田薊苷的製備方法
2023-08-06 23:01:06
專利名稱：田薊苷的製備方法
技術領域：
本發明屬於中藥提取物製備和應用領域，具體涉及一種田薊苷的製備方法及其應用。
背景技術：
香青蘭為唇形科植物香青蘭(Dracoc印halum Moldevica L.)的乾燥地上部分， 夏季盛花期採割，除去雜質，曬乾。花多萎縮，藍紫色。氣清香，葉微辛。香青蘭含有大量 的黃酮類化合物，如田薊苷(Tilianin)、藿香苷(Agastachoside)、木犀草素-7-0-葡萄 糖苷(Luteolin-7-0-glucoside)、木犀草素(Luteolin)、山奈酚(Kaempferol)、異鼠李素 (Isorhamnetin)等。文獻報導，其中，黃酮苷類化合物田薊苷含量較高。
田薊苷(tilianin)有顯著擴張冠狀動脈的作用，可用於製備治療心血管疾病，特 別是抗心肌缺血的藥物。雖然黃酮苷類化合物中田薊苷含量較高，但目前還沒有得到很好 的分離和提純，也無市售的田薊苷純品。 綜上，需要提供一種田薊苷的製備方法，增加其純度。
發明內容
為解決上述至少一個技術問題，本發明提供了一種製備高純度田薊苷的方法，同 時提高了從香青蘭中提取田薊苷的得率。 為實現上述發明目的，本發明提供的田薊苷的製備方法，包括以下步驟(a)將香 青蘭地上部分，用10 40重量倍數的20 60vol %的醇溶液提取，得到提取液；(b)濃縮、 乾燥所述提取液，得到浸膏粉；(c)使用有機溶劑萃取所述浸膏粉，得到萃取液；(d)濃縮所 述萃取液後，進行矽膠柱層析，流動相採用複合洗脫劑，所述複合洗脫劑由A組分和B組分 構成，所述A組分選自下述組中的至少一種甲醇、乙醇、丙酮、異丙酮或丁醇，所述B組分選 自下述組中的至少一種氯仿、乙酸乙酯、二氯甲烷或二氯乙烷，所述A組分與B組分的體積 比為90 : 10 10 : 90，進行梯度洗脫得到洗脫液；以及(e)合併相同組分洗脫液，濃縮， 得到所述田薊苷。 本發明所提供的方法操作簡便，提取效率高，所得田薊苷的純度不低於98%，可用 於製備治療心血管疾病的藥物，如治療冠心病、心肌梗死、心肌缺血等症，特別是對缺血心 肌的保護，藥效明顯，質量可控性強。 根據本發明所提供的方法，步驟a所述醇溶液選自下述組中的至少一種甲醇、乙 醇或丙醇，提取時間為1 7h。 黃酮類化合物在花、葉、果等組織中，一般多以苷的形式存在，而在木部堅硬組織 中，則多以游離苷元形式存在。黃酮苷類以及極性稍大的苷元(如羥基黃酮、雙黃酮、橙酮、 查耳酮等)，一般可用丙酮、醋酸乙酯、乙醇、水或某些極性較大的混合溶劑進行提取。經反 復實驗發現，本發明所述田薊苷難溶或不溶於水，易溶於甲醇、乙醇、乙酸乙酯，在對香青蘭 進行提取時，可以用20 60vol^的醇溶液進行提取，其中，以乙醇溶液的提取效果較好。
3
根據本發明，步驟b所述濃縮為減壓濃縮，所述乾燥為真空乾燥，在此條件下濃縮
和乾燥的效果均可在不破壞田薊苷有效成分的前提下達到最佳。
根據本發明的實施方式之一，步驟C所述有機溶劑選自下述組中的至少一種乙 酸乙酯、甲苯、四氯化碳、乙醚、氯仿、溴苯或二氯甲烷，萃取次數為2 6次。
利用黃酮類化合物與混入的雜質極性不同，選用不同溶劑進行萃取可達到精製純 化目的。研究人員發現，在製備田薊苷的過程中，上述有機溶劑均能達到分離田薊苷的效
果，其中，選用乙酸乙酯進行萃取效果較好，在除去雜質的同時，還起到了分離苷和苷元、極 性苷元與非極性苷元的效果，從而使得田薊苷分離效果較好。 根據本發明所提供的方法，步驟d中採用的矽膠為100 200目的層析用矽膠H。 根據本發明實施方式之一，濃縮後的所述萃取液與所述層析用矽膠H的重量比為1 : 30 70。 矽膠H不含粘合劑，根據實驗結果用于田薊苷的分離效果最好，分離度較高。
矽膠柱層析流動相，依據所分離的提取物極性不同，可選用乙酸乙酯-丙酮、環己 烷_丙酮、乙酸乙酯_石油醚、甲醇_氯仿、正丁醇_醋酸、四氯化碳_乙腈等，經研究發現， 田薊苷的分離中，採用乙酸乙酯_丙酮、氯仿_甲醇作為流動相分離效果較好。
根據本發明的實施方式之一，當步驟d中所述複合洗脫劑中A組分為甲醇且B組
分為氯仿時，氯仿和甲醇的體積比依次為95 : 5、9 : 1、8 : 2。此時能提高香青蘭中田薊
苷組分的分離能力，得率高，同時縮短分析周期。 當流動相被設置為上述比例時，田薊苷的組分主要在流動相氯仿_甲醇體積比為 9 : l時被洗脫。因此，根據本發明實施方式之一，步驟e中所述相同組分洗脫液為氯仿和
甲醇的溶劑體積比在9 : i時流出的洗脫液。此時的洗脫液中，田薊苷有效成分最集中，因
而合併這部分洗脫液，其分離效果最好，收率最高。 根據本發明所提供的方法，所述步驟e進一步包括用醇溶液對田薊苷進行重結晶 的步驟。根據本發明的實施方式之一，重結晶步驟中使用的所述醇溶液為40 60vol^甲 醇-水溶液。 在提取分離田薊苷過程中，為了進一步純化所得田薊苷，濾去雜質，可對田薊苷進 行重結晶。所用試劑可以包括甲醇、乙醇、異丙醇、氯仿、乙酸乙酯等。根據實驗結果，以 50vol %甲醇_水溶液進行重結晶效果較好，所得產品純度高。 本發明通過上述製備方法，首次從少數民族藥物香青蘭中得到了高純度的田薊 苷，與現階段對田薊苷組分分離鑑定的提取工藝相比，提取純度明顯提高，可高達98%以 上。同時，本發明所採用的流動相濃度梯度配比縮短了分析周期，增加了分離靈敏度，從而 提高了各組分的分離能力，使得田薊苷的得率提高。
下面將結合附圖和具體實施方式
對本發明的上述和其他目的、特徵和優點作出進 一步詳細的說明。
圖1為本發明提供方法的工藝流程圖； 圖2為根據本發明一個實施例所製備的田薊苷的紫外光譜(UV)圖；
圖3為根據本發明一個實施例所製備的田薊苷的紅外光譜(IR)4
圖4為根據本發明一個實施例所製備的田薊苷的電噴霧質譜(ESI-MS)圖；
圖5為根據本發明一個實施例所製備的田薊苷的核磁共振氫譜CH-NMR)圖；
圖6為根據本發明一個實施例所製備的田薊苷的核磁共振碳譜(13C_NMR)圖。
具體實施例方式
本發明提供的一種田薊苷的製備方法，包括獲得香青蘭的提取物，以及對提取物
進一步萃取、層析、結晶等步驟。下面結合附圖，詳述本發明所提供的方法。 如圖1所示，首先，將1份重量的香青蘭乾燥的地上部分粉碎，用10 40重量倍
數的20 60vol^的醇溶液提取，例如可以選用乙醇或甲醇或丙醇或它們的任意混合物回
流提取1 5次，每次提取1 7h。然後，將提取液濃縮，例如可以採用減壓濃縮的方法，濃
縮後提取液呈膏狀。之後再將膏狀物乾燥，例如可以採用真空乾燥的方法，將膏狀物製成浸膏粉。 將浸膏粉用有機溶劑萃取，得到萃取液。萃取用的有機溶劑包括，但不限於乙酸乙 酯、甲苯、四氯化碳、乙醚、氯仿、溴苯或二氯甲烷，以及它們的任意組合。優選乙酸乙酯，萃 取的次數一般為2 6次。 將萃取液濃縮後，進行矽膠柱層析。層析的步驟可以為將濃縮後的萃取液中拌 入矽膠，例如可以採用100 200目的層析用矽膠H，拌入的比例為濃縮後的萃取液與層析 用矽膠H的重量比為1 : 30 70。上柱完畢後，按梯度比例通入流動相進行洗脫。流動 相採用複合洗脫劑，該複合洗脫劑由A組分和B組分構成，A組分可選自下述組中的至少一 種甲醇、乙醇、丙酮、異丙酮或丁醇，B組分可選自下述組中的至少一種氯仿、乙酸乙酯、 二氯甲烷或二氯乙烷，A組分與B組分的體積比為90 : 10 10 : 90。例如流動相可以採 用氯仿-甲醇或乙酸乙酯-丙酮，優選氯仿-甲醇。當流動相採用氯仿-甲醇時，氯仿和甲
醇的梯度洗脫的溶劑體積比依次為95 : 5、9 : 1、8 : 2，此時田薊苷的組分主要在流動相 氯仿-甲醇體積比為9 : i時被洗脫。最後，合併相同組分洗脫液並濃縮，得到田薊苷提取物。 進一步地，為了提高田薊苷的收率，還可利用醇溶液，例如40 60vol^、特別是 50vol %的甲醇-水溶液，再對上述田薊苷提取物進行重結晶，即得到淡黃色粉末狀結晶， 為田薊苷成品，其純度可達98%以上。經UV、 IR、 MS H-NMR、"C-NMR對所得組分的結構進 行鑑定，可知其為田薊苷。 圖2、圖3為根據本發明的製備方法製備的田薊苷的UV圖譜和IR圖譜。
圖4為根據本發明的製備方法製備的田薊苷的ESI-MS圖譜，根據田薊苷的 ESI-MS的分析可知，ESI-MS特徵峰在m/z 447 [M+](正離子)，m/z 481 [M+CL—](負離子)， m/z 285. 33[M+H-glc]， m/z 233. 84[M+_CH3]。再結合圖5、圖6所示的根據本發明的制 備方法製備的田薊苷的NMR圖譜分析，可確定其分子量為446，分子式為GAA。，其中， 力-NMR(400MHz， DMSO)圖譜中表現出典型的黃酮苷類化合物的氫譜特徵，通過耦合常數及 化學位移可確定每個氫的歸屬,C-NMR(DMS0，400MHz)圖譜中呈現出22個碳信號，為1個 CH3，12個CH，8個季碳。Sc表明分子中含一個羰基(Sl82.9)。以上數據與文獻報導數據 基本一致，因此，可確定所得化合物為田薊苷。 下面通過具體實施例對本發明作進一步詳述，以下實施例只是描述性的，不是限
5定性的，不能以此限定本發明的保護範圍。
實施例1 首先，取2kg香青蘭乾燥的地上部分粉碎，用20重量倍數的40% vol的乙醇回流 提取1次，提取時間為3h。然後，將提取液減壓濃縮成膏狀，再真空乾燥成浸膏粉，用醋酸乙 酯萃取3次。隨後，將萃取液濃縮拌矽膠，所用提取物樣品與層析用100目的矽膠H按重量
比i : 50上樣，進行柱層析，流動相採用氯仿-甲醇，以濃度梯度配比95 : 5-9 :i-8:2 進行梯度洗脫，其中，田薊苷組分在9 : i濃度範圍內流出。最後，合併相同組分並濃縮，析
出田薊苷，再用50vol%甲醇-水溶液重結晶，得到淡黃色粉末狀結晶。 (1)結構鑑定取所得樣品分別進行UV、 IR、 MS、 NMR分析鑑定，確定實施例1所提
純的樣品為田薊苷。 (2)純度鑑定 熔點(mp)測定255°C 257°C。 薄層色譜檢測採用三種展開體系進行檢測，薄層板用矽膠HF254板。展開劑A為 氯仿-甲醇(體積比為8.5 : 1.5)，RfA為0.42;展開劑B為甲苯-乙酸乙酯-甲酸(體積
比為5 : 4 : D，RfB為o.45 ;展開劑c為甲苯-甲酸乙酯-甲酸(體積比為5 : 4 : i)，
RfB為0. 45 ;紫外254nm下見棕黑色斑點，無雜質點。HPLC檢測用HPLC歸一化法測定含量，選定324nm和350nm為檢測波長。選用
甲醇-O. 4%磷酸水溶液(48 : 52，V/V)和甲醇-O. 5%甲酸水溶液(27 : 73， V/V)兩種溶
劑系統做歸一化含量測定，以兩種測定方法結果的平均值作為含量測定結果。將實施例1
製備的田薊苷結晶用甲醇溶解，經分析型高效液相色譜檢測，採用歸一化法定量，其純度為
99%。
洗脫液中田薊苷濃度X洗脫液體積
得率計算田薊苷得率(％)=-xioo
香青蘭中田薊苷的量 經檢測，實施例1提取得到的田薊苷純度為99%，得率為78. 2% 。
實施例2 首先，取lkg香青蘭乾燥的地上部分粉碎，用10重量倍數的50% vol的乙醇回流 提取4次，提取時間為3h。然後，將提取液減壓濃縮成膏狀，再真空乾燥成浸膏粉，用醋酸乙 酯萃取3次。隨後，將萃取液濃縮拌矽膠，所用提取物樣品與層析用120目矽膠H按重量比
i : 40上樣，進行柱層析，流動相採用氯仿-甲醇，以濃度梯度配比i7 : l-8 : l-3 : i進 行梯度洗脫，其中，田薊苷組分在8 : i濃度範圍內流出。最後，合併相同組分並濃縮，析出
田薊苷，再用50vol^甲醇-水溶液重結晶，得到淡黃色粉末狀結晶。 按照實施例1中方法對所得組分進行結構鑑定和純度分析，可確定實施例2所提 純的樣品為田薊苷，其純度為98 % ，得率為75. 0 % 。
實施例3 首先，取3kg香青蘭乾燥的地上部分粉碎，用40重量倍數的60% vol的乙醇 回流提取5次，提取時間為2h。然後，將提取液減壓濃縮成膏狀，再真空乾燥成浸膏粉， 用醋酸乙酯萃取4次。隨後，將萃取液濃縮拌矽膠，所用提取物樣品與層析用150目矽
6膠H按重量比1 : 60上樣，進行柱層析，流動相採用乙酸乙酯-丙酮，以濃度梯度配比
16 : i-io : 1-4 : i進行梯度洗脫，其中，田薊苷組分在io : i濃度範圍內流出。最後，合併相同組分並濃縮，析出田薊苷，再用50vol %甲醇-水溶液重結晶，得到淡黃色粉末狀結晶。 按照實施例1中方法對所得組分進行結構鑑定和純度分析，可確定實施例3所提純的樣品為田薊苷，其純度為98%，得率為75. 5% 。
實施例4 首先，取2kg香青蘭乾燥的地上部分粉碎，用60重量倍數的20 % vol的乙醇提取1次，提取時間為7h。然後，將提取液減壓濃縮成膏狀，再真空乾燥成浸膏粉，用醋酸乙酯萃取6次。隨後，將萃取液濃縮拌矽膠，所用提取物樣品與層析用200目矽膠H按重量比1 : 40
上樣，進行柱層析，流動相採用乙酸乙酯-丙酮，以濃度梯度配比15 : l-8 : l-3 : i進行梯度洗脫，其中，田薊苷組分在8 : i濃度範圍內流出。最後，合併相同組分並濃縮，析出田
薊苷，再用50vol %的甲醇-水溶液重結晶，得到淡黃色粉末狀結晶。 按照實施例1中方法對所得組分進行結構鑑定和純度分析，可確定實施例4所提純的樣品為田薊苷，其純度為99%，得率為76. 3% 。 儘管已經示出和描述了本發明的實施例，對於本領域的普通技術人員而言，可以理解在不脫離本發明的原理和精神的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發明的範圍由所附權利要求及其等同物限定。
權利要求
一種田薊苷的製備方法，具體包括以下步驟(a)將香青蘭地上部分，用10～40重量倍數的20～60vol％的醇溶液提取，得到提取液；(b)濃縮、乾燥所述提取液，得到浸膏粉；(c)使用有機溶劑萃取所述浸膏粉，得到萃取液；(d)濃縮所述萃取液後，進行矽膠柱層析，流動相採用複合洗脫劑，所述複合洗脫劑由A組分和B組分構成，所述A組分選自下述組中的至少一種甲醇、乙醇、丙酮、異丙酮或丁醇，所述B組分選自下述組中的至少一種氯仿、乙酸乙酯、二氯甲烷或二氯乙烷，所述A組分與B組分的體積比為90∶10～10∶90，進行梯度洗脫得到洗脫液；以及(e)合併相同組分洗脫液，濃縮，得到所述田薊苷。
2. 如權利要求1所述的方法，其中，步驟a所述醇溶液選自下述組中的至少一種甲 醇、乙醇或丙醇，提取時間為1 7h。
3. 如權利要求1所述的方法，其中，步驟b所述濃縮為減壓濃縮，所述乾燥為真空乾燥。
4. 如權利要求l所述的方法，其中，步驟c所述有機溶劑選自下述組中的至少一種乙 酸乙酯、甲苯、四氯化碳、乙醚、氯仿、溴苯或二氯甲烷，萃取次數為2 6次。
5. 如權利要求l所述的方法，其中，步驟d中採用的矽膠為100 200目的層析用矽膠H。
6. 如權利要求5所述的方法，其中，濃縮後的所述萃取液與所述層析用矽膠H的重量比 為1 : 30 70。
7. 如權利要求1所述的方法，其中，當步驟d中所述複合洗脫劑中A組分為甲醇且B組分為氯仿時，氯仿和甲醇的體積比依次為95 : 5、9 : 1、8 : 2。
8. 如權利要求7所述的方法，其中，步驟e中所述相同組分洗脫液為氯仿和甲醇的溶劑體積比在9:i時流出的洗脫液。
9. 如權利要求l所述的方法，其中，步驟e進一步包括用醇溶液對田薊苷進行重結晶的 步驟。
10. 如權利要求9所述的方法，其中，所述醇溶液為40 60vol%甲醇-水溶液。
全文摘要
本發明涉及一種田薊苷的製備方法，具體包括以下步驟將香青蘭地上部分，用10～40重量倍數的20～60vol％的醇溶液提取，得到提取液；濃縮、乾燥所述提取液，得到浸膏粉；使用有機溶劑萃取所述浸膏粉，得到萃取液；濃縮所述萃取液後，進行矽膠柱層析，流動相採用複合洗脫劑，所述複合洗脫劑由A組分和B組分構成，所述A組分選自下述組中的至少一種甲醇、乙醇、丙酮、異丙酮或丁醇，所述B組分選自下述組中的至少一種氯仿、乙酸乙酯、二氯甲烷或二氯乙烷，所述A組分與B組分的體積比為90∶10～10∶90，進行梯度洗脫得到洗脫液；以及合併相同組分洗脫液，濃縮，得到所述田薊苷。根據本發明所提供的方法製備的田薊苷純度高，同時田薊苷的得率也較高。
文檔編號C07H1/08GK101781345SQ20101011237
公開日2010年7月21日 申請日期2010年2月10日 優先權日2010年2月10日
發明者王新春, 王魯妹, 袁勇, 邢建國 申請人:石河子大學醫學院第一附屬醫院