治療退化性及缺血性疾病的方法和組合物的製作方法

2023-08-06 06:19:51

專利名稱：治療退化性及缺血性疾病的方法和組合物的製作方法
技術領域：
本發明是關於能量代謝調節。已經使用化學篩選方式鑑定能量代謝調節劑，可以鑑別出線粒體代謝的小分子抑制劑(例如，抑制氧化磷酸化反應的)。例如，這種線粒體代謝抑制劑可以用於預防或治療神經退化性或缺血性疾病，糖尿病，及寄生蟲感染。例如，氯苯甲嗪(meclizine，敏克靜，美克洛嗪，敏克嗪)已被發現為一種線粒體呼吸作用的抑制劑 (例如，線粒體氧化磷酸化中的一種高\lu/gal抑制劑)及抵制神經退化性疾病誘導的細胞死亡、缺血性損傷、及糖尿病，如2型糖尿病。也提供了在個體中治療寄生蟲病的方法，例如那些僅依賴於甘迺迪途徑來合成磷脂醯乙醇胺的原生動物寄生蟲，包括的物種有錐蟲和瘧原蟲。
背景技術：
幾乎所有的細胞都有能力基於營養有效性，環境條件，或生長及分化的階段將相關依賴性轉移到糖酵解以應對氧化磷酸化作用(0XPH0Q。另外，有現象表明能量代謝的轉移促進疾病的發生。例如，很早就發現在糖酵解中癌細胞佔更高的比例(Warburg，Science 123 :309 (1956)，可能會促進缺氧條件下的生存或維持快速的細胞增殖。最近的研究表明使用二氯乙酸將代謝向OXPHOS轉換的確能阻止腫瘤的生長(Bonnet et al. ,Cancer Cell 11 :37(2007)).相反地，細胞及模式動物中的基因組學及藥物學最新研究表明OXPHOS的局部抑制意味著可以抑制與神經退化性疾病有關的疾病等位基因的毒性(Buttner et al. ,J Biol Chem 283 :7554(2008) ；Fukui et al, Proc Natl Acad Sci USA 104 :14163(2007)；及 Vanna et al. , Proc Natl Acad Sci USA 104 14525 Q007))，也能抑制中風模式動物中的細胞死亡(Huber et al.，J Nellrosci Res 75 :441(20040)和心臟缺血再灌注損傷(Chen et al, Am J Physiol Cell Physiol 292 =C 137 (2007) ) 其潛在的保護機制還不清楚，但已經表明通過一個受損或缺乏抵抗力的線粒體呼吸鏈的通量會促進發病，通過將能量代謝轉向糖酵解，可能將氧化損傷最小化並抑制細胞凋亡(Jeong et al. ,Biochem Biophys Res Commun 313 :984(2004) ；and Hunter et al. ， Int J Radiat Biol 83 :105(2007)).能將細胞依賴性從OXPHOS轉移到糖酵解的臨床有用藥物目前還沒有發現。例如， 傳統的OXPHOS毒素，比如魚藤酮，抗黴素，氰化物及寡黴素有許多缺點諸如i)快速，直接， 高效作用並阻礙呼吸作用；ii)氧化組織劇烈消耗ATP，因此終止許多與呼吸鏈偶聯的生化途徑；iii)導致迅速的細胞中毒；iv)導致人死亡，即使使用低劑量。發明摘要本發明是基於，至少部分是基於發現線粒體代謝的小分子抑制劑，此處鑑定的線粒體代謝抑制劑可以用於預防或治療神經退化性或缺血性疾病。例如，氯苯甲嗪已經被鑑定為一種線粒體代謝幹擾物，並用於抵制神經退化性疾病和誘導性細胞死亡，缺血性損傷， 及糖尿病，例如2型糖尿病。這樣，一方面，本發明提供了對患有與伴隨缺血性損傷或細胞退化性疾病的細胞死亡相關病症的個體進行治療的方法。本發明包括選擇一個個體，其具有伴隨缺血性損傷或細胞退化性疾病的細胞死亡相關病症(例如，基於他們具有的狀況來進行選擇)；並讓選擇的個體攝入一種組合物，包括有效治療劑量的一種已經過鑑定為此處描述的OXPHOS抑制劑的化合物，例如表1或表3所列的化合物，例如氯苯甲嗪或它的一種S-對映體。一般而言，本文中提到氯苯甲嗪的地方，都可以推及使用S-氯苯甲嗪，除了 S-氯苯甲嗪被明確指明排除在外的地方。因此本文中描述的方法中，可使用S-氯苯甲嗪或氯苯甲嗪(外消旋體)，雖然有些情況下由於本文中討論的一些原因而傾向於選擇兩種中的一種。第二方面，本發明的特色方法是降低個體中與伴隨缺血性損傷或細胞退化性疾病的細胞死亡相關病症的發病風險，本方法包括選擇一個個體，其患有與伴隨缺血性損傷或細胞退化性疾病的細胞死亡相關病症或有患此病風險(例如，基於其患病或具有患病風險進行選擇)；讓此個體攝入有效治療劑量的一種已經過鑑定為此處描述的OXPHOS抑制劑的化合物，例如，表1或表3所列的化合物，例如氯苯甲嗪或它的一種S-對映體。進一方面，本發明提供了治療個體中糖尿病的方法。本方法包括選擇一個患有2 型糖尿病或有患此病風險的個體，例如，一個有代謝綜合症的個體，其肥胖，或胰島素抗性， 或任何其它已知的患2型糖尿病的風險因素，讓此個體攝入有效治療劑量的一種已經鑑定為此處捕述的OXPHOS抑制劑的化合物，例如，表1或表3所列的化合物，例如氯苯甲嗪或它的一種S-對映體。此處也描述了氯苯甲嗪及其S-對映體用於治療或預防伴隨缺血性損傷或細胞退化性疾病的細胞死亡相關病症，和使用氯苯甲嗪及其S-對映體用於治療或預防2型糖尿病。另外，本發明包括攝入S-氯苯甲嗪用於治療或預防由暈動病引起的噁心、嘔吐、 和頭暈，或由特定的內耳疾病引起的眩暈的方法，例如，治療那些目前正使用氯苯甲嗪外消旋體治療的病症。此處提到的「個體」，是指哺乳類個體，例如人類個體。在有些實施方案中此處描述的方法包括攝入有效治療劑量的S-氯苯甲嗪，例如， 實質上、大體上由S-氯苯甲嗪組成的組合物。在有些實施方案中，此處描述的方法包括攝入一種組合物，其基本上不含氯苯甲嗪的R-對映體，例如，其純度至少達到92%，95%，97%，99% ；例如S-對映體R-對映體的比例為 99 1,98 2,97 3,95 5,96 4,94 6,93 7,92 8,91 9,90 10， 85 15,80 20。在有些實施方案中，細胞退化性疾病是一種神經退化性疾病，例如帕金森氏症，阿茲海默氏症，肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)，弗裡德希氏共濟失調，或亨廷頓氏舞蹈病。在有些實施方案中，是缺血再灌注損傷病症，例如心肌梗死缺血性損傷，腎缺血性損傷，或中風。在有些實施方案中，此方法包括攝入一劑氯苯甲嗪足以產生約IOOnM到ΙμΜ的血清水平，例如，最高濃度至少是ΙΟΟηΜ，500nM, 750nM, 1 μ Μ。在有些實施方案中，氯苯甲嗪經注射給藥。 在有些實施方案中，攝入氯苯甲嗪的日服劑量是25mg/天或更多。進一步方面，本發明提供的方法用於治療患有寄生蟲感染或有患此病風險的個體，例如一種寄生蟲體內磷脂醯乙醇胺合成要求功能性PCYT2酶活性，例如，其體內磷脂醯乙醇胺的合成主要通過甘迺迪途徑。本方法包括選擇攜帶寄生蟲或者有接觸寄生蟲風險的個體；讓此個體攝入一種包含有效治療劑量的氯苯甲嗪或其S-對映體的組合物。在有些實施方案中，此方法包括攝入有效治療劑量的S-氯苯甲嗪，例如一種本質上由S-氯苯甲嗪組成的組合物，包括藥學上可接受的載體或輔料。在有些實施方案中，本方法包括攝入一種基本上不含R-對映體的氯苯甲嗪組合物，例如，其純度至少達到92 %，95 %，97 %，99 % ；例如 S-對映體R-對映體的比例為 99 1,98 2,97 3,95 5,96 4,94 6,93 7， 92 8,91 9,90 10,85 15,80 20。也提供了使用氯苯甲嗪或S-氯苯甲嗪治療寄生蟲感染的方法。在有些實施方案中，所述寄生蟲選自包括布氏錐蟲，克氏錐蟲和惡性瘧原蟲在內的群組。另一方面，本發明提供方法用於鑑定治療與伴隨缺血性損傷或細胞退化性疾病的細胞死亡相關病症的組合物，例如，像此處描述的。本方法包括提供包含具有酶活性的CTP 磷酸乙醇胺胞苷酸轉移酶2(PCYT2)的樣本；用一種待測化合物接觸樣本，判定待測化合物存在和不存在的情況下樣本中PCYT2的活性。降低樣本中PCYT2活性的待測化合物是治療此類病症的候選化合物。在有些實施方案中，這個樣本是活細胞，這種方法進一步包括判定待測化合物存在時細胞中磷酸乙醇胺(PEA)的水平，當一種待測化合物可以增加細胞中磷酸乙醇胺(PEA)的水平時，可以將其選作治療此病症的候選化合物。在有些實施方案中，此處描述的方法和組合物包含或使用具有二苯甲胺基本結構的化合物。在有些實施方案中二苯甲胺基本結構包括一個AKdiphenylpiperazine)或A2 亞結構。在有些實施方案中，此處描述的方法和組合物包括或使用一種具有三環環狀基本結構的化合物，在有些實施方案中，這種三環環狀基本結構包括EI，E2，FI，F2，Gl或G2亞結構。在有些實施方案中，此三環環狀基本結構包括硫乙哌丙嗪(thiethylperazine)。在有些實施方案中，這種三環環狀基本結構包含一種化合物，包括但不限於圖32所列種類。一方面，本發明涉及一種治療組合物，包括一種氯苯甲嗪對映體，例如S-對映體， 和一種藥學上可接受的載體。在有些實施方案中，本發明涉及一種方法，包括a)提供i) 一種候選化合物，其中所述化合物疑似可以調節線粒體能量產生；ii) 一種能夠在大多數碳源上生長的細胞培養；b)通過將細胞培養從第一種碳源上轉移到第二種碳源上來篩選化合物；C)測定第一個細胞培養的生長速率和第二個細胞培養的生長速率。在有些實施方案中，第一個細胞生長速率是由第一種碳源來測定的，在有些實施方案中，第二個細胞生長速率是由第二種碳源來測定的。在有些實施方案中，第一個的細胞生長速率低於第二個的細胞生長速率，由此鑑定這種化合物為一種糖酵解抑制劑。在有些實施方案中，第二個的細胞生長速率低於第一個的細胞生長速率，由此鑑定這種化合物為一種氧化磷酸化抑制劑。在有些實施方案中，第一種碳源包含葡萄糖。在有些實施方案中，第二種碳源包含半乳糖。在有些實施方案中，此方法甚至包含判定第一個細胞生長速率與第二個細胞生長速率的比值。在有些實施方案中，這個比值包括一個第二個細胞生長速率的IoglO轉換。在有些實施方案中，這個比值包括一個第一個細胞生長速率和第二個細胞生長速率的IoglO轉換。在有些實施方案中，這個比值包括一個大約從1.00到(-)i. 00之間的數值。在有些實施方案中，這個化合物是從由一種有機小分子，一種藥物，一種營養製劑，一種核酸和一種蛋白質組成的群組中選擇的。在有些實施方案中，本發明專注於一種方法，包括a)提供i) 一種候選化合物，其中所述化合物疑似是OXPHOS的選擇性抑制劑；ii)在富含葡萄糖的培養基上進行第一個細胞培養；iii)在富含半乳糖的培養基上進行第二個細胞培養；b)在所述候選化合物存在的情況下孵育所述第一個細胞培養；c)在所述候選化合物存在的情況下孵育所述第二個細胞培養，判定其中的半乳糖生長值 』及d)通過計算葡萄糖/半乳糖生長值的比值來鑑定所述化合物作為一種OXPHOS選擇性抑制劑，其中所述比值大約位於0. 01-1. 0之間。在有些實施方案中，這種化合物是從由一種有機小分子，一種藥物，一種營養製劑，一種核酸和一種蛋白質組成的群組中選擇的。在有些實施方案中，這種化合物包括一種抗腫瘤化合物。在有些實施方案中，本發明專注於一種方法，包括a)提供i) 一種化合物，其中所述化合物包含一個大約位於1.00到(-)1. 00之間的葡萄糖/半乳糖生長值的比值；ii) 一個患者至少表現一種疾病的一種症狀；b)讓所述患者攝入所述化合物，使所述患者的至少一種症狀得到緩解。在有些實施方案中，這種化合物是從由一種有機小分子，一種藥物，一種營養製劑，一種核酸和一種蛋白質組成的群組中選擇的。在有些實施方案中，這種疾病是從由退化性疾病，過度增生疾病(例如，腫瘤或癌症)，糖尿病，缺血性疾病或寄生蟲感染疾病組成的群組中選擇的。在有些實施方案中，本發明專注於一種方法，包括a)提供i) 一種化合物，其中所述化合物包含一個大約位於0. 01到1. 00之間的葡萄糖/半乳糖生長值的比值；ii) 一個患者至少表現一種疾病的一種症狀；b)讓所述患者攝入所述化合物，使所述患者的至少一種症狀得到緩解。在有些實施方案中，這種疾病是從由退化性疾病，缺血性疾病，糖尿病和寄生蟲感染疾病組成的群組中選擇的。在有些實施方案中，這種化合物包括氯苯甲嗪。在有些實施方案中，這種化合物是從由一種有機小分子，一種藥物，一種營養製劑，一種核酸和一種蛋白質組成的群組中選擇的。在有些實施方案中，本發明專注於一種方法，包括a)提供i) 一種化合物，其中所述化合物包含一個大約位於(-)0. 01到(-)1. 00之間的葡萄糖/半乳糖生長值的比值；ii) 一個患者表現一種過度增生疾病(例如，腫瘤或癌症)的至少一種症狀；b)讓所述患者攝入所述化合物，使所述患者的至少一種症狀得到緩解。在有些實施方案中，這種化合物是從由一種有機小分子，一種藥物，一種營養製劑，一種核酸和一種蛋白質組成的群組中選擇的。在有些實施方案中，本發明專注於一個試劑盒，包括a) —個包含細胞培養基的固體基質；b)包含第一種碳源的容器一 ；c)包含第二種碳源的容器二 ；d) —系列說明，解釋如何鑑定一種候選化合物作為無毒性的線粒體能量代謝調節劑。在有些實施方案中，這種固體基質包括許多檢測孔。在有些實施方案中，這些檢測孔包括一個細胞培養。在有些實施方案中，這種固體基質是冷凍的。在有些實施方案中，第一種碳源包括葡萄糖。在有些實施方案中，第二種碳源包括半乳糖。在有些實施方案中，提供一系列說明來檢查細胞生長率，比較第一種碳源和第二種碳源。定義此處用到的「候選化合物」這個術語，是指可以被篩查用於調節線粒體能量產生的任何化合物(例如，有機小分子，肽，激素，核酸)此處用到的術語「碳源」，是指能被細胞用於產能生化途徑的化合物(例如，產生三磷酸腺苷或二磷酸腺嘌呤)。碳源通常是糖類化合物(例如，葡萄糖，半乳糖，果糖，己糖)。此處用到的術語「生長速率」，是指一個組織，器官，有機體的細胞增殖。例如，一個細胞培養的生長速率可以通過比較第一個樣本中的細胞數目與第二個樣本的細胞數目來測定，其中的樣本是暫時區分的。也可以選擇，通過估計尺寸變化(例如，形狀，寬度，密度等)檢測組織、組織培養或器官的生長。此處用到的術語「糖酵解抑制劑」，是指任何能夠幹擾糖酵解的化合物。此處用到的術語「氧化磷酸化抑制劑」，是指任何能夠幹擾電子傳遞鏈的化合物 (例如，一種OXPHOS抑制劑)"Sglu7gal值」這個術語，是指任何一個比較葡萄糖(glu)作為唯一的糖源(例如，一種富含葡萄糖的培養基)時的細胞生長與半乳糖(gal)作為唯一的糖源(例如，一種富含半乳糖的培養基)時的細胞生長得到的比值。例如，\lu/gal值可以以IoglO的轉換方式表示為大約位於1. OOto (-)1. 00的數值。一個高、u/gal值會大於0，可用於鑑定OXPHOS抑制齊U。一個低\lu/gal值會小於0，可以用於鑑定細胞細胞快速增值的抑制劑。此處用到的術語「半乳糖生長值」，是指當半乳糖作為唯一糖源時細胞任何定量的細胞增值此處用到的術語「葡萄糖生長值」，是指當葡萄糖作為唯一糖源時細胞任何定量的細胞增值此處用到的術語「有風險」，是指病人表現出的一種醫療狀況或一系列醫療狀況可能會使患者傾向於發展為一種特殊的疾病或病痛。例如這些狀況可能是由於一些影響造成的包括，但是不限於，行為上的，情緒上的，化學的，遺傳的，生化的或環境上的影響。當提及任何症狀在一個未接受治療的個體和一個相應的接受治療的個體上的表現時，使用的這些術語「減少」，「抑制」，「縮小」，「禁止」，「減小」，「預防」及其他語法上同義的詞(包括「更低」，「更小」等)，意味著接受治療的個體上的這種症狀的數量或級別低於未接受治療的個體，這個數量或級別是通過任何醫務人員驗證的任何可以作為臨床相關性的數量。在有些實施方案中，接受治療的個體上的這種症狀的數量或級別至少比未接受治療的個體低至少10%，25%，50%，75%或90%。此處用到的術語「抑制性化合物」或「抑制劑」，是指任何化合物能夠在特定條件下與已結合配體(例如，糖酵解或氧化磷酸化途徑中的酶類)相互作用(例如，附著或結合)， 以至於其結合配體對其自然配體無反應。抑制性化合物可以包括，但不限於，有機小分子， 抗體，寡核苷酸，及蛋白或多肽。
此處用到的術語「附著」，是指藥物和中間體(或載體)的任何相互作用。附著作用可以是可逆的也可以是不可逆的。附著作用包括，但不限於，共價鍵，離子鍵，範德華力或摩擦力，其類似作用。一個藥物被附著到一個中間體(或載體)上，比如是被浸漬、被合成， 被包裹，被懸浮、被溶解或被混合在中間體中。此處用到的術語「藥物，，或「化合物」，是指任何藥學上的活性物質，能夠被攝入併到達預期效果。「藥物」或「化合物」可以是合成的也可以是自然形成的，非肽、蛋白或多肽， 寡核苷酸或核酸，多糖或糖類。此處用到的術語「被攝入」或「攝入」藥物或化合物，是指任何一種為患者提供藥物或化合物的方法以使藥物或化合物對患者有預期效果。例如，一種攝入方法是通過使用一種醫療設備的間接途徑，例如，但不限於，導管，塗藥器，或注射器。第二種典型的攝入方法是通過直接途徑，例如局部組織攝入(例如，血管外放置)，口服吞食，皮膚藥貼，局部，吸入劑或栓劑。此處用到的術語「患者」，是人或動物個體而且不需要住院就醫。例如，門診病人， 療養院裡的人都是「患者」。一個「患者」可以是任何年齡的人或動物，因此包括成年的和未成年的(例如，兒童)。並不是說「患者」這個詞就意味著需要治療，因此，患者可以是自願的或非自願的加入到臨床試驗或支持基礎科學研究。此處用到的術語「親和力」，是指物質或微粒之間的任何相互吸引力，並使其進入並保持化學作用。例如，與親和力較低的抑制劑相比，一種與受體有高的親和力的抑制劑化合物會有更大的功效來防止這種受體與其天然配體相互作用。此處用到的術語「有效劑量」，是指特定量的藥物組合物，包括一種可以達到臨床良效的治療藥劑(例如，一種OXPHOS抑制劑)。此處用到的術語「蛋白質」，是指任何眾多的自然形成的非常複雜的物質(例如一種酶或抗體)，其由胺基酸殘基通過肽鍵連接而成，包括的元素有碳，氫，氮，氧，通常也有硫。一般而言，蛋白質包括百級數量級的有序的胺基酸。此處用到的術語「肽」，是指任何各種氨基化合物，他們由兩個或多個胺基酸通過一個胺基酸的氨基與另一個的羧基相互結合而形成，並且通常由蛋白質的部分水解而獲得。一般而言，一個肽段包含一個有序的十級數量級的胺基酸。此處用到的術語「藥學上」，或「藥理學上可接受的」，是指當被動物或人攝入時，分子實體或組合物不會產生不利的，過敏的或其他不良反應。此處用到的術語「藥學上可接受的載體」，包括任何所有溶劑，或分散介質，包括但是不限於，水，酒精，多羥基化合物(例如，甘油，丙二醇，及液體聚乙二醇，及其他類似物)， 它們的適當混合物，及植物油，塗料，等滲或吸收延緩劑，脂質體，商業化有效清潔劑，及其他類似物。補充性生物活性成分也可以歸為這類載體。此處用到的術語「純化，，或「分離」，可以是指一種肽類組合物已經經過處理(例如，分餾)去除各種其他組分，這種組合物大幅保持了其表達的生物活性。使用術語「大幅度純化」的地方，是指一種組合物中的主要成分是蛋白或肽，例如構成組合物的大約50%， 大約60 %，大約70 %，大約80 %，大約90 %，大約95 %或更多(例如，重量/重量，或重量/ 體積)。此處用到的術語「提純以均質」是指組合物已經被純化成「明顯的均質性」以至於只有一種蛋白(例如，基於SDS-PAGE或HPLC分析)。一種純化的組合物並不是想要達到一些微量雜質存在的純度。此處提到的術語「大幅度純化」，是指分子，核酸或者胺基酸序列，從其天然環境中移除，分離或區分，並且至少從它們天然結合其他組分中釋放出60%，75%，最好是90%。 「分離多核苷酸」因此實際上是純化多核苷酸。此處用到的術語「核酸序列」或「核苷酸序列」，是指一種寡核苷酸或多核苷酸，及其片段或一部分，及基因組的或起始合成的DNA或RNA，其可能是單鏈的或雙鏈的，並表現為正義鏈或反義鏈。此處用到的術語「一種分離的核酸」，是指任何從天然狀態中分離的核酸分子(例如，從細胞中分離，並且以一種優先的實驗方案從其他基因組核酸中釋放出來)。此處用到的術語「胺基酸序列，，和「多肽序列」，兩者是可以互換的，是指一段胺基酸序列。此處用到的術語「一部分」，當用在一種蛋白上時(例如在「一種給定的蛋白的一部分」)是指那種蛋白的片段。這個片段的大小可能是從四個胺基酸殘基到整個胺基酸片段減去一個胺基酸殘基的片段長度。當提到核酸序列時用到的術語「一部分」，是指那條核酸序列的片段，這個片段的大小可能是從5個核苷酸殘基到整條核酸序列減去一個核苷酸殘基的片段長度。當說到一個小分子與一種蛋白質或肽相互作用時用到的術語「特異性的結合」或 「特異性結合」，意味著這種相互作用是基於蛋白質特殊結構的存在(例如，一種二維或三維空間結構)，換而言之，一個小分子識別並結合到一個特殊的蛋白質上，而不是通常的蛋白質類。例如，一個分子對「A」結構是特異的，包括「A」結構的一種化合物存在於(或游離的， 未標記「A」)一個包含標記「A」的反應中，這個分子就會通過結合的方式減少標記「A」的數
So此處用到的術語「有機小分子」，是指任何一種分子，其大小可以比得上那些通常用於藥物上有機分子。這個術語包括生物大分子(例如，蛋白，核苷酸等)。提到的有機小分子是指大小大約從IODa到5000Da，更好地達到2000Da，最好地達到IOOODa.此處用到的術語「結合」，是指任何控制組合物和表面之間的相互作用。例如，表面被定義為「結合表面」。結合可以是可逆的或非可逆的。這種結合可以是，但是不限於，非共價結合，共價鍵結合，離子鍵結合，範德華力結合或摩擦力，或其他。一種感染控制組合物如果被浸漬，合併，包裹，重懸，溶解或混合等，就會結合到表面上。除非另有鑑定，此處用到的所有的技術上的和科學上的術語與平常的本領域內的一個具有普通技能的人員的理解有相同的意思。此處描述的方法和材料是用於本發明，另外本項工藝中所知的適當的方法和材料也可以被使用。材料，方法和例子只是用作說明的， 並非要限制於此。此處提到的所有的出版物，專利申請，專利，序列，資料庫條目及參考文獻，都以全部引用的方式併入。如果有衝突，本說明書，包括定義，將控制。本發明的其他特點及優勢通過以下的詳細描述，圖形及聲明中展現出來。附圖概述圖IA說明了在葡萄糖豐富的培養液中通過糖酵解和有氧代謝產生ATP的細胞生長。圖IB說明了在葡萄糖豐富的培養液中通過有氧代謝產生多數ATP的細胞生長。
圖IC提供了在IOmM葡萄糖或IOmM半乳糖生長3天的纖維細胞檢測細胞外酸化率(ECAR)和氧耗率(OCR)的代表性數據。數據表示為平均士 SD(n = 5)圖ID展示了暴露在0.5 μ M寡黴素(複合物V)和0. 1 μ M抗黴素(複合物III)氧耗抑制劑後，檢測生長在葡萄糖和半乳糖的纖維細胞OCR的代表性數據。數據表示為士SD， 其表明P 0. 0)和快速細胞增殖抑制劑(S葡萄糖/半乳糖< 0. 0)。圖3A的代表性數據展示了 3天孵育後，MCH58細胞在氯苯甲嗪濃度變化的細胞生存能力(鈣黃綠素AM 燃料)。實線葡萄糖豐富培養液。洗脫線半乳糖豐富培養液。數據描述為平均+/-SD (η = 5)。圖;3Β的代表性數據展示了 3天孵育後在氯苯甲嗪濃度變化時，MCH58細胞的ATP 水平(CellTiter-Glo )。實線葡萄糖豐富培養液。洗脫線半乳糖豐富培養液。數據描述為平均+/-SD (n = 5)。圖3C的代表性數據展示了在3小時內，暴露在不同濃度氯苯甲嗪的MCH58細胞，其在OCR從DMSO基線的變化。每7分鐘檢測一次。5個重複的平均值如圖中所示。圖3D提供了在3小時內，暴露在不同濃度氯苯甲嗪的MCH58細胞，其在ECAR從 DMSO基線的變化的典型數據。每7分鐘檢測一次。5個重複的平均值如圖所示。3E-I的線性圖表展示了氯苯甲嗪對包括氧耗的獨立線粒體生物能量參數的急性影響，該反應是以穀氨酸/蘋果酸(3E)，琥珀酸(3F)或丙酮酸/蘋果酸(3G)作為底物。5 個獨立檢測有代表性。(圖3H)用四甲基羅丹明甲酯(TMRM)檢測氯苯甲嗪在獨立線粒體膜的潛在急性影響。5個獨立檢測有代表性。(圖31)氯苯甲嗪在獨立線粒體NADH的急性影響。5個獨立檢測有代表性。在指明時間點加入線粒體(Mito)，穀氨酸和蘋果酸(G/M)，琥珀酸(S)，丙酮酸/蘋果酸(P/M)，氯苯甲嗪(Mec)或DMSO，ADP和羰基氰化物氯苯胺(CCCP)。圖3J的代表性數據展示了在葡萄糖或半乳糖豐富的培養液中，氯苯甲嗪在一段時間對細胞生存能力的影響。MCH58纖維細胞生長在IOmM葡萄糖或IOmM半乳糖中，用 50μΜ氯苯甲嗪處理至3天。在每個時間點，用CellTiter-Glo相對螢光試驗(RLU)計算細胞內ATP水平。數據表示為超過DMSO對照士SD (n = 5)的平均倍數變化。圖;3Κ的線性圖表展示了氯苯甲嗪在從老鼠心臟分離的最初心肌細胞抑制呼吸。 心肌細胞暴露在氯苯甲嗪指示濃度後，在呼吸代謝箱測定氧耗。典型的呼吸影響如圖所示。圖3L的線性圖表展示了氯苯甲嗪在從老鼠胚胎分離的最初皮層神經細胞抑制呼吸.在時間為0(分鐘)時，在Ε14-15天胚胎獲得的最初老鼠皮層神經細胞加入氯苯甲嗪 (5和10 μ Μ)或抗黴素(1 μ Μ)測定氧耗率(OCR)。數據表示為平均+/-SD (η彡3)。圖3Μ-Ν的柱狀圖展示了氯苯甲嗪不能改變線粒體DNA拷貝數(3Μ)或線粒體mRNA 表達(3N). *P < 0. 001 ；雙面t檢驗(每個η = 3)。圖4Α說明了具有代表性的全基因組RNA數據概況，該數據展示了在細胞生長中對於i)穀氨醯胺酶(GLS) ；ii)己糖激酶(HK2) ；and iii)硫氧還蛋白(TXNIP)的mRNA水平， 該細胞生長在50 μ M氯苯甲嗪或DMSO處理過的葡萄糖中。數據描述為平均士SE ；通過雙面檢驗 P < 0. 05 (n = 3)。圖4Β的典型數據展示了細胞的生存能力(Cell titer_Glo )，該細胞生長經過 DMSO或50 μ M氯苯甲嗪，20mM穀氨酸和2. 5mM穀氨酸二甲酯鹽酸鹽處理後的葡萄糖培養液。DMSO-實心柱狀圖。氯苯甲嗪-空心柱狀圖。圖4C的典型數據展示了細胞的生存能力(Cell titer-Glo )，該細胞生長經在 DMSO或50 μ M氯苯甲嗪，20mM穀氨酸和2. 5mM穀氨酸二甲酯鹽酸鹽處理後的半乳糖培養液。DMSO-實心柱狀圖氯苯甲嗪-空心柱狀圖。圖5A的典型數據展示了突變STHdhQlll/111鼠科紋狀體細胞的ATP水平，該細胞描述了去除血清與不去除血清，暴露50 μ M氯苯甲嗪與不暴露50 μ M氯苯甲嗪的變異亨廷頓蛋白。數據表示為平均士SD，雙面t檢驗表明P <0.01 (n = 3)。圖5Β的典型數據展示了在對照STHdhQ7/7鼠科紋狀體細胞的ATP水平，該細胞描述了去除血清與不去除血清，暴露50 μ M氯苯甲嗪與不暴露50 μ M氯苯甲嗪的野生型亨廷頓蛋白。數據表示為平均士SD，雙面t檢驗表明P <0.01 (n = 3)。圖5C的典型數據展示了突變HD細胞生存能力對氯苯甲嗪的劑量反應。 CellTiter-Glo 試驗確定細胞生存能力，以相對於DMSO處理細胞的倍數變化來表示。實線代表了非線形回歸。數據描述為平均士SD(每個數據點η = 3)。
圖5D的典型數據展示了移去血清和暴露DMSO或50 μ M氯苯甲嗪後的3個時間點， Western blot分析從突變HD細胞提取的蛋白。圖5E的典型數據展示了 16種藥物和DMSO孵育後的細胞生存能力 (CellTiter-Glo )。通過藥物靶組織化合物。血清處理作為陽性對照。數據表示為平均 ±SD (n = 3每種藥物).圖5F的典型數據展示了在昆蟲中氯苯甲嗪的劑量反應曲線，對照19Q或128Q描述了該曲線。24h同時以血清和50 μ M氯苯甲嗪處理與不處理，STHdhQl 11/111紋狀體細胞的明視場典型顯微圖片(20Χ)如圖5G所示。暴露在不同濃度氯苯甲嗪200分鐘，MCH58纖維細胞氧耗率(OCR)的典型變化數據如圖6A所示。數據表示為平均+/-SD (η = 3)。暴露在50 μ M氯苯甲嗪6小時後，MCH58纖維細胞乳酸生產率典型變化數據如圖 6Β所示。η = 6 ；意味著ρ ；3)。在含有培養液的葡萄糖中，暴露在50 μ M氯苯甲嗪或DMSO對照200分鐘後，多種類型細胞的氧耗率變化(OCR) 如7A所示，細胞外酸化率(ECAR)如7B所示。數據描述為平均+/-SD (n ^ 3)。意味著ρ < 0. 05 ；兩面t檢驗法計算ρ值。在HeLa細胞(圖.A和B)，HEK 293細胞(圖.8C和8D)，老鼠永生化紋狀體細胞 STHdhQ7/7 (圖8E和8F)，50 μ M氯苯甲嗪對氧耗率(OCR)和細胞外酸化率(ECAR)的影響的典型數據如圖8A-F所示。數據標準化為DMSO對照；數據描述為平均+/-SD (η彡3).。圖9的線性圖表展示了在293個細胞中，與傳統的0XPH0S抑制劑相比，超過DMSO 基線以氯苯甲嗪介導的氧耗率(OCR)減少的時間進程。數據描述為+/-SD(n ^ 3)。

圖10Α-10Β的典型數據展示了氯苯甲嗪對HIF-I α穩定性的影響。在圖10Α中， 在6h以0. l%DMS0，100yM去鐵胺(DFO)或50 μ M氯苯甲嗪治療後，通過提取HeLa細胞蛋白 western blot 分析檢測 HIF-1 α 和 HIF-2 α。6 小時以 DMS0，100 μ M DFO 或 50 μ M Mec 處理，圖10Β的柱形圖展示了短暫地轉染HeLa細胞測量HIF受體活性。NTC指的是沒有轉染的對照。數據代表了 2個各3次重複的獨立實驗。(乍<0.05;雙面丨-檢驗).在葡萄糖豐富的培養液中暴露在50 μ M氯苯甲嗪6小時(η = 3)後，圖IlA的代表性數據鑑別了 MCH58細胞的不同表達基因(FDR < 0. 175)，通過Affymetrix U133 plus2. 0 基因表達試驗測定其mRNA水平。圖IlB的代表性數據展示了通過qRT-PCR測量GLS的表達(n = 3, *P < 0. 005)。圖12Α的代表性數據展示了 shRNA靶向GLS減少了 GLS的表達。圖12Α的代表性數據展示了在穩定轉導shGLS細胞中，shRNA靶向GLS減少了細胞內 OCR (η = 5，*Ρ UAS-Htt-QUS成年D.黑腹果蠅(十天飼養期).提取的溶菌產物進行Western blot分析。圖20的代表性數據展示了在QU8表達的線蟲PLM神經細胞氯苯甲嗪對其蛋白聚集體的影響。33 μ M氯苯甲嗪處理後通過光學顯微鏡檢測Htt-QUS聚集體的形成。在80 個昆蟲中至少180PLM神經細胞被計算在內(n = 3)。圖21Α的代表性數據展示了 DMSO或33 μ M氯苯甲嗪對128Q線蟲軸突障礙性疾病的影響的螢光圖片。柱形圖大小意味著5 μ m。圖21B的代表性數據展示了在128Q表達的線蟲PLM神經細胞氯苯甲嗪對軸突腫脹的影響。在Htt-QU8表達的昆蟲PLM神經細胞，DMSO或33 μ M氯苯甲嗪處理後光學顯微鏡觀察軸突腫脹。至少計算80個昆蟲的180個PLM神經細胞(n = 3， UAS_Htt_Q128) 的果蠅在羽化時每個小眼有7個可見光收集單位(視杆細胞)的正常互補區。圖22B展示了表達突變Htt-QU8 (elav-GAL4 > UAS-Htt-Q 128)的果蠅在羽化後視杆細胞數量在減少， 退化加快。圖23的代表性數據展示了在黑腹果蠅體內HD模型中，氯苯甲嗪解救的神經元虧損。轉基因人類HD-Q128中的神經細胞使用了 elav-GAL4，其導致了時間依賴性神經退行性疾病，這可作為對可見視杆細胞的數量估計。果蠅以DMSO賦形劑或33 μ M氯苯甲嗪處理 10天，計算每個小眼的視杆細胞的平均數量，其分布如圖所示。數據表示為士SD(n = 2,*p 3。意味著雙面t檢驗ρ < 0.01。在PBS中將氯苯甲嗪溶入10% Cremaphor EL溶液(Sigma No. C5135)，用NaOH調pH為中性。圖25A為葡萄糖和氧氣的對照頂數據。圖25B 保護性頂數據代表了氯苯甲嗪，葡萄糖和氧氣的功能。圖沈展示了 Subclass I中二甲亞碸派生物結構的代表性化合物。圖27A展示了 Subclass II中三環結構的代表性化合物。圖27B展示了 Subclass III中硫代二苯胺的代表性化合物。圖觀展示了抗組胺劑的代表性化合物。圖四展示了 diphenylpiperazine結構的代表性化合物。圖30展示了烷氧基聯二苯結構的代表性化合物。圖31展示了聯二苯(烷氧基)結構的代表性化合物。圖32展示了三環結構的代表性化合物。氯苯甲嗪對暴露在局部缺血-再灌注(I/R)的獨立心肌細胞的影響如圖33A-33C 所示。圖33A簡要展示了實驗設計。圖33B的直方圖展示了心肌細胞I/R後在對照，未處理和藥物處理(Mec，氯苯甲嗪；Atrop，阿託品；Phenir，苯比胺；Pyril，美吡拉敏Jcopo，莨菪鹼)的生存能力。圖33C的直方圖展示了在對照，未處理和氯苯甲嗪處理中的心肌細胞 I/R 後的 V02。圖34A-B包含的數據展示了在獨立心臟中氯苯甲嗪的保護作用。圖34A的線性圖表展示了在細胞賦形劑(開放的環)和氯苯甲嗪處理(閉合的環)的心臟中增壓前和I/R 後的百分率。圖34B的線性圖表展示了在細胞賦形劑(開放的循環)和氯苯甲嗪處理(封閉的循環)的心臟中檢測的梗死區大小。圖35A-35C包含的數據展示了在中風動物模型中氯苯甲嗪的保護性作用。35A是哺乳動物中風模型的方案。在大腦動脈短暫閉塞中間前lh，分別在Hh和池以100mg/kg的氯苯甲嗪，20mg/kg美吡拉敏和0. 5mg/kg莨菪鹼或賦形劑對雄性C57BL/6小鼠進行兩次腹腔注射，然後24h再灌注。圖35B表示以氯苯甲嗪，莨菪鹼，美吡拉敏或賦形劑處理的小鼠， 從該小鼠內獲得的以TTC著色的Imm後的冠狀切片，以此計算梗死體積。數據點指的是相對獨立的實驗，實線代表了他們的平均值(賦形劑和莨菪鹼乍< 0. 05，和美吡拉敏乍< 0. 01 一步ANOVA後是Tukey的多重比較實驗)。以氯苯甲嗪，莨菪鹼，美吡拉敏或賦形劑處理，在共同頸動脈(CCA)和中部大腦動脈(MCA)閉塞後，在基線處檢測的大腦血流量(CBF)如圖 35C所示。數據表示為平均士s. d.圖35D的線性圖表展示了以氯苯甲嗪，莨菪鹼，美吡拉敏或賦形劑處理，在大腦 (切片1-10)的梗塞範圍變化。數據點代表了在個體切片水平差異中(賦形劑η = 14，氯苯甲嗪η = 8，美吡拉敏η = 8，莨菪鹼η = 5*Ρ < 0. 05).梗塞士 s. d. mm2的平均範圍。圖36的柱形圖展示了在賦形劑，S-氯苯甲嗪和二甲雙胍處理的C2C12肌小管中以分鐘為單位檢測的本底葡萄糖攝取量。發明詳述正如本文所述，通過化合物篩選策略來篩選能量代謝調節劑，鑑定線粒體代謝 (如氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)和或糖酵解(glycolysis))的小分子抑制物。氯苯甲嗪(meclizine)被確定為線粒體代謝的幹擾劑，可以用於防止細胞死亡，例如， 與細胞死亡相關的缺血性損傷(ischemic insult)或細胞退化性疾病，如神經退化性疾病或糖尿病。化合物篩選策略旨在鑑別從線粒體呼吸到有氧糖酵解(aerobic glycolysis)的小分子誘導代謝轉換開關，反之亦然。氯苯甲嗪，一種通過此篩選方法確定的小分子化合物，可以抑制線粒體呼吸和激活有氧糖酵解，顯然是通過一種新的代謝機制即抑制PCYT2 來完成。這種代表性藥物也抑制在細胞和動物模型中的神經退化性疾病的表型。在一些實施例中，本發明可利用細胞代謝的可塑性來開發用於治療很多與能量平衡相關的疾病的藥物。雖然此項發明的作用機理並不重要，我們認為上述篩選策略包括代謝狀態依賴性的致死率並利用哺乳動物細胞的代謝可塑性。大多數細胞在提供營養物質的前提下有能力進行有氧糖酵解或氧化磷酸化。在分化和發育階段，存在長期的、適應性的氧化磷酸化(0XPH0Q和糖酵解之間的轉換，並且可以由轉錄和轉錄後調控機制來進行驅動，例如 Moyes et al.，J.Exp Biol. 208 :1601 (2005)。在葡萄糖作為唯一糖源下生長的細胞都通過糖酵解以及線粒體穀氨醯胺氧化途徑來獲取三磷酸腺苷(ATP)，只有一小部分葡萄糖碳骨架(skeleton)進入檸檬酸循環(TCA cycle)。(Reitzer et al.，J Biol Chem 254:2669(1979) ；DeBerardinis et al.，PNAS USA 104 :19345(2007))然而，當細胞在半乳糖存在下生長時，幾乎所有的ATP都是通過線粒體穀氨醯胺氧化得來，且半乳糖碳骨架用來還原生物合成(biosynthesis)。代謝狀態依賴致死率篩選可以通過選用類似哺乳動物版的經典酵母在發酵和非發酵培養基中生長的生長實驗來得到功能性驗證。該方法被來用診斷人類的線粒體呼吸鏈缺陷疾病。(Robinson et al.，Biochem Med Metab Biol. ,48 :122(1992))。這裡公開的篩選試驗可用於鑑別化合物，例如可以將細胞代謝向氧化磷酸化轉換並減緩快速繁殖細胞的生長率和存活的小分子(這種化合物可以起到治療癌症的效用)， 以及新的氧化磷酸化抑制劑小分子。這種篩選機制可以在完整的細胞中進行，例如，經過72 小時的藥物治療，從而確定能夠通過新的機制降低氧化磷酸化的試劑，包括在葡萄糖作為唯一糖源的情況下不影響細胞生長或存活的相對無毒的試劑。細胞能量代謝和疾病線粒體是細胞能量的加工廠，它能夠將我們吃的食物轉換為細胞能量流通貨幣 ATP0越來越多的證據表明，抑制線粒體呼吸實際上可以在一系列的疾病中起保護作用，包括糖尿病、阿爾茨海默氏病(Alzheimer's disease，AD)、帕金森病(Parkinson's disease, PD)、亨廷頓病(Huntington，s disease, HD)，以及缺血性疾病像中風(stroke)和心肌梗
O0XPH0S到糖酵解途徑是如何轉換的？現有研究表明，基因突變導致的HD，AD, PD 和肌萎縮側索硬化(Amyotrophic Lateral Sclerosis,ALS)通過與電子傳遞鏈的不同組分相互作用，從而導致改變線粒體的鈣運輸，氧化損傷(oxidative damage)，壞死或凋亡細胞死亡。(Knott et al. , Nat Rev Neurosci 9 505 (2008)) 一個功能性的線粒體呼吸鏈可能加劇突變蛋白的毒性。就像在細胞和動物模型中進行的遺傳和化學修飾研究所證明，通過調控電子傳遞鏈的活力，從而提供一種減少疾病病理發生途徑的潛在手段。例如Buttner et al. , J Biol Chem 283,7554(2008) ；Fukui et al. , Proc Natl Acad Sci USA 104, 14163(2007)；禾口 Varma et al.，Proc Natl Acad Sci USA 104 :14525(2007) 在 AD、PD、 HD的動物模型研究中發現，遺傳或藥理抑制線粒體呼吸鏈可以抑制疾病的病理發生途徑。 神經元特異性細胞色素C氧化酶缺陷型小鼠(雜合IV型)實驗證實，當表達澱粉樣蛋白 (amyloid)前體或早老素1 (presenilin 1)時，形成的一些澱粉樣蛋白斑塊會減少，氧化損傷也降低。Fukui et al. ,PNAS USA 104 :14163Q007)。在表達 α -突觸核蛋白(synuclein) 的酵母中，通過消耗線粒體DNA來去除線粒體呼吸，可以減少活性氧簇(reactive oxygen species, R0S)的形成和細胞凋亡。因此，抑制線粒體功能可以抑制由等位基因疾病引起的毒性。(Buttner et al.，JBC 283 :75M_756(K2008))由魚藤酮(rotenone)和寡黴素 (oligomycin)介導的藥理性抑制呼吸鏈可以在細胞培養過程以及HD體內模型實驗過程中防止細胞凋亡發生。(Varma et al.，PNAS USA 104 14525 (2007)) 二甲雙胍(Metformin)，糖尿病的一種有效治療藥物，被認為參與了抑制線粒體呼吸鏈，從而激活了一些自適應途徑包括提高腺苷酸激酶(AMP Kinase, AMPK)活性，促進外圍對葡萄糖的攝取，並抑制肝臟糖異生(gluconeogenesis)。(Leverve et al. , Diab. Metab. 29 :6S88-94 (2003)) 0 二甲雙胍是目前最廣泛應用的II型糖尿病的治療藥物之一。按照本文描述方法確認的抑制0XPH0S的其它化合物，像氯苯甲嗪(meclizine)或 S-氯苯甲嗪，也是治療糖尿病的候選治療藥物。此外，其他研究者已經提出，那些阻斷線粒體呼吸的試劑可以在心臟或大腦缺血再灌注(reperfusion)後，預防細胞損傷和死亡發生。(Chen et al.，Am JPhysiol Cell Physiol 292 :C137(2007)，and Huber et al.，Neuropharmacology 48 :558(2005)) 用於二級預防中風(stroke)的的他汀類藥物和其他藥物的神經保護作用可能是由於這些藥物引起輕度抑制線粒體呼吸鏈。見Huber et al., Neuropharmacol 48 558 (2005)) 用 II 型複合物抑制劑 3-硝基丙酸(3-nitropropionic， 3-NPA)預處理，可以在局部和全腦缺血的小鼠中誘導耐受性。將之前報告的這些關於OXPHOS抑制劑的治療效果的研究結果轉化存在一個很大的限制，那就是缺乏臨床上可接受的用於轉變病人體內細胞對線粒體呼吸的依賴性的策略。目前所知的OXPHOS抑制劑直接阻斷呼吸鏈，表現出不佳的治療指數(therapeutic index)，並且有毒性。由於其作用迅速，OXPHOS抑制劑往往能夠快速中斷呼吸鏈，產生自由基損傷和迅速消耗細胞三磷酸腺苷，尤其在氧化的細胞中。見圖9所示。雖然激活組織缺氧誘導因子途徑可以將能量代謝調向糖酵解來提供另一種潛在治療途徑，但是很少有臨床上可以接受的激活這種途徑的策略。(Lu et al.，J Biol Chem 283 =28106(2008)； Aragones et al. , Nat Genet 40 170 (2008) ；and Giaccia et al. , Nat Rev Drug Discov 2 :803(2003)) ο在一些實施例中，本發明提供通過對OXPHOS減少的數量或水平來滴定，即OXPHOS 的部分衰減，而不是完全抑制線粒體的0XPH0S，使得伴隨完全抑制OXPHOS的毒副作用不出現或降到最低的方法。(滴定的能力，可以使用劑量反應分析檢測；或全有或全無反應的化合物(例如，一個階躍函數(st印-function)響應)是不合適的，因為他們是不可滴定的， 而那些有一個平滑的劑量反應曲線的藥物則是可滴定的)。這些可滴定的藥物將有望提高治療指數。相反，快速增長的細胞(如腫瘤細胞)主要依靠糖酵解的能量。因此，確定化合物具有低\lu/gal(例如，化合物Sgwgal低於零，例如\lu/gal在-0. 33到-0. 75之間)可以作為治療癌症的藥物或作為其他癌症治療藥物的佐劑。Lampidis et al.，U. S. Pat. No. 7，338，940專利公開的用於治療癌症的組合物和方法旨在單獨抑制厭氧增長的腫瘤細胞(即，這些細胞在腫瘤核心)的糖酵解和或結合抑制來源於同一腫瘤的有氧生長的腫瘤細胞(即，這些細胞在腫瘤邊緣)的氧化磷酸化。文獻側重於六類糖酵解抑制劑i) 2脫氧-D-葡萄糖類似物；ii)D-己糖吡喃糖(hexopyranose) 類似物；iii)C-2葡萄糖異構物；iv)C-3，C-4葡萄糖異構物；ν)甘油類似物；和vi)乳酸脫氫酶抑制劑。然而，如文獻公開所述，由於細胞從有氧到厭氧代謝轉換，氧化磷酸化抑制劑(即，羅丹明(rhodamine) 123)導致乳酸增加。這種狀況增加了他們對糖酵解抑制劑的敏感性。此外，該文獻提到了傳統上使用的抗癌藥物(即，阿黴素(doxorubicin)， 長春新鹼(vincristine)，紫杉醇(paclitaxel))在有氧且無乳酸積聚的環境下是有效的(即，沒有反映抑制氧化磷酸化)。因此，文獻建議通過使用一種方法測量乳酸積聚可用於廣泛篩選結構不同的化合物庫，以確定抑制氧化磷酸化的化合物，從而使腫瘤對糖酵解酶抑制劑敏感。然而，文獻沒有提到通過比較細胞在葡萄糖和半乳糖培養基中生長來確認非毒性的糖酵解抑制劑，即有效的抗癌藥物。(dated 3/4/2008 ；See also U. S. Patent No. 7，160，865(dated 1/9/2007) ；U. S. Patent Application No. US 2006/0025351， 2005/0043250 and 2003/0181393 ；and WIPO Publication No. W0/2001/082926 selected parts.) οRossignol et al. , Cancer Research，64 :985_993，2004 報導研究癌細胞或者適應糖酵解或者適應氧化磷酸化，取決於提供能量來源的葡萄糖和半乳糖的使用。進一步文獻揭示，當葡萄糖不可用而癌細胞只能靠糖酵解產生能量時，癌細胞能夠利用穀氨醯胺酶解，穀氨醯胺氧化產物。文獻沒有提到通過比較細胞在葡萄糖和半乳糖培養基中生長來確認非毒性的或者氧化磷酸化或者糖酵解抑制劑。治療方法通過本發明的方法確認的組合物，例如文中提到的化合物，由於他們具有調控線粒體氧化磷酸化的能力，所以可以用來治療人類疾病或延緩疾病發展，其中OXPHOS活力可能有助於疾病形成，或者抑制OXPHOS可以激活細胞的自適應程序從而幫助預防疾病發生。 例如，線粒體OXPHOS活性有助於形成的疾病，包括但並不局限於，糖尿病例如II型糖尿病、 神經退化性疾病、以及缺血再灌注損傷例如中風、腎缺血性損傷、缺血性心臟病。另外，如下面描述的與寄生蟲(parasitic)如某些原生動物(protozoan)寄生蟲感染相關的疾病也可以治療。所有這些疾病都可以用經確認為OXPHOS抑制劑的化合物來治療，比如說一種具有高\lu/gal評分的化合物，例如氯苯甲嗪。例如，篩選出來的藥物\lu/gal評分大於零則可以作為一種非毒性的OXPHOS抑制劑，可以用於治療神經退化性疾病或缺血性疾病，糖尿病，或寄生蟲感染。已經確認的化合物，例如這裡提到的氯苯甲嗪，可以作為藥物或繼續開發用於治療文中提到的由線粒體 OXPHOS活力引發的疾病。另外，篩選出來的藥物、u/gal評分低於零則可能有潛在的治療癌症的用途。正如本文所述，氯苯甲嗪作用於PCYT2，從而擾亂在所有真核細胞都作為主要磷脂(phospholipid)的磷脂醯乙醇胺(phosphatidylethanolamine)的合成。磷脂醯乙醇胺合成可以通過(DKermedy途徑的⑶P-乙醇胺分支；(ii)磷脂醯絲氨酸 (phosphatidylserine)的脫羧(decarboxylation)途徑；或(iii)基於磷脂醯絲氨酸的交換途徑來完成。在哺乳動物包括人類，所有三個途徑都可用。然而，在某些原生動物病原體 (pathogen)包括布氏錐蟲(Trypanosomabrucei)，這個引發人類和動物的非洲錐蟲病(昏睡病(slewing sickness))的病原體；克氏錐蟲，一種引起美洲錐蟲病(Chagas disease) 的寄生蟲；和惡性瘧原蟲，人類瘧疾寄生蟲，他們的磷脂醯乙醇胺主要都是通過Kennedy途徑合成的。因此，像氯苯甲嗪針對PCYT2擾亂這一途徑的化合物可作為治療藥物，用於治療靠PCYT2介導磷脂醯乙醇胺合成途徑的這些寄生蟲所引起的疾病。細胞退化性疾病本文描述的方法包括治療像神經退化性疾病的細胞退化性紊亂。該方法可以包括給那些已經或正在發展為退化性疾病的患者攝入像氯苯甲嗪這類具有高\lu/gal評分的化合物。可以用這些方法治療的疾病包括阿爾茨海默氏病(AD)，帕金森病(PD)，亨廷頓病 (HD)，肌萎縮側索硬化(ALQ和弗裡德賴希氏共濟失調(Freidreich ataxia) 0線粒體代謝抑制劑已被證明在亨廷頓型病模型中可以挽救細胞死亡(Varma et al, Proc NatlAcad Sci U S A. 2007)，這種線粒體的代謝功能對老齡化酵母中α-突觸核蛋白毒性發生尤其需要(Buttner et al.，J Biol Chem. 2008)。正如本文所示，氯苯甲嗪對三種不同亨廷頓病模型中能夠起到防止神經細胞死亡和細胞營養不良。糖尿病此外，本方法可用於治療糖尿病。抑制線粒體呼吸鏈激活幾種自適應途徑包括提高AMP激酶(AMPK)活性，從而促進在外圍對葡萄糖的攝取，並抑制肝臟糖異生途徑。 (Leverve et al.，Diab. Metab. 29 :6S88_94 (2003))。二甲雙胍，其功效至少部分是通過這一機制來完成的，是目前廣泛應用的II型糖尿病的治療藥物之一。正如本文所述，氯苯甲嗪和S-氯苯甲嗪能夠抑制培養的肌肉細胞的OXPHOS並激活AMPK活性(見圖MC)，促進培養的肌肉細胞對葡萄糖的攝取(圖36)，降低R6小鼠的血糖水平(圖37)。缺血性紊亂本文所述方法包括治療缺血再灌注損傷相關的疾病，包括心肌缺血(myocardial ischemia),腦缺血(cerebral ischemia)禾口腎缺血(renal ischemia)。例如，對易患或存在心肌缺血高風險的患者，該方法可用來在心臟手術過程如心臟移植、經皮冠狀動脈介人治療(percutaneous coronary intervention, PCI)、或冠狀動脈旁各搭橋術(coronary artery bypass graft, CABG)、和不穩定型心絞痛(angina)期間快速保護心肌、防止心肌損傷。該方法可以包括給冠狀動脈疾病患者攝入像氯苯甲嗪這類具有高\lu/gal分值的化合物，作為抗心絞痛藥物。對於那些已經患上腎缺血或具有患上腎缺血風險的患者，在冠狀動脈旁路搭橋手術時，具有高\lu/gal值的化合物例如像氯苯甲嗪可以用來減輕急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)，並減少移植損傷。對於那些已經患上或具有患上腦缺血風險的患者，在頸動脈內膜切除手術(carotid endarterectomy, CEA)或冠狀動脈旁路搭橋手術期間，具有高、u/gal評分的化合物例如氯苯甲嗪可以用來降低中風的風險或中風帶來的損傷，並且可以防止蛛網膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)後二次缺血。 特別是，這些化合物可用於治療短暫性腦缺血發作(transient ischemic attack, TIA)或輕微中風，或具有中風風險或在30天內中風復發風險的患者(例如，剛發生完出血性中風 (hemorrhagic stroke)的患者，或即將接受伴隨缺血再灌注損傷風險的手術例如器官移植、經皮冠狀動脈介入治療、冠狀動脈旁路搭橋或頸動脈內膜切除等手術的患者)。當患者即將接受伴隨缺血再灌注損傷風險的手術，這類化合物可以在手術前、手術過程中或手術後攝入。因此，由文中所描述的方法確認的組合物，例如氯苯甲嗪這類具有高\lu/gal評分的藥物適用於治療缺血性紊亂疾病，包括但不限於中風、缺血性心臟病(例如心臟病發作或心絞痛)、再灌注損傷。缺血性心臟病缺血性心臟病是醫生用來描述由於冠狀動脈疾病導致的充血性心臟衰竭的一個術語。「缺血」，是指器官(如心臟)得不到足夠的血液和氧氣。當動脈血液和氧氣往心臟運輸過程中被阻斷時發生缺血性心臟疾病。在用於輸送氧氣到心臟肌肉組織的動脈中可能積聚了稱為斑塊的膽固醇(cholesterol)和其他物質。缺血性心臟疾病是充血性心臟衰竭的常見病因。患有這種疾病的患者可能曾經有過心臟病發作、心絞痛、或不穩定型心絞痛。 一些患者可能並沒有注意到任何前期症狀。在美國，缺血性心臟病是心肌病的一種常見類型，大約影響著百分之一的人群，病發人群主要出現在中年到老年男子中。患缺血性心臟病的危險因素包括但不局限於個人或家族有心臟病發作、心絞痛、 不穩定型心絞痛、動脈粥樣硬化或其他冠狀動脈疾病、高血壓、吸菸、糖尿病、高脂飲食、高膽固醇和肥胖的歷史。缺血性心臟病的症狀包括但不局限於胸部疼痛，局部性的胸骨下但可以移動(從中心向四周擴散)到脖子、下巴、背、肩、臂且伴隨著緊張、壓力、不能站起來和或擠壓的感覺(疼痛可能會或不會隨著休息或注射硝化甘油得到緩解)、心悸、不規則或快速脈搏 (rapid pulse)、呼吸急促、咳嗽、疲乏無力、頭暈、警覺性下降或注意力不集中、白天尿量減少、晚上排尿過多和全身腫脹。測量射血分數(ejection fraction)測試可用於診斷缺血性心臟病，包括但不局限於超聲心動圖、心導管插入術(cardiac catheterization)期間的腦室造影照片 (ventriculogram)、門控斷層顯像(gated SPECT)、胸部核磁共振成像(MRI)、心電圖(ECG) 或心臟活檢。目前的治療目標是緩解症狀和解決致病起因。目前給藥的幾種類型的藥物，包括但不局限於血管緊張素(angiotensin)轉換酶抑制劑(如卡託普利(captopril)或賴諾普利(Iisinopril))、β -腎上腺素(adrendergic)阻滯劑(如美託洛爾(metoprolol)或卡維地洛(carvedilol))、或利尿劑(diuretic)(如呋塞米(furosemide))(速尿(Lasix))、 安體舒通(spironolactone)、或依普利酮(印lerenone)。這裡描述的方法包括這些治療方法與氯苯甲嗪相結合，分別實施或組成單一組合物進行實施。腦缺血或中風中風是一個中斷向大腦任何部位供應血液的症狀。中風有時也被稱為「brain attack」。大約每40秒鐘，美國就會發生一例中風。中風在如下條件下會發生i)向大腦供應血液的血管被血凝塊堵塞(例如缺血性中風)， )血管破裂，導致血液滲漏到大腦(例如出血性中風)。如果血流停止時間超過幾秒，大腦得不到血液和氧氣，腦細胞就會死亡，造成永久性損傷。缺血性中風是中風的一個常見類型。通常這種類型的中風是由動脈阻塞導致的， 這種情況被稱作動脈粥樣硬化。脂肪、膽固醇和其他物質在動脈壁聚集則會形成一種粘性物質，稱為斑塊。隨著時間的推移，斑塊積聚。這往往使得血液很難正常流動，從而導致血液凝結。其他引起血栓相關的缺血性中風的原因，包括但不局限於不正常的心臟瓣膜 (abnormal heart valve)、心內膜炎(endocarditis)或存在一個機械性心臟瓣膜。例如血栓能夠在心臟瓣膜形成，中斷，然後傳播到大腦。因為這個原因，那些能夠形成機械性或不正常心臟瓣膜的藥物往往是處方的抗凝血藥物(例如香豆素(Coumadin))。出血性中風也是一種常見的中風類型。通常這種類型的中風是由腦出血導致的。 它可以在大腦中的小血管變得軟弱和爆裂時發生。某些大腦血管存在缺陷的人更容易出現此現象。當血管破裂損害腦細胞後就會出現腦出血。缺血性中風的危險因素包括但不局限於高血壓、糖尿病、家族病史、心臟病高膽固醇或老齡化。某些藥物使血液凝塊的可能性更大，可能會增加中風的風險(如某些口服避孕藥(contraceptive))。出血性中風的危險因素包括但不局限於飲酒、出血疾病、吸食古柯鹼(cocaine) 或頭部創傷。中風的症狀取決於大腦的哪個部分受損。在某些情況下，一個人甚至不可能意識到他或她中風了。症狀往往來得突然，沒有任何預兆。他們可能是偶發(印isodic)(突然發生，然後停止)或可能隨著時間的推移慢慢變得更糟。一般中風的症狀包括但不局限於警覺性發生變化、昏睡(coma)、嗜睡(lethargy)、瞌睡(sle印iness)、不省人事(stupor)、失去知覺(unconsciousness)、情緒低落(emotional withdrawal)、說話困難或理解能力低下、吞咽困難、讀寫困難、頭痛、散失協調、失去平衡、獨自行動困難、噁心(nausea)或嘔吐 (vomiting)、抽搐(seizure)、自我感觀改變、突然混亂、全身虛弱或視力出現問題。診斷中風的測試可以包括但不局限於進行腦血管造影、完整血小球計數、凝血素(prothrombin)活化時間、部分促凝血酶原激酶(thromboplastin)活化時間、心電圖 (ECG)超聲心動圖、頸動脈多譜超聲(carotid duplex ultrasound)、腦部CT、腦部核磁共振成像(MRI)、核磁共振造影(magnetic resonance angiography, MRA)、血管造影(CT angiography)目前的治療通常需要立即(即缺血性中風事件發生3小時內)給藥使用溶栓 (thrombolytic)藥物(例如，對苯二甲酸(tPA))。值得注意的是，如果中風是出血性而非缺血性，溶栓可以使損傷變得更重。對於出血性中風而言，需要進行手術來清除匯集於大腦的血液和修復受損血管。在其他情況下，由於有血液凝塊，採用肝素(heparin)和香豆素抗凝血劑來治療中風。阿司匹林也可以使用。另外可能需要其他藥物來控制其他症狀，像高血壓。止痛藥 (Painkiller)用來控制劇烈的頭痛。長期治療的目的是為了幫助病人恢復儘可能多的功能，防止將來中風。恢復時間和需要長期治療因人而異。根據症狀，康復(rehabilitation) 可能包括但不局限於專業治療、物理治療或言語治療。腎缺血急性腎損傷(Acute kidney injury, AKI)可由腎缺血導致。例如，在所有諸如冠狀動脈旁路搭橋手術的高風險手術中AKI達到了 5%。用氯苯甲嗪或S-氯苯甲嗪預處理可以幫助防止或減少急性腎損傷帶來的損害。如圖所示(圖7A和7B)，在來源於人類腎的 293細胞中，氯苯甲嗪能夠轉移呼吸產物到糖酵解途徑。當前適應症此外，本發明提供了 S-氯苯甲嗪和其藥學上可接受的載體，例如鹽酸S-氯苯甲嗪，用於其外消旋體(recemate)應用的適應症。這些適應症包括那些列在默克手冊上的疾病，像噁心和與伴隨運動相關疾病的嘔吐(包括慢性和急性運動病)和終端疾病(例如臨終病人)；和眩暈(vertigo)或頭暈造成的某些內耳問題，例如良性(benign)位置性目玄暈，梅尼±矣病(Meniere' s disease)，前庭神經炎(vestibular neuronitis)，內耳迷路炎(labyrinthine)；中耳炎(otitis media)；創傷(trauma)(例如，鼓膜(tympanic membrane)破裂，挫傷迷路(labyrinthine contusion),夕卜淋巴瘻(perilymphatic fistula)，顳骨(temporal)骨折，腦震蕩(postconcussion))；聽神經瘤(acoustic neuroma)；耳毒性給藥，例如耳毒性藥物；耳袋狀皰疹(Herpes zoster oticus)(拉姆齊綜合症(Ramsay Hunt syndrome))；和其他中樞和外周神經炎症。眩暈通常是用來描述各種相關的感覺，包括視線模糊(感覺即將昏厥 (syncope))；頭暈；感覺不平衡或不穩定；或含糊或精神恍惚的感覺。眩暈是一種虛假的自我或環境的運動感。如Tucci所描述的，「頭暈和眩暈」是發生在耳、鼻、咽喉和牙的神經紊亂治療耳朵有問題患者的途徑，默克手冊，2009年1月。在一些實施例中，這些跡象表明S-氯苯甲嗪給藥劑量和外消旋體是相同的。線粒體疾病或先天性線粒體代謝疾病的禁忌
線粒體疾病是指與呼吸鏈功能失常相關的一些異常症狀，這些異常症狀在技術領域很著名；被發現有高的Sglul/gal (值正如本文描述的)的化合物對有線粒體疾病的患者中是有毒的，這一觀點被普遍接受。因此，這些方法可以包括決定一個患者是否有線粒體疾病，而不是對患者用某種藥物(例如不會給患者用氯笨甲嗪)，或者是選擇一種沒有高的 Sglu/gal值的藥物來治療。篩選代謝調節物的方法許多生物可以在糖酵解代謝和氧化代謝之間轉換，這種靈活性已經在酵母中進行了經典的研究，研究表明當發酵的糖源在培養基中耗盡時酵母中經歷了一個二階段的轉換。在某些實施方案中，這裡描述的方法探究代謝的靈活性以發現安全和臨床可用的藥物， 而此次研究用本文描述的方法是以細胞為基礎的研究策略，為的是發現可以選擇性的阻斷細胞的生長和生存化合物，當細胞依賴於氧化磷酸化與糖酵解時。與前面的研究一致，這裡顯示的數據表明當人類的纖維狀細胞以葡糖糖為唯一碳源時，細胞從線粒體中的有氧糖酵解和穀氨醯氧化獲取能量。例如，當哺乳動物細胞被培養的時候，葡萄糖的出現抑制了氧化代謝(如克拉布特裡效應)，在同位素標記的HELA細胞實驗中已經揭示了當用半乳糖來代替葡萄糖時，細胞就會利用穀氨醯胺驅使的呼吸去產生> 98% 的細胞 ATP，見例子，DeBerardinis et al. , Proc Natl Acad Sci U S A 104 19345(2007) ；and Reitzer et al.，JBC 254 J669(1979)。見圖 IA 和 1B。7戈生化的人類成纖維上皮細胞通過改變他們的培養基中的糖源可以在糖酵解和氧化代謝之間轉化，這種轉化可以通過至少兩種細胞生理指標(細胞外的酸化速率和氧氣的消耗速率)觀測到。當葡萄糖為唯一糖源時，細胞從線粒體中的有氧糖酵解和穀氨醯胺氧化獲取能量。但是，當半乳糖為唯一碳源時，有一個幾乎完全的向穀氨醯胺氧化的轉換，作為證明，相比在葡糖糖中生長，糖酵解率會有5-6倍的下降，產生的酸會降低3-4倍，氧氣的消耗有2倍的升高，見圖 1C。附加的數據還描述了在兩種營養的情況下的生物動力學，用抗黴素和寡黴素處理可以用來量化整體和解偶聯的線粒體呼吸水平。使用這些試劑，在半乳糖存在的情況下，幾乎所有的線粒體呼吸是偶聯的，在葡萄糖存在時，只有大約15%的呼吸是沒有偶聯的。只用寡黴素處理顯示，在葡糖存在的情況下只有60 %的呼吸是用來ATP的生產，然而在半乳糖存在的情況下，80%的呼吸是用來生產ATP的，見圖1D。總的來說，這些結果表明，細胞用在半乳糖培養基中氧化磷酸化生產ATP的有效性來彌補糖酵解生產ATP的減少。這裡描述的篩選的途徑可以被用來發現改變細胞能量代謝的小分子。在某些實施方案中，這些物質可以刺激氧化磷酸化的內源抑制劑；在另外一些實施方案中，這些物質減少了 PCYT2(磷酸乙醇胺胞甘酸轉移酶)的活性。就像本文描述的，氯苯甲嗪抑制PCYT2的活性。因此本文描述的是在體外篩選小分子物質的方法用來確認特異性抑制PCYT2的活性的化合物；這些被確認的化合物作為治療這裡描述的疾病和症狀的候選化合物，例如， 缺血性的和退行性疾病。在一些實施方案中，一個待試化合物可以應用於表達功能性PCYT2 的被測樣本中，例如一個細胞，一個存活的組織或器官，或者含有功能性的PCYT2例如純化的或重組的PCYT2的被測樣本，待試化合物對PCYT2活性的影響可以被評估。以培養的或初級細胞為例來來評估被測化合物對PCYT2的抑制能力。在某些實施方案中，這裡的方法也包括一個用已知的結合試驗來篩選直接和PCYT2、例如分離的PCYT2結合的化合物。PCYT2 的基因組序列已經被描述(Gene 21 ；325 145-55 (2004)))，人類 PCYT2mRNA 序列在GenBank Acc. No. NM_002861. 2中找到，蛋白質的全長序列可以在GenBank Acc. No. NP_002852. 1.中找到，可以參考 J. Biol. Chem. 272 (14)，9567-9572 (1997) and Johnson et al. , Biochim Biophys Acta. 1735(3) :230-5(2005) 對PCYT2活性的測定在技術領域已知，包括試驗用wC-磷酸乙醇胺作為底物的結合試驗。商業上可通過 hvitrogen，Millipore, Sigma-Aldrich, R&D Systems, Cell Signaling Technology，和 / 或 Enzo Life Sciences 買到實驗諸如生化試驗。見 Zhu et al. , Gene 447(1) :51-59(2009) ；Tijburg et al. , Methods Enzymol 209:258-63(1992)； and Fullerton et al.，Mol Cell Biol ；2007May ；27 (9) :3327_36。PCYT2 的抗體可以從 Invitrogen, Millipore, Sigma-Aldrich, R&D Systems, Cell Signaling Technology, Abeam, Abnova, Novus Biologicals, Epitomics 購買得至丨J。在某些實施方案中，小分子可以在生長在葡萄糖或半乳糖的細胞中分別篩選。雖然了解一項發明的機制不是很必要，但是我們認為葡萄糖檢測評估糖酵解支持的生長，我們認為半乳糖檢測評估基於線粒體氧化磷酸化活性的細胞生產。在某些實施方案中，本發明設計通過比較葡萄糖細胞生長數據和半乳糖細胞生長數據來評估被篩選的小分子化合物的有效性。在一些實施方案中，此種比較包括一個glu/ gal的比值。在一些實例中，高的glu/gal比值暗示了氧化代謝的選擇性抑制。在一些實例中，低的glu/gal暗示了糖酵解的選擇性抑制。在一些實例中，glu/gal比值可以很好地用來鑑別沒有毒性的針對任一線粒體途徑的抑制劑。在某些實施方案中，本方法包括鑑別選擇性地抑制氧化磷酸化的一系列不同化合物。在某些實施方案中，本方法包括鑑別選擇性地抑制糖酵解的化合物(即在葡萄糖存在的情況下，通過增加細胞的生長來體現，)，或者鑑別可以同時抑制氧化磷酸化和激活糖酵解的一些藥物。在某些實施方案中，鑑別針對細胞的能量代謝的對一系列疾病有廣泛治療效果的臨床上已經應用的藥物(如FDA批准)。一種這樣的小分子(例如氯苯甲嗪)，一種OTC止吐藥，具有很好的血腦屏障通透能力，可以抑制線粒體呼吸。雖然了解此發明的機理不是必須的，但是我們認為氯苯甲嗪可以通過新的代謝機制可以抑制線粒體呼吸，例如抑制PCYT2。另外，氯苯甲嗪在一些疾病包括神經退行性病變，缺血性疾病以及糖尿病疾病的細胞和動物模型中可以抑制疾病的發病機制，顯示了這些和其餘的通過本文描述的方法發現的線粒體呼吸抑制劑的臨床可用性。在某些實施方案中，本文描述的篩選策略可以被用來鑑別小分子化合物，這些小分子化合物可以選擇性地抑制線粒體的氧化磷酸化(0XPH0Q。哺乳動物細胞可以依靠培養基上糖的供應，通過糖酵解或呼吸作用(如氧化磷酸化)來產生ATP。見Rietzer et al., JBC 254 :2669(1979) ；and Rossignol et al. ,Cancer Res 64 :985(2004) 這種靈活性被開發，並且一種小分子的有效篩選方法用來發現對細胞沒有明顯毒性的物質。在某些實施方案中，這種篩選方法可以用於鑑別化合物，這種化合物對細胞是否有毒性與細胞中生產 ATP的途徑有關(氧化磷酸化或糖酵解)，也可以叫做依賴於代謝途徑的毒性。這些發現的化合物中的一些可以誘導細胞代謝途徑的轉換-可以是從需氧的糖酵解到線粒體氧化磷酸化，也可以反過來。
正如本文所用到的，小分子是指低於3000道爾頓的有機或無機分子。總體來說， 這項發明所用到的小分子都是低於3000道爾頓的，這些小分子可以最低從100道爾頓到 3000道爾頓之間(大約IOODa到3000Da，大約IOODa到2500Da，大約IOODa到2000Da，大約 IOODa 到 1750Da，大約 IOODa 到 1500Da，大約 IOODa 到 1250Da，大約 IOODa 到 lOOODa，大約 IOODa 到 750Da，大約 IOODa 到 500Da，大約 200Da 到 1500Da，大約 500Da 到 lOOODa，大約 300Da 到 lOOODa，大約 IOODa 到 250Da。)待測化合物可以是天然產物或組合化學庫中的成員。採用一組多樣分子覆蓋多種功能，例如電荷、芳香性、氫鍵、靈活性、大小、支鏈的長度、疏水性和硬度等方面的多樣性。適用於製備小分子化合物的合成技術為技術領域內所知，就像Obrecht和 Villalgordo 所舉例的 Solid-Supported Combinatorial and Parallel Synthesis of Smal1—Molecular—Weight Compound Libraries，Pergamon-Elsevier Science Limited (1998)，包括「分裂和組合」或「平行」的合成技術，固相和液相技術，編碼技術(參 # Czarnik,Currο Opin0 Chem0 Bio。1:60-6(1997))。除此以外，許多小分子的文庫都可以在市場上買到。許多合適的小分子檢測化合物在美國專利號6，503，713中列出，並全面地以引用的形式合併到文中。用本發明進行篩選的庫可以包括許多不同類型的待測化合物。一個庫可以包含一系列結構相關或不相關的待測化合物。在某些實施方案中，待測化合物是肽或肽類分子，在某些實施方案中，待測化合物是核酸。 在某些實施方案中，待測化合物和化合物庫可以通過系統地改變第一個待測化合物的結構而得到，例如，第一個待測化合物結構和目標多肽的已知的天然結合配體的結構相似，或者是第一個小分子具備結合目標多肽的能力，可以使用技術領域已知的或本文描述的技術，也可以將結構和其導致的生物活性聯繫起來，叫做結構活性相關研究。作為技術領域熟知的一項評估技術，有許多標準的方法可以建立這種結構和活性關係研究。因此，在一些情況下，這項工作需要多大量的實驗，其他內源性多肽的三維結構或其中一部分可以作為一個或一些小分子化合物合理設計的起點，例如，在某些實施方案中，用本文描述的方法，篩選一小分子庫。在某些實施方案中，待測化合物被應用於檢測樣本，例如細胞或活組織，並且評估該待測化合物的一個或多個作用。例如在培養或原細胞中，評估待測化合物對調節線粒體呼吸作用的能力。在某些實施方案中，被測樣本是或來自於這裡描述的疾病的整體模型，例如一種動物模型，嚙齒類動物的大鼠或小鼠都可以使用。評估這些效果的方法為本技術領域所知，例如，評估調節蛋白質表達的能力可以在基因或蛋白質水平上，例如使用定量PCR或免疫分析法。在某些實施方案中，高效率的方法，例如蛋白質或基因晶片等在技術領域已知，可以用來檢測對線粒體代謝的影響。(可參考文獻 Ch0 12，Genomics，in Griffiths et al。，Eds。Modern Genetic Analysis，1999，W。 H。Freeman and Company ；Ekins and Chu，Trends in Biotechnology，1999，17 :217-218 ; MacBeath and Schreiber, Science 2000,289 (5485) 1760-1763 ；Simpson，Proteins and Proteomics :A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press ；2002 ； Hardiman, Microarrays Methods and Applications :Nuts & Bolts，DNA Press,2003)
本文所述的已經被篩選和鑑別的調節線粒體呼吸的待測化合物可以作為候選化合物，候選化合物已經在疾病的體內模型中進行篩選，這些疾病與改變的線粒體呼吸和功能有關，如果這些化合物對疾病的一個或多個症狀有理想的效果，那麼這個候選化合物就可以作為候選的治療劑。候選治療劑如果在臨床上進行的篩選，就可以作為治療藥物。候選化合物，候選治療藥物和治療藥物可以被選擇性的利用和衍生化，並且可以用生理學上可接受的輔料來形成藥物組合物。在第一次篩選中選出的(調節線粒體呼吸化合物)的待測化合物可以被選擇性或系統性的改變，例如，使用合理的設計去最大可能的利用結合的親和力，特異性或其他參數。這種利用也可以用這裡本文描述的方法來篩選。因此，在一些實例中，發明包括用技術領域內已知的方法或本文描述的方法來篩選第一個庫，找出庫中一個或多個「匹配」，對這些「匹配」進行系統的結構選擇來形成化合物的第二個庫，第二個庫中的化合物與「匹配」結構上有關，使用本文描述的方法再篩選第二個庫。被稱為匹配的化合物被認為是候選治療藥物，對治療與改變的線粒體呼吸和功能有關的疾病有效。許多技術對測定匹配的結構很有效，這些有效的技術能夠使用到本文描述的方法中，例如NMR，質譜，配備電子獲氣檢測器的氣相色譜分析，螢光和吸收光譜。因此， 本發明也包括用這裡描述的方法所發現的作為匹配的化合物，還有一些用來管理治療，預防，延遲發展和疾病惡化等的方法。被認定為候選治療藥物的被測化合物能夠進一步的通過疾病動物模型來篩選，這些疾病與這本文描述的改變了的線粒體呼吸和功能有關。可以檢測有疾病的動物的變化， 例如疾病參數的提高等，這些參數與臨床結果有關。呼吸代謝的調節物本文所描述的組合物和方法包括線粒體代謝的調節劑，在某些實施方案中，這些調節劑是氧化磷酸化的抑制物，在某些實施方案中，這些化合物是糖酵解的抑制物。在某些實施方案中，化合物是一種氯苯甲嗪，或它的一種對映體或一種類似物，或其藥學上可接受的鹽，例如鹽酸氯苯甲嗪，或鹽酸S-氯苯甲嗪。在某些實施方案中，化合物是用本文描述的方法發現的氧化磷酸化的另一種抑制劑，例如表1中列出的一些藥物。在某些實施方案中， 化合物是一種組胺拮抗劑，一種二苯哌嗪，二苯烷(烷氧基)為基礎的，或是一種三環環狀結構。正如本文描述的，用本發明的方法篩選一個包含3695化合物的庫，其中包括兩種市場上銷售的化合物集合，這些集合包括將近一半的FDA批准的藥物和其餘許多的有生物活性和天然的化合物。這個庫被盲法篩選旨在發現哪一結構類型或化學類型可以作為有效細胞保護劑，即抵制線粒體氧化磷酸化。在初步的篩選中，Sgwgal值(這個比值是在葡糖糖中歸一化的細胞數目對在半乳糖中歸一化的細胞數目的倍數變化的log值)被用作按將細胞代謝依賴性從氧化磷酸化調整到糖酵解的能力區分化合物。在半乳糖中選擇性致死或抑制生長的化合物將有一個高的 Sglu7gal值，很可能包括氧化磷酸化的抑制劑。大約90%的化合物在用藥後對在葡糖糖中生長的細胞的存活力和繁值沒有顯著影響(FcGlu的平均值彡0. 8)。大約有124種化合物表現出高的Sgwgal值(大於等於0. 8)， 可能選擇性抑制在半乳糖中生長的細胞的緣故。這些化合物包括25個被FDA批准的藥物(見表1)。例如篩選的臨床上使用被鑑定出可以選擇性的幹擾細胞在半乳糖中的生長而被認為是氧化磷酸化抑制劑的藥物包括毒灰葉酚，苄索氯銨，抗黴素Α，β 二氫化魚藤酮，β 毒灰葉酚，，19-羧酸桃柘酮，甲基苄索氯銨，異魚藤酮，魚藤素，mimdoserone，鹽酸小檗鹼， 明杜隆，壬苯聚醇-9，阿立西定二氫氯化物，地喹氯銨二氯化物，氯非銨甲苯磺酸鹽，通佐溴銨，茶痂衣酸，硝呋齊特，甲醚魚藤酮酸，魚藤酮酸，恩波維銨，鹽酸罌粟鹼，副品紅噻嘧啶， 鹽酸乙基罌粟鹼，甲萘醌，雷酚內酯，diffratic acid, isogedunin,鹽酸苯乙雙胍，蘇木桐A 三甲基乙醚，噴他脒羥乙基磺酸鈉，尼洛替星，長春西汀，克羅米芬，白血寧，甲氟奎，硫鏈絲菌肽，鹽酸萘替芳，鹽酸氯普硫蒽，氯馬斯汀富馬酸，絲他康唑，氯化巴馬亭，氟苯尼考，哌迷清，地喹氯銨氯化物，脫氧蘇木桐B三甲基乙醚，比沙可啶，汞溴紅，甲氧檗因，青蒿素，二氫化魚藤酮，3-deshydroxysappanol trimethyl ether，鹽酸多佐胺，魚藤酮，洗必太，氯福克酚，氯化巴馬亭，鹽酸氯笨甲嗪，鈉鹽氟伐他汀，抗壞血酸。對以上列出的批准藥物中的16 種進行了更精細的研究，這16種藥物在先前的報導中沒有提到其活性對能量代謝的影響。通過對整個庫的結構檢查和結構活性分析表明通式A代表了一類結構，這類結構的化合物與葡萄糖相比可以選擇性地抑制細胞在半乳糖中生長。
權利要求
1.氯苯甲嗪或其S-對映體在治療或預防與伴隨缺血性損傷或細胞退化性疾病的細胞死亡相關的病症中的用途。
2.氯苯甲嗪或其S-對映體在治療或預防II型糖尿病中的用途。
3.如權利要求1或2所述的用途，其中氯苯甲嗪為S-氯苯甲嗪。
4.如權利要求1-3中任一所述的用途，其中所述S-氯苯甲嗪大體上不含氯苯甲嗪的 R-對映體。
5.如權利要求1或2所述的用途，其中所述細胞退化性疾病為神經退行性疾病。
6.如權利要求5所述的用途，其中所述神經退行性疾病為帕金森氏病、阿爾茨海默病、 肌萎縮性脊髓側索硬化、弗裡德賴希氏共濟失調、或亨廷頓氏舞蹈病。
7.如權利要求1或2所述的用途，其中所述疾病為缺血再灌注損傷。
8.如權利要求7所述的用途，其中所述缺血再灌注損傷為心肌缺血性損傷、腎臟缺血性損傷、或中風。
9.如權利要求1-8中任一所述的用途，其中所述氯苯甲嗪的給藥劑量足夠產生IOOnM 到1 μ M的血清水平。
10.如權利要求1-8中任一所述的用途，其中所述氯苯甲嗪配製成適合注射的劑型。
11.如權利要求1-8中任一所述的用途，其中所述氯苯甲嗪給藥劑量為每天大約25mg 或更多。
12.氯苯甲嗪或其S-氯苯甲嗪在治療寄生蟲感染中的用途。
13.如權利要求12所述的用途，其中所述S-氯苯甲嗪大體上不含氯苯甲嗪的R-對映體。
14.如權利要求12所述的用途，其中所述寄生蟲選自下列組群布氏錐蟲 (Trypanosoma brucei)，克氏維蟲(Trypanosoma Cruzi)，禾口惡性皰原蟲(Plasmodium falciparum)。
15.一種篩選能夠治療或預防與伴隨缺血性損傷或細胞退化性疾病的細胞死亡相關的病症的化合物的方法，包括提供一個包含具有酶活性的CTP 磷酸乙醇胺胞苷醯轉移酶2(PCYT2)的樣品；將所述樣品與一待測化合物接觸；確定在樣品中存在和不存在待測化合物時PCYT2的活性；其中能夠降低樣品中PCYT2活性的待測化合物選為治療所述病症的待選化合物。
16.如權利要求15所述的方法，其中所述樣品為活細胞，所述方法進一步包括測定存在和不存在待測化合物時細胞內磷酸乙醇胺(PEA)水平，其中能夠提高細胞內PEA水平的待測化合物選為治療所述病症的待選化合物。
全文摘要
系統模型表明將一個細胞對氧化磷酸化(OXPHOS)的依賴轉向糖酵解可以防止細胞死亡。但是利用這一策略的治療潛力因為缺乏可以調整能量代謝的臨床上安全可靠的藥物而受到限制。本發明發現了能夠調節氧化代謝的無毒小分子化合物(例如可以製藥的化合物)，其中之一是氯苯甲嗪。正如這裡所述，氯苯甲嗪及其對映體S-氯苯甲嗪將OXPHOS轉向糖酵解。這樣的化合物可以對退行性疾病諸如糖尿病、亨廷頓氏舞蹈病、帕金森氏病和阿爾茨海默病(老年痴呆症)以及缺血性疾病包括但不限於中風、心力衰竭或灌注損傷可以起到保護或治療作用。
文檔編號A61K31/5415GK102573847SQ201080032121
公開日2012年7月11日 申請日期2010年5月14日 優先權日2009年5月14日
發明者S·謝斯, V·K·穆薩, V·戈希爾, 季玉華 申請人:總醫院公司