增強解離螢光分析的製作方法
2023-07-08 04:01:56 1
專利名稱：增強解離螢光分析的製作方法
技術領域：
本發明涉及商業上稱為DELFIA分析技術的一種改進形式，它用鑭系離子或其螯合物作為標記並用增強解離螢光作為檢測工具。
背景技術：
此處所用用以闡述發明背景的出版物和其它資料，尤其是其中提供關於實踐的補充詳情的實例均引入作為參考。
鑭系元素及其螯合物已經成為各種分析中一類重要的標記，例如免疫分析，雜交分析，受體-配體分析以及其它分析[reviewsHemmil，Application of Fluorescence inImmunoassays，Wiley，1991；Hemmil，Sthlberg and Mottram(eds.)，Bioanalytical Applications of Labeling Technologies，Wallac，1995；Hemmil and Mukkala，Crit.Rev.Clin.Lab.Sci.，38(6)441-519(2001)]。鑭系元素的長激發態壽命使其能極有效和簡單地利用時間分辨以排除背景幹擾和獲得最終螢光分析法的敏感度。鑭系元素示蹤的其它優點涉及到它們獨特的光譜性質，例如長斯託克司位移(250nm以上)，以及窄頻帶離子特性發射譜線。這些光譜性質使得鑭系元素能被用於實際的多示蹤分析，其中檢測可以利用光譜以及瞬時分辨力。
有許多技術用到鑭系元素作示蹤。第一個也是最初的技術，即DELFIA技術，用兩個螯合體系來增強螢光並檢測，一個用於優化示蹤，第二個在實際分析完成後形成(US4,565,790，EP 0 064 484)。這一技術仍然是最靈敏的，而且得到廣泛應用。在診斷，電影放映，藥物發現以及其它研究領域中有許多申請。不考慮那些廣泛的研究發現以及為數眾多的專利，對於具有允許進行相似分析而沒有增強的優化性質的單個鑭系螯合結構的開發仍是一個挑戰，原因在於，存在如能量轉移，強度，保護，生物相容性以及偶合問題。
最初的DELFIA技術的主要問題涉及到增強過程的配體變化。利用現有的由β-二酮的三氟代衍生物，最常見的萘甲醯三氟丙酮(β-NTA，即4，4，4-三氟-1-(2-萘基)-1，3-丁二酮)構成的增強，最低pH值可以用約3.0。因此為了達到上述目的，特定的蛋白質示蹤螯合物已經基於二亞乙基三胺-N，N』，N」，N」-四乙酸酯基團(DTTA)開發出來(US4,808,541，EP 0 139 675)，它在用於增強溶液的pH值下迅速釋放銪離子從而產生新的高螢光螯合物，伴隨著過量的萘甲醯三氟丙酮出現在增強溶液中。
當生物測試需要具有較高熱力學或動力學穩定性的示蹤螯合物時，最初的增強體系就需要進行相當長時間的增強，當要開發快速通用的體系這樣做既不方便也不合意。例如，DNA傳感器的應用經常需要比較穩定的示蹤螯合物試劑，和對於基於DNA的應用而言，2，2』，2」，2-[[4-[2-(4-異硫氰酸根合苯基)乙基]-吡啶2，6-二基]二(亞甲基次氮基)]四(乙酸)的鑭系螯合物被發現是最佳的(EP 0 298939，US6,127,529)。然而，所用的螯合物需要較長的螢光增強時間，和通常需要20-30分鐘來穩定增強溶液中的螢光。
現有的DELFIA技術對於通過一體化乾式試劑體系完成樣品的快速隨機存取分析的應用，已經發現是不合適的[Pettersson etal.，Luminescence，15399-407(2000)]。在這一體系中，用來製備一體化特效分析的乾式試劑槽的乾燥操作需要強螯合試劑，這是由於在乾燥過程中有離子解離的危險。對於DELFIA優化的DTTA螯合物的應用還沒有發現適合該方法。另一方面，如果使用較強的螯合示蹤試劑，所需用於增強的時間對於整個過程而言是太長了。
在最初的DELFIA技術不合適的另一方面是可能含有高濃度的檸檬酸鹽或EDTA的血漿樣品的分析。在分析物的一步法分析中(在如半抗原抗原的競爭分析中所需要)DELFIA優化的DTTA螯合物不能被應用，原因在於存在競爭螯合過程。
然而其它需要改善增強/示蹤體系的分析類型中，涉及到無論是游離或是絡合的鑭系元素都被用作示蹤。這些分析的例子如細胞毒素分析，其中DTPA的銪螯合物被用作細胞內的示蹤。其它類似分析也可以用鑭系元素作為示蹤/追蹤，其被廣泛用於各種方法中(環境樣品，新陳代謝路線等)。
其它的需要具有比DTTA更高穩定性和改進增強性的示蹤螯合物的分析類型涉及到一些應用，其中反應混合物中含有高濃度的金屬離子。這些分析的例子如用於免疫測試的酶活性測試和土壤分析，其中可以存在較高含量的重金屬。
Mullinax等人通過向增強溶液中加入少量的多陰離子化合物來改進DELFIA方法(US6,030,840，WO99/66333)。他們教導在較高的pH值時從螯合物解離鑭系離子已經較快。這些例子中用到的螯合物是苯甲基-EDTA的衍生物以及DTPA，其中醋酸根基團被用來偶合生物分子。這些螯合物的穩定性與DELFIA方法中用到的DTTA衍生物相比較低或大致相同。由Mullinak等人所提出的方法可能通過更穩定的用於標記生物分子的螯合物來操作尚沒有證據和數據。與商品化的增強溶液(Wallac產品)相比，上面提到的方法沒有提供改進，這也是因為商業的DELFIA增強已經包含了聚陰離子(鄰苯二甲酸)。
Dakubu將螢光增強分為兩個部分(US5,124,268)。第一部分是通過降低pH值至1.5-3.0來從穩定的鑭系螯合物解離金屬。這一方法的第二部分是將pH值改變至3.5以上並且使螢光鑭系螯合物顯影。然而，該兩步法用於自動診斷系統太費力，因為它需要額外的保溫和附加步驟。
發明目的和概述本發明的一個目的是提供一種用於分析技術的改進增強溶液，其中使用鑭系離子或其螯合物作為示蹤並用增強解離螢光作為檢測工具。
本發明的另一個目的是提供一種用鑭系離子或其螯合物作為示蹤並用增強解離螢光作為檢測工具的改進的分析。
因此本發明提供一種用於分析技術的增強溶液，用鑭系離子或其螯合物作為示蹤並用增強解離螢光作為檢測工具，其中所述增強溶液包含式I的β-二酮 其中R1是芳基，任選一個或多個取代的，以及R2是具有2-9個碳原子的直鏈或支鏈烷基鏈，有四個或更多個氟原子取代，任選一個或多個不同於氟的取代基取代。
本發明還提供了一種用鑭系離子或其螯合物作為示蹤並以增強解離螢光作為檢測工具的生物親和分析，包括步驟a)混合包含要分析的分析物的樣品和所述分析的反應物以得到分析混合物；b)所述分析物與所述反應物反應，其中所述分析的分析物和反應物發生生物親和反應，結果得到反應產物，其中i)分析物連結在至少一個被鑭系元素或鑭系螯合物以共價或非共價示蹤的反應物上，或ii)分析物類似物或其它反應物與分析物在量上正或負相關，被鑭系元素直接示蹤，其中上述i)和ii)中的鑭系元素在下文中稱為示蹤鑭系元素；c)分離步驟b)中得到的反應產物，所述產物包含上文規定的來自於未結合的游離示蹤反應物的示蹤鑭系元素；d)將前面限定的增強溶液加入到i)從步驟b)的反應產物的螯合物解離出示蹤鑭系元素，以及ii)與所述增強溶液的β-二酮形成高螢光鑭系螯合物，以及e)用螢光計測量步驟d)的示蹤鑭系元素的含量，其為β-二酮絡合物，該數量與步驟a)中樣品的分析物的含量正或負相關。
附圖簡要說明
圖1表示EDTA濃度對增強溶液在振蕩一小時後鑭系元素信號的影響。
圖2表示在包含不同含量的1-(2-苯並呋喃基)-4，4，5，5，5-五氟代-1，3-戊二酮(BFPP)和反-HCG抗體用(S)-1-(4-異硫氰酸根合苯甲基)二亞乙基三胺-N，N，N』，N」，N」-五乙酸的銪螯合物示蹤的增強溶液的螢光顯影時間。
發明詳述本發明涉及利用鑭系離子或其螯合物作為示蹤並以增強解離螢光作為檢測工具的分析技術。廣泛應用於診斷和研究的這類技術商業上稱為DELFIA技術。本發明提供一種DELFIA增強方法的改進，使得單一的示蹤反應物能用於所有應用，甚至於用非常穩定的示蹤螯合物也能得到快速增強過程。該改進的增強體系有助於解決上述問題，並且使快速配位交換動力學成為可能且無需考慮其應用。
通過此處描述的改性增強過程，速度和強度都有所改進。這一新改進的增強過程使得其應用需要更穩定的示蹤螯合物，和尤其能使得單一類型的螯合示蹤適用於所有應用。這一新的增強體系也避免了最初工藝中的困難，其涉及如血漿樣品及其它包含高濃度EDTA或檸檬酸鹽或其它強螯合劑的樣品，含有高濃度金屬離子的樣品和緩衝劑，或由於任何其它原因而在示蹤螯合穩定性方面要求高的分析。
本發明有可能通過改變所用的β-二酮的結構來實現。從用於生物分子示蹤的鑭系螯合物中解離出金屬後，β-二酮已經被用作螢光增強配體。目前的增強溶液，一種由Wallac商業化的產品和在文獻中描述的那些增強溶液都是基於三氟取代β-二酮，例如，4，4，4-三氟-1-(2-萘基)-1，3-丁二酮或4，4，4-三氟-1-(2-噻吩基)-1，3-丁二酮。這些化合物在所用解離pH值3.0-3.5時能形成發光的鑭系螯合物。如果pH值較低，三氟代β-二酮就不再有效果。按照本發明，β-二酮中的三氟甲基基團被更高氟化的基團取代，因此允許用較低的pH值。本發明優選的β-二酮是1-芳基-4，4，5，5，5-五氟-1，3-戊二酮和1-芳基-4，4，5，5，6，6，6-七氟-1，3-己二酮。
β-二酮結構中加入強電負性的氟原子增加它們的酸性。由於這一效應，這些新的β-二酮能使螯合鑭系金屬的pH值下降至2.0-2.8。本發明的增強溶液包含這些新的β-二酮，並且較低pH值加速了解離速率和新螯合物的形成。如果解離速率變快，更穩定的鑭系螯合物就能用於生物分子示蹤。
4，4，5，5，5-五氟-1-芳基-1，3-戊二酮和4，4，5，5，6，6，6-七氟-1-芳基-1，3-己二酮結構的β-二酮在文獻中是眾所周知的。實例是4，4，5，5，5-五氟-1-(3-氟-4-甲氧苯基)-1，3-戊二酮[81516-12-3]，1-(2，5-二氟苯基)-4，4，5，5，5-五氟-1，3-戊二酮[64287-16-7]，4，4，5，5，5-五氟-1-(4-氟苯基)-1，3-戊二酮[64287-12-3]，1-(4-溴代-苯基)-4，4，5，5，6，6，6-七氟-1，3-己二酮[307531-56-2]，1-(9H-芴-2基)-4，4，5，5，6，6，6-七氟-1，3-己二酮[202460-66-0]以及1-[1，1』-聯苯基]-4-基-4，4，5，5，6，6，6-七氟-1，3-己二酮[171666-86-7]，括號中是CA的登記號碼，但它們在分析系統中的應用還沒有說明或是暗示過。
因此本發明涉及用於分析技術的增強溶液，該溶液用鑭系離子或其螯合物作為示蹤，並用增強解離螢光作為檢測工具，其中所述的增強溶液包括式I的β-二酮 其中，R1是芳基，任選單或多取代的，以及R2是具有2-9個，優選2-5個碳原子，被4個或更多個氟原子取代，任選單或多個不同於氟的取代物取代的直鏈或支鏈烷基鏈。
所述R1的芳基優選選自苯基，9H-芴-2基，1-萘基，2-萘基，2-菲酚基，3-菲酚基，4-菲酚基，5-菲酚基，2-呋喃基，3-呋喃基，2-苯並呋喃基，3-苯並呋喃基，2-噻吩基，3-噻吩基，2-吡啶基，3-吡啶基，4-吡啶基，2-噻唑基，4-噻唑基，5-噻唑基，2-苯並噻唑基，2-苯並[b]噻吩基，3-苯並[b]噻吩基，2-嘧啶基，4-嘧啶基以及5-嘧啶基。
所述R1的芳基可以是單或多取代的。每個取代基可以獨立地是如，直鏈或支鏈烷基，烷氧基，芳基，芳醯基，芳氧基，硝基，氨基，氰基，羥基，羧基，氯基，溴基，氟基或醯基。如果取代包括能被取代的原子，這些原子將依次被取代。
烷基鏈R2優選被4-9個氟原子取代，更優選5-7個氟原子。
烷基鏈R2的最接近羰基基團的碳原子，優選最初的2-5個碳原子被氟原子取代，優選5-7個氟原子。
4，4，5，5，5-五氟-1-芳基-1，3-戊二酮或4，4，5，5，6，6，6-七氟-1-芳基-1，3-己二酮是作為增強溶液的β-二酮的優選替換物。典型的增強溶液的β-二酮是1-(2-苯並呋喃基)-4，4，5，5，5-五氟-1，3-戊二酮，1-(2-苯並呋喃基)-4，4，5，5，6，6，6-七氟-1，3-己二酮，1-(2-苯並[b]噻吩基)-4，4，5，5，5-五氟-1，3-戊二酮以及1-(2-苯並[b]噻吩基)-4，4，5，5，6，6，6-七氟-1，3-己二酮。
R2可以是被單或多不同於氟的取代基取代的，每個取代基獨立地選自直鏈或支鏈烷基，烷氧基，芳基，芳醯基，芳氧基，硝基，氨基，氰基，羥基，羧基，氯基，溴基和醯基。如果取代包括能被取代的原子，這些原子將依次被取代。
該增強溶液優選是pH值為2.0-2.8的緩衝溶液。該增強溶液優選是1-50μM的β-二酮溶液。
該增強溶液優選包含去汙劑，就是烷基芳基聚醚醇，兩性離子，或季銨化合物。該增強溶液典型地包含0.1％-0.5％的烷基芳基聚醚醇。作為增強溶液的去汙劑的典型替代物是Triton X-100，3-[(3-乙醇醯氨基丙基)二甲胺基]-1-丙磺酸鹽和溴化十六烷基三甲銨。該增強溶液優選包含路易斯鹼，就是氧化三烷基膦或氧化三芳基膦。該路易斯鹼典型的是氧化三辛基膦，和增強溶液優選10-100μM氧化三辛基膦。
本發明還涉及一種用鑭系離子或其螯合物作為示蹤並用增強解離螢光作為檢測工具的生物親和分析，包括步驟a)混合包含要分析的分析物的樣品和所述分析的反應物以得到分析混合物；b)所述分析物與所述反應物反應，其中所述分析的分析物和反應物發生生物親和反應，結果得到反應產物，其中i)分析物連結在至少一個被鑭系元素或鑭系螯合物以共價或非共價示蹤的反應物上，或ii)分析物類似物或其它反應物與分析物在量上正或負相關，被鑭系元素直接示蹤，其中上述i)和ii)中的鑭系元素在下文中稱為示蹤鑭系元素；c)分離步驟b)中得到的反應產物，所述產物包含上文規定的來自於未結合的游離示蹤反應物的示蹤鑭系元素，優選用固相固定的反應物作為接受器；d)將本發明的增強溶液加入到i)從步驟b)的反應產物的螯合物解離出示蹤鑭系元素，以及ii)與所述增強溶液的β-二酮形成高螢光鑭系螯合物，以及e)用螢光計測量步驟d)的示蹤鑭系元素的含量，其為β-二酮絡合物，該數量與步驟a)中樣品的分析物的含量正或負相關。
所述分析的反應物可以包含生物結合試劑如單克隆，多克隆，工程或碎片抗體，受體，配體，天然結合蛋白質，酶，肽，外源凝集素，抗生蛋白鏈菌素或抗生物素蛋白，低聚核苷酸，多聚核苷酸，結合塑性印記，細胞，細胞碎片，隔膜或細胞束。如果生物結合試劑是低聚核苷酸或多聚核苷酸，所述試劑可選自DNA，RNA，cDNA，cDNA序列，mRNA，PNA或適體(aptamer)。
分析物可以是半抗原，抗原，激素，蛋白質，肽，藥品，病毒，DNA序列，RNA，微生物，環境毒素，細胞，細胞碎片，隔膜或微細胞束。
步驟b)的反應產物可以是如免疫複合體，蛋白質-蛋白質複合體，抗原-抗體複合體，核苷雜化物，酶的最終產物或細胞反應的最終產物。
鑭系元素可以是銪，鋱，釤或鏑。
用於測量分析物的反應物可以是如酶基質。
按照本發明的方法也可以包含兩個或更多個親和分析，這些分析用相同的樣品和分析混合物通過用不同的鑭系元素示蹤每個分析的反應物來完成。不同的鑭系元素的螢光可以用相同的增強溶液測試。
現在用實施例1-10描述的合適的β-二酮的合成來解釋本發明。EDTA濃度對增強溶液的鑭系標記的影響在實施例11中描述。實施例12給出包含不同量的1-(2-苯並呋喃)-4，4，5，5，5-五氟-1，3-戊二酮(BFPP)和抗-HCG用銪螯合物(S)-1-(4-異硫氰酸根合苯甲基)二亞乙基三胺-N，N，N』，N」，N」-五醋酸示蹤的增強溶液的顯影時間。
實施例14，4，5，5，5-五氟-1-(2-噻吩基)1，3-戊二酮將2-乙醯基噻吩(4.3ml)溶於乾燥甲苯(40ml)。緩緩加入氫化鈉(60％，3.2g)，並攪拌混合物15分鐘。加入五氟丙酸乙酯(13.44g)並繼續攪拌過夜。加入硫酸(10％，50ml)，分相。用水(50ml)洗滌有機相，並蒸發至乾燥。殘液蒸餾(b.p.92-94℃/0.15mbar)得到產物(9.0g)。1H NMR(CDCl3)6.50(s，1H)；7.21(dd，1H，J＝3.9和4.9)；7.77(dd，1H，J＝1.1和4.9Hz)；7.85(dd，1H，J＝1.1和3.9Hz)。IR(film)1592(C＝O)；1202(C-F)。
實施例2
4，4，5，5，6，6，6-七氟-1-(2-噻吩基)1，3-己二酮該化合物按照實施例1的方法合成，用2-乙醯基噻吩和七氟丁酸乙酯作為起始物質。1H NMR(CDCl3)6.49(s，1H)；7.21(dd，1H，J＝3.8和5.1)；7.77(dd，1H，J＝1.2和5.1Hz)；7.85(dd，1H，J＝1.2和3.8Hz)。IR(film)1589(C＝O)；1230(C-F)。
實施例31-(5-氧基-2-噻吩基)-4，4，5，5，5-五氟-1，3-戊二酮該化合物按照實施例1的方法合成，用2-乙醯基-5-氰基噻唑和五氟丙酸乙酯作為起始物質。產物用閃蒸色譜法提純(二氧化矽，10％乙酸乙酯在石油醚中作為洗脫劑)。1H NMR(CDCl3)6.53(s，1H)；7.68(d，1H，J＝4.2Hz)；7.79(d，1H，J＝4.2Hz)。
實施例41-(5-羧基-2-噻吩基)-4，4，5，5，5-五氟-1，3-戊二酮1-(5-氰基-2-噻吩基)-4，4，5，5，5-五氟-1，3-戊二酮(0.78g)，硫酸(9ml)以及醋酸(10ml)的混合物回流2個小時。將冷卻的混合物注入到100ml水中。將沉澱物過濾並用水洗滌。1H NMR(CDCl3)6.53(s，1H)；7.57(d，1H，J＝4.1Hz)；7.78(d，1H，J＝4.1Hz)。
實施例54，4，5，5，6，6，6-七氟-1-(2-呋喃基)-1，3-己二酮該化合物按照實施例1的方法合成，用2-乙醯基呋喃和七氟丁酸乙酯作為起始物質。1H NMR(CDCl3)6.54(s，1H)；6.65(dd，1H，J＝1.6和3.6Hz)；7.37(dd，1H，J＝0.6和3.6Hz)；7.70(dd，1H，J＝0.6和1.6Hz)。IR(film)1616(C＝O)；1231(C-F)。
實施例64，4，5，5，5-五氟-1-(2-萘基)-1，3-戊二酮該化合物按照實施例1的方法合成，用2-乙醯基萘和五氟丙酸乙酯作為起始物質。產物在石油醚中結晶出來。1H NMR(CDCl3)6.79(s，1H)；7.57-7.67(m，2H)；7.90(bd，1H)；7.94-7.95(m，2H)；7.99(bd，1H)；8.53(s，1H)。IR(film)1602(C＝O)；1201(C-F)。
實施例74，4，5，5，6，6，6-七氟-1-(2-萘基)-1，3-己二酮該化合物按照實施例1的方法合成，用2-乙醯基萘和七氟丁酸乙酯作為起始物質。產物從石油醚中結晶出來。1H NMR(CDCl3)6.76(s，1H)；7.57-7.66(m，2H)；7.90(bd，1H)；7.93-7.94(m，2H)；7.98(bd，1H)；8.53(s，1H)。IR(film)1602(C＝O)；1232(C-F)。
實施例81-(2-苯並[b]噻吩基)-4，4，5，5，5-五氟-1，3-戊二酮該化合物按照實施例1的方法合成，用2-乙醯基苯並[b]噻吩基和五氟丙酸乙酯作為起始物質。產物從乙醇中結晶出來。1H NMR(CDCl3)6.63(s，1H)；7.89-7.93(m，3H)；8.12(d，1H，J＝0.6Hz)。IR(film)1589(C＝O)；1203(C-F)。
實施例91-(2-苯並呋喃基)-4，4，5，5，5-五氟-1，3-戊二酮該化合物按照實施例1的方法合成，用2-乙醯基苯並呋喃和五氟丙酸乙酯作為起始物質。產物從石油醚中結晶出來。1H NMR(CDCl3)6.75(s，1H)；7.35(ddd，1H，J＝0.9和7.1和7.9Hz)；7.51(ddd，1H，J＝1.3和7.1和8.4Hz)，7.58-7.60(m，1H)；7.67(d，1H，J＝0.9Hz)；7.71-7.73(m，1H)。IR(film)1614(C＝O)；1211，1200(C-F)。
實施例101-(2-苯並呋喃基)-4，4，5，5，6，6，6-七氟-1，3-己二酮該化合物按照實施例1的方法合成，用2-乙醯基苯並呋喃和七氟丁酸乙酯作為起始物質。產物從石油醚中結晶出來。1H NMR(CDCl3)6.74(s，1H)；7.35(ddd，1H，J＝0.9和7.2和8.0Hz)；7.52(ddd，1H，J＝1.3和7.2和8.4Hz)，7.58-7.61(m，1H)；7.68(d，1H，J＝0.9Hz)；7.71-7.74(m，1H)；IR(film)1614(C＝O)；1232(C-F)。
實施例11EDTA濃度對振蕩1小時後的增強溶液的鑭系元素信號的影響在圖1中呈現。ES-W相當於Wallac商品化的增強溶液。ES-BFPP和ES-BFHH是本發明的增強溶液，相應包含有1-(2-苯並呋喃基)-4，4，5，5，5-五氟-1，3-戊二酮(BFPP)和1-(2-苯並呋喃基)-4，4，5，5，6，6，6-七氟-1，3-己二酮(BFHH)。新的增強溶液的內容物如下5μM β-二酮，0.2％ Triton X-100，50μM氧化三辛基膦以及氨基乙酸-HCl-緩衝劑，pH＝2.3。
實施例12圖2給出了包含不同量的1-(2-苯並呋喃)-4，4，5，5，5-五氟-1，3-戊二酮(BFPP)和抗-HCG抗體用銪螯合物(S)-1-(4-異硫氰酸根合苯甲基)二亞乙基三胺-N，N，N』，N」，N」-五醋酸示蹤的增強溶液的顯影時間。ES-W相當於Wallac商品化的增強溶液。
應意識到本發明可以各種具體實例的形式結合，僅有少數具體實例在此公開。顯然，對於本領域的專家來說，其它具體實例存在，並且不背離本發明的宗旨。因此，上述具體實例是用來說明的而不應當認作限制性的。
權利要求
1.一種用於分析技術的增強溶液，用鑭系離子或其螯合物作為標記並用增強解離螢光作為檢測工具，其中所述增強溶液包含式I的β-二酮 其中R1是芳基，任選一個或多個取代的，以及R2是具有2-9個碳原子的直鏈或支鏈烷基鏈，被四個或更多個氟原子取代，任選被一個或多個不同於氟的取代基取代。
2.按照權利要求1或2所述的增強溶液，其中所述R1的芳基選自苯基，9H-芴-2-基，1-萘基，2-萘基，2-菲酚基，3-菲酚基，4-菲酚基，5-菲酚基，2-呋喃基，3-呋喃基，2-苯並呋喃基，3-苯並呋喃基，2-噻吩基，3-噻吩基，2-吡啶基，3-吡啶基，4-吡啶基，2-噻唑基，4-噻唑基，5-噻唑基，2-苯並噻唑基，2-苯並[b]噻吩基，3-苯並[b]噻吩基，2-嘧啶基，4-嘧啶基以及5-嘧啶基。
3.按照權利要求1，2或3所述的增強溶液，其中所述R1的芳基是單或多取代的，每個取代基獨立地選自直鏈或支鏈烷基，烷氧基，芳基，芳醯基，芳氧基，硝基，氨基，氰基，羥基，羧基，氯基，溴基，氟基以及醯基。
4.按照前述權利要求中的任何一項所述的增強溶液，其中烷基鏈R2是具有2-5個碳原子的直鏈或支鏈烷基鏈。
5.按照前述權利要求中的任何一項所述的增強溶液，其中烷基鏈R2被4-9個氟原子取代。
6.按照權利要求5所述的增強溶液，其中烷基鏈R2被5-7個氟原子取代。
7.按照權利要求6所述的增強溶液，其中烷基鏈R2被5-7個氟原子取代，其中R2被取代的是開始的2-5個碳原子。
8.按照權利要求7所述的增強溶液，其中β-二酮是4，4，5，5，5-五氟-1-芳基-1，3-戊二酮或4，4，5，5，6，6，6-七氟-1-芳基-1，3-己二酮。
9.按照權利要求7所述的增強溶液，其中β-二酮選自1-(2-苯並呋喃基)-4，4，5，5，5-五氟-1，3-戊二酮，1-(2-苯並呋喃基)-4，4，5，5，6，6，6-七氟-1，3-己二酮，1-(2-苯並[b]噻吩基)-4，4，5，5，5-五氟-1，3-戊二酮以及1-(2-苯並[b]噻吩基)-4，4，5，5，6，6，6-七氟-1，3-己二酮。
10.按照權利要求1-7任何一項所述的增強溶液，其中R2是被不同於氟的其他取代基單或多取代的，每個取代基獨立地選自直鏈或支鏈烷基，烷氧基，芳基，芳醯基，芳氧基，硝基，氨基，氰基，羥基，羧基，氯基，溴基以及醯基。
11.按照前述權利要求中的任何一項所述的增強溶液，其中增強溶液是pH值為2.0-2.8的緩衝溶液。
12.按照前述權利要求中的任何一項所述的增強溶液，其中增強溶液是1-50μM的所述β-二酮溶液。
13.按照前述權利要求中的任何一項所述的增強溶液，其中增強溶液包含去汙劑，它是a)烷基芳基聚醚醇，b)兩性離子，或c)季銨化合物。
14.按照權利要求13所述的增強溶液，其中增強溶液包含0.1％-0.5％的烷基芳基聚醚醇。
15.按照權利要求13所述的增強溶液，其中增強溶液包含去汙劑，選自Triton X-100，3-[(3-乙醇醯氨基丙基)二甲胺基]-1-丙磺酸鹽和溴化十六烷基三甲銨。
16.按照前述權利要求中的任何一項所述的增強溶液，其中增強溶液包含路易斯鹼，其為氧化三烷基膦或氧化三芳基膦。
17.按照權利要求16所述的增強溶液，其中路易斯鹼是氧化三辛基膦，該增強溶液是10-100μM氧化三辛基膦溶液。
18.一種用鑭系離子或其螯合物作為示蹤並用增強解離螢光作為檢測工具的生物親和分析，包括步驟a)混合包含要分析的分析物的樣品與所述分析的反應物以得到分析混合物；b)所述分析物與所述反應物反應，其中所述分析的分析物和反應物發生生物親和反應，結果得到反應產物，其中i)分析物連結在至少一個被鑭系元素或鑭系螯合物以共價或非共價示蹤的反應物上，或ii)分析物類似物或其它反應物和分析物在量上正或負相關，被鑭系元素直接示蹤，其中上述i)和ii)中的鑭系元素在下文中稱為示蹤鑭系元素；c)分離步驟b)中得到的反應產物，所述產物包含上文規定的來自於未結合的游離示蹤反應物的示蹤鑭系元素；d)將權利要求1的增強溶液加入到i)從步驟b)的反應產物的螯合物中解離示蹤鑭系元素，以及ii)與所述增強溶液的β-二酮形成高螢光鑭系螯合物，以及e)用螢光計測量步驟d)的示蹤鑭系元素的含量，其為β-二酮絡合物，該數量與步驟a)中樣品的分析物在量上正或負相關。
19.按照權利要求18所述的方法，其中分離步驟c)用固相固定的反應物作為收集器來實現。
20.按照權利要求18或19所述的方法，其中測量步驟e)通過時間分辨來實現。
21.按照權利要求18，19或20所述的方法，其中分析反應物包含生物結合試劑，選自單克隆，多克隆，工程或碎片抗體，受體，配體，天然結合蛋白質，酶，肽，外源凝集素，抗生蛋白鏈菌素或抗生物素蛋白，低聚核苷酸，多聚核苷酸，結合塑性印記，細胞，細胞碎片，隔膜以及細胞束。
22.按照權利要求21所述的方法，其中生物結合試劑是低聚核苷酸或多聚核苷酸，選自DNA，RNA，cDNA，cDNA序列，mRNA，PNA或適體(aptamer)。
23.按照權利要求18-22任何一項所述的方法，其中分析物選自半抗原，抗原，激素，蛋白質，肽，藥品，病毒，DNA序列，RNA，微生物，環境毒素，細胞，細胞碎片，隔膜或細胞束。
24.按照權利要求18-23任何一項所述的方法，其中鑭系元素是銪，鋱，釤或鏑。
25.按照權利要求18-24任何一項所述的方法，其中兩個或更多個生物親和分析用相同的樣品和分析混合物通過用不同的鑭系元素示蹤每個分析的反應物來完成。
26.按照權利要求25所述的方法，其中不同的鑭系元素的螢光用相同的增強溶液來測試。
全文摘要
本發明涉及一種用於分析技術的增強溶液，用鑭系離子或其螯合物作為示蹤並用增強解離螢光作為檢測工具，其中所述增強溶液包含式I的β－二酮其中R
文檔編號G01N33/577GK1650165SQ03809344
公開日2005年8月3日 申請日期2003年2月28日 優先權日2002年3月8日
發明者I·赫米萊, K·布羅姆伯格, V·-M·穆卡拉, H·哈卡拉 申請人:沃拉克有限公司