與染色體狀態相應的參數，根據所述計算結果，判斷所述細胞在細胞周期中的階段。
全文摘要
本發明涉及可迅速並以高可靠度進行細胞在細胞周期中的階段的判斷的細胞的評價方法。其中，具有取得反映細胞內的染色體狀態的圖像的工序，和根據上述圖像，計算與染色體狀態相應的參數，根據上述計算結果，判斷上述細胞在細胞周期中的階段的工序。
文檔編號G01N21/64GK101072881SQ20058004225
公開日2007年11月14日 申請日期2005年10月24日 優先權日2004年12月8日
發明者松永幸大, 內山進, 福井希一 申請人:國立大學法人大阪大學