一種組織工程人角膜內皮的重建方法
2023-07-08 03:11:06
專利名稱：一種組織工程人角膜內皮的重建方法
技術領域：
本發明涉及一種利用人角膜內皮細胞和脫上皮層羊膜重建組織工程人 角膜內皮的方法。
背景技術：
高等動物的角膜內皮在維持角膜透明、角膜厚度以及為角膜提供營養 等方面具有不可替代的作用。角膜受到感染或手術等創傷後，將引起角膜 內皮細胞發生不同程度的減少， 一旦角膜內皮細胞密度低於維持角膜內皮 生理功能的臨界密度，角膜內皮將出現不可逆之病變，形成角膜內皮盲。
目前，我國約有角膜內皮盲患者80萬人，儘管他們可以通過角膜移植來治 愈，但由於捐獻角膜的高度匱乏致使絕大多數患者因得不到移植角膜而無 法重見光明。近年來，角膜組織工程的興起為組織工程角膜內皮的體外重 建及其應用於角膜內皮盲的臨床治療帶來了新的希望，但如何利用角膜內 皮細胞和適宜的載體支架在體外重建出組織工程人角膜內皮已經成為研究 熱點。
利用對人角膜內皮的體外重建研究開始於1992年。此後，May Griffith 等(1999)利用癌基因轉染的永生化人角膜上皮細胞、基質細胞、內皮細 胞與醛交聯膠原蛋白在體外成功重建出形態、透明度和組織結構與正常角 膜大體相近的功能性人角膜組織類似物，為人角膜組織的體外重建開闢了 道路，但由於所用角膜細胞均為轉染了癌基因、具有潛在致瘤性的永生化 細胞，從而限制了其在人角膜內皮重建和臨床中的應用。2004年，日本學 者Yutaka Ishino等和Tatsuya Mimura等利用體外培養至第4-5代的人角膜 內皮細胞分別與去上皮層羊膜和膠原膜片分別重建出與正常功能接近的人 角膜內皮細胞薄片。2007年，Jui-Yang Lai等將取自眼庫成人角膜的人角 膜內皮細胞原代培養在修飾後的N-(l-甲基乙基)-2-丙烯醯胺均聚物載體支 架上獲得了近似於正常功能的人角膜內皮細胞薄片。2008年，日本東京大 學醫學院Kouichiro Hitani等又利用薄膜培養法獲得了近似於正常功能的 人角膜內皮細胞薄片。這些研究結果為利用非轉染人角膜內皮細胞重建人 組織工程角膜內皮開闢了道路，但由於所用種子細胞均為來源於眼庫角膜 或在24孔培養板中原代培養或僅傳4-5代的人角膜內皮細胞，故細胞數量 非常有限，所能重建出的組織工程人角膜內皮的數量極少，即使成功後能 用於臨床角膜移植的數量也極其有限，故仍只限於實驗研究，更無法滿足 我國約80萬、全世界1000餘萬角膜內皮盲患者臨床治療的大量需要。2005年，樊廷俊等在國際上首次成功建立了沒有任何致瘤性的非轉染 人角膜內皮細胞系，成功解決了人組織工程角膜內皮規模化重建所需大量 種子細胞的來源問題。因此，儘早建立理想載體支架的製備技術，進而建 立一種利用非轉染人角膜內皮細胞和理想載體支架重建組織工程角膜內皮 的方法，已成為全世界眼科專家們的主攻目標，也是組織工程角膜內皮臨 床應用以及造福全世界角膜盲患者的關鍵之所在。
發明內容
本發明的目的就是利用人角膜內皮細胞和脫上皮層羊膜載體支架，提 供一種組織工程人角膜內皮的重建方法。
本發明的方法；取人角膜內皮細胞，用含20%小牛血清的DMEM/F12 培養液在底面積25平方釐米培養瓶中置37"C擴增培養至對數生長期，用 0.25%胰蛋白酶溶液消化和滴管吹打法懸浮細胞，離心收集細胞沉澱，用5 毫升組織工程人角膜內皮重建專用培養液懸浮所得細胞沉澱製成人角膜內 皮細胞懸液，經血球計數板計數後，用上述專用培養液調整細胞濃度至 4.2xl6 4.2xl07個細胞/毫升。
然後，利用0.25%胰蛋白酶溶液對凍幹羊膜的上皮面進行倒置消化， 以得到完全脫去上皮層的羊膜，用D-hanks溶液漂洗2次後，用打孔器將 脫上皮層羊膜打成與培養板孔直徑相同的羊膜圓片，使其上皮面朝上平鋪 於48孔培養板孔的底部，放置於5% C02培養箱中在37"C條件下牢固幹貼 後製成羊膜載體支架備用。
最後，在貼有脫上皮層羊膜載體支架的培養板孔中，輕輕加入上述準 備好的人角膜內皮細胞懸液0.1~0.2毫升，使細胞懸液均勻分散於培養孔 中，置5% C02培養箱中37 'C培養20~24小時待細胞完全貼附到羊膜載體 支架上後，補加上述專用培養液使其液面達到培養孔高度的3/4，待人角 膜內皮細胞在羊膜載體支架上長成單層後即為重建的組織工程人角膜內 皮。
本發明所用組織工程人角膜內皮重建專用培養液的配方為 DMEM/F12培養液，20%小牛血清，0.05% 0.1% IV型膠原蛋白；
為了提高人角膜內皮細胞在脫上皮層羊膜載體支架上的貼附效果，本 發明又添加了 0.05%~0.1%纖連蛋白。
本發明的方法所重建出的組織工程人角膜內皮在形態結構和透明度上 與正常角膜內皮相似並具有正常角膜內皮的功能，本發明所重建的組織工 程人角膜內皮移植到撕除角膜內皮和後彈力層的紐西蘭兔眼中可使兔眼角 膜透明長達39天以上。本發明的主要特點是利用無致瘤性、非轉染的人 角膜內皮細胞，能通過連續傳代為組織工程人角膜內皮的批量重建提供出大量的種子細胞；利用商品化凍幹羊膜所製備的脫上皮層羊膜，從而滿足 組織工程人角膜內皮批量重建所需要的大量載體支架材料；而且可直接應 用於批量生產和臨床角膜移植；且其生產和臨床治療的成本低。
具體實施例方式
1、 組織工程人角膜內皮重建專用培養液的配製取常規配製的 DMEM/F12培養液70毫升，加入IV型膠原蛋白40 80毫克，完全溶解後 用0.22微米的微孔濾膜過濾除菌，加入20毫升小牛血清，補加常規配製 的DMEM/F12培養液至100毫升，即為本發明的組織工程人角膜內皮重建 專用培養液。
為了提高人角膜內皮細胞在脫上皮層羊膜載體支架上的貼附效果，本 發明又添加了 0.05%~0.1%纖連蛋白。
2、 人角膜內皮細胞系種子細胞的製備取人角膜內皮細胞，用含20% 小牛血清的DMEM/F12培養液在底面積25平方釐米培養瓶中置37'C進行 擴增培養，細胞繁殖60-84小時至對數生長期後，用玻璃滴管吸出培養液， 加入0.25%胰蛋白酶溶液消化1 2分鐘，加入此前吸出的培養液終止消化， 1000 1500轉/分離心10~15分鐘，細胞沉澱用5毫升上述專用培養液懸浮 均勻製成人角膜內皮細胞懸液；利用血球計數板進行細胞計數，用上述專 用培養液調整細胞濃度至4.2xlS 4.2xlO"個細胞/毫升。
3、 脫上皮層羊膜載體支架製備的倒置消化利用0.25%胰蛋白酶溶液 對凍幹羊膜的上皮面進行倒置消化，以得到完全脫去上皮層的羊膜，用 D-hanks溶液漂洗2次後，用打孔器將脫上皮層羊膜打成與培養板孔直徑 相同的羊膜圓片。
4、 組織工程人角膜內皮的體外重建脫上皮層羊膜圓片按照上皮面朝 上的方向平鋪於48孔培養板孔的底部，放置於37"C培養箱中牢固幹貼後 製成羊膜載體支架。在貼有脫上皮層羊膜載體支架的培養板孔中，輕輕加 入上述準備好的細胞懸液，注意接種時使滴管口儘量接近但不要碰到膜， 從膜的中央開始緩慢滴加細胞懸液，接種量為0.1-0.2毫升，用滴管輕輕 吹打使細胞懸液均勻分散於培養孔中，置5% C02細胞培養箱中在37'C條 件下培養20~24小時待細胞完全貼附到羊膜載體支架上後，補加上述專用 培養液使其液面達到培養孔高度的3/4，待人角膜內皮細胞在羊膜載體支 架上長成單層後即為重建的組織工程人角膜內皮。
實施例1
取人角膜內皮細胞，利用含20°/。小牛血清的DMEM/F12培養液在底面 積25平方釐米培養瓶中置37'C進行擴增培養84小時。取常規配製的 DMEM/F12培養液70毫升，加入IV型膠原蛋白40 80毫克，完全溶解後用0.22微米的微孔濾膜過濾除菌，加入20毫升小牛血清，補加常規配製 的DMEM/F12培養液至100毫升，即為本發明的組織工程人角膜內皮重建 專用培養液。對擴增培養後的培養瓶，用玻璃滴管吸出培養液，加入0.25% 胰蛋白酶溶液消化1.5分鐘，加入此前吸出的培養液終止消化，1500轉/ 分離心10分鐘，獲得細胞沉澱。細胞沉澱用5毫升上述專用培養液懸浮均 勻製成人角膜內皮細胞懸液；利用血球計數板進行細胞計數，用上述專用 培養液調整細胞濃度至4.7xlS個細胞/毫升。
利用0.25%胰蛋白酶溶液對凍千羊膜的上皮面進行倒置消化，以得到 完全脫去上皮層的羊膜，用D-hanks溶液漂洗2次後，用打孔器將脫上皮 層羊膜打成與培養板孔直徑相同的羊膜圓片，將該羊膜圓片按照上皮面朝 上的方向平鋪於48孔培養板孔的底部，放置於37t:培養箱中牢固千貼後 製成羊膜載體支架。在貼有脫上皮層羊膜載體支架的培養板孔中，輕輕加 入上述準備好的人角膜內皮細胞懸液，注意接種時使滴管口儘量接近但不 要碰到膜，從膜的中央開始緩慢滴加細胞懸液，接種量為0.2毫升，用滴 管輕輕吹打使細胞懸液均勻分散於培養孔中，置5°/。 C02細胞培養箱中在 37'C條件下培養24小時待細胞完全貼附到羊膜載體支架上後，補加上述專 用培養液使其液面達到培養孔高度的3/4，待人角膜內皮細胞在羊膜載體 支架上長成單層後即為重建的組織工程人角膜內皮。 實施例2
取人角膜內皮細胞，利用含20%小牛血清的DMEM/F12培養液在底面 積25平方釐米培養瓶中置37'C進行擴增培養72小時。取常規配製的 DMEM/F12培養液70毫升，加入IV型膠原蛋白40~80毫克，完全溶解後 用0.22微米的微孔濾膜過濾除菌，加入20毫升小牛血清，補加常規配製 的DMEM/F12培養液至100毫升，即為本發明的組織工程人角膜內皮重建 專用培養液。對擴增培養後的培養瓶，用玻璃滴管吸出培養液，加入0.25% 胰蛋白酶溶液消化1分鐘，加入此前吸出的培養液終止消化，1000轉/分 離心15分鐘，細胞沉澱用5毫升上述專用培養液懸浮均勻製成人角膜內皮 細胞懸液；利用血球計數板進行細胞計數，用上述專用培養液調整細胞濃 度至4.2><107個細胞/毫升。
利用0.25%胰蛋白酶溶液對凍幹羊膜的上皮面進行倒置消化，以得到 完全脫去上皮層的羊膜，用D-hanks溶液漂洗2次後，用打孔器將脫上皮 層羊膜打成與培養板孔直徑相同的羊膜圓片，將該羊膜圓片按照上皮面朝 上的方向平鋪於48孔培養板孔的底部，放置於37-C培養箱中牢固幹貼後 製成羊膜載體支架。在貼有脫上皮層羊膜載體支架的培養板孔中，輕輕加 入上述準備好的人角膜內皮細胞懸液，注意接種時使滴管口儘量接近但不要碰到膜，從膜的中央開始緩慢滴加細胞懸液，接種量為0.1毫升，用滴 管輕輕吹打使細胞懸液均勻分散於培養孔中，置5% C02細胞培養箱中在 37'C條件下培養22小時待細胞完全貼附到羊膜載體支架上後，補加上述專 用培養液使其液面達到培養孔高度的3/4，待人角膜內皮細胞在羊膜載體 支架上長成單層後即為重建的組織工程人角膜內皮。 實施例3
取人角膜內皮細胞，利用含20%小牛血清的DMEM/F12培養液在底面 積25平方釐米培養瓶中置37"進行擴增培養60小時。取常規配製的 DMEM/F12培養液70毫升，加入IV型膠原蛋白40-80毫克，完全溶解後 用0.22微米的微孔濾膜過濾除菌，加入20毫升小牛血清，補加常規配製 的DMEM/F12培養液至100亳升，即為本發明的組織工程人角膜內皮重建 專用培養液。對擴增培養後的培養瓶，用玻璃滴管吸出培養液，加入0.25% 胰蛋白酶溶液消化2分鐘，加入此前吸出的培養液終止消化，1500轉/分 離心12分鐘，細胞沉澱用5毫升上述專用培養液懸浮均勻製成人角膜內皮 細胞懸液；利用血球計數板進行細胞計數，用上述專用培養液調整細胞濃 度至4.4xl(^個細胞/毫升。
利用0.25%胰蛋白酶溶液對凍幹羊膜的上皮面進行倒置消化，以得到 完全脫去上皮層的羊膜，用D-hanks溶液漂洗2次後，用打孔器將脫上皮 層羊膜打成與培養板孔直徑相同的羊膜圓片，將該羊膜圓片按照上皮面朝 上的方向平鋪於48孔培養板孔的底部，放置於37"C培養箱中牢固幹貼後 製成羊膜載體支架。在貼有脫上皮層羊膜載體支架的培養板孔中，輕輕加 入上述準備好的人角膜內皮細胞懸液，注意接種時使滴管口儘量接近但不 要碰到膜，從膜的中央開始緩慢滴加細胞懸液，接種量為0.2毫升，用滴 管輕輕吹打使細胞懸液均勻分散於培養孔中，置5% C02細胞培養箱中在 37。C條件下培養20小時待細胞完全貼附到羊膜載體支架上後，補加上述專 用培養液使其液面達到培養孔高度的3/4，待人角膜內皮細胞在羊膜載體 支架上長成單層後即為重建的組織工程人角膜內皮。
權利要求
1、一種組織工程人角膜內皮的重建方法，首先利用含20％小牛血清的DMEM/F12培養液對人角膜內皮細胞進行擴增培養，經0.25％胰蛋白酶溶液消化和1000～1500轉/分離心10～15分鐘獲得人角膜內皮細胞沉澱，用DMEM/F12培養液、20％小牛血清和0.05％～0.1％IV型膠原蛋白組成的組織工程人角膜內皮重建專用培養液將該細胞沉澱懸浮成人角膜內皮細胞懸液；然後，利用0.25％胰蛋白酶對凍幹羊膜的上皮面進行倒置消化以製備完全脫去上皮層的羊膜，並用打孔器將該脫上皮層羊膜打成與培養板孔直徑相同的羊膜圓片；最後，按上皮面朝上將脫上皮層羊膜圓片平鋪於48孔培養板孔的底部，放在37℃培養箱中幹貼牢固後製成羊膜載體支架，將上述人角膜內皮細胞懸液0.1～0.2毫升接種在平鋪有上述羊膜載體支架的培養板中，待人角膜內皮細胞全部貼附在上述羊膜載體支架上後，再補加上述專用培養液並使液面達到培養孔高度的3/4，待人角膜內皮細胞在羊膜載體支架上長成單層即為重建的組織工程人角膜內皮。
2、 如權利要求1所述的組織工程人角膜內皮的重建方法，其特徵是所述 組織工程人角膜內皮重建專用培養液中又添加了 0.05%~0.1%纖連蛋白。
3、 如權利要求1所述的組織工程人角膜內皮的重建方法，其特徵在於上 述擴增培養方法是將人角膜內皮細胞擴增培養至對數生長期。
4、 如權利要求3所述的組織工程人角膜內皮的重建方法，其特徵是上述 已達到對數生長期的人角膜內皮細胞的濃度為4.2xl0、4.2x107個細胞/毫 升。
全文摘要
本發明涉及一種組織工程人角膜內皮的重建方法，是利用20％小牛血清-DMEM/F12培養液將角膜內皮細胞體外培養至對數生長期，採用胰蛋白酶消化獲得完全脫上皮層的羊膜載體支架，平鋪在培養板孔中牢固幹貼後，將懸浮於含有IV型膠原蛋白和20％小牛血清的DMEM/F12培養液的對數生長期人角膜內皮細胞，接種至在平鋪有羊膜載體支架的培養板孔中啟動體外培養，進行組織工程人角膜內皮的體外重建。本發明工藝科學合理，所重建的組織工程人角膜內皮可用於批量生產，滿足角膜內皮盲臨床角膜移植治療對組織工程人角膜內皮的大量需求，且組織工程人角膜內皮體外重建和臨床治療的成本低。
文檔編號C12N5/08GK101508971SQ20091002003
公開日2009年8月19日 申請日期2009年3月23日 優先權日2009年3月23日
發明者叢日山, 於昊澤, 楊洪收, 樊廷俊, 晶 王, 君 趙 申請人:中國海洋大學