乙酸測定試劑盒及乙酸濃度測定方法
2023-07-08 01:32:01
專利名稱：乙酸測定試劑盒及乙酸濃度測定方法
技術領域：
本發明涉及一種乙酸測定試劑盒，同時本發明還涉及測定乙酸濃度的 方法，屬於食品/環境檢驗測定技術領域。
技術背景隨著配製食醋標準的出臺，食品添加劑乙酸(醋酸)的質量合格與否又直接關係著人民身體健康與否。在條文強制性標準配製食醋G B 10337—2000中明確規定,配製食醋所用的乙酸應符合G B 1903—1996的 規定，即應符合食品添加劑醋酸的要求。用工業醋酸假冒"食品添加劑醋 酸"，例如，使用某些副產品或回收的工業醋酸進行脫色，濃度不夠時加入 鹽酸、磷酸等以增加酸度。這類醋酸對人體的危害很大，因為這類醋酸不 僅含有添加的有毒、有害無機物,還含些很難說清的有害有機物。 發明內容本發明要解決的技術問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯法(Couple Reaction)技術，監測還 原型煙醯胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測 定乙酸濃度的方法，同時，本發明還將給出用以實現該方法的乙酸測定試 劑盒，採用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析 儀上進行乙酸濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實 的推廣應用。本發明乙酸濃度測定方法原理如下乙酸+ 二氧化碳+亞鐵細胞色素bl 丙酮酸氧化酶丙酮酸+高鐵細胞色素bl +水 丙酮酸+氨離子+還原型輔酶丙氨酸脫氫酶 L-丙氨酸+水+輔酶這種方法應用丙酮酸氧化酶(pyruvate oxidase ; EC 1.2.2.2)酶(偶) 聯丙氨酸脫氫酶(alanine dehydrogenase ; EC1.4丄1)酶促反應連續監 測法/速率比色法。丙酮酸氧化酶酶解乙酸反應產生丙酮酸，再通過(偶) 聯合丙氨酸脫氫酶的作用，最終將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰) 氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在 340nm處吸光度下降的程度/速度，通過測量340nm處吸光度下降的程度 /速度，可以測算乙酸的濃度大小。實驗表明，從測定結果的準確性和配製成本的經濟性兩方面綜合考慮， 無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關係的本發明乙酸測定試劑盒較為理想緩衝液穩定劑還原型輔酶二氧化碳亞鐵細胞色素bl丙酮酸氧化f100mmol/L 500 mmol/L 0.25 mmol/L 20 mmol/L 5 mmol/L 20 mmol/L 8000 U/丙氨酸脫氫酶 12000 U/L本發明的乙酸測定試劑盒可以是單劑，包括緩衝液、穩定劑、還原型輔酶、二氧化碳、亞鐵細胞色素bl、氨 離子、丙酮酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶。 試劑盒可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也可以配製成液 體試劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 * 試劑l緩衝液、穩定劑、還原型輔酶、二氧化碳、亞鐵細胞色素bl、 氨離子。 試劑2緩衝液、穩定劑、丙酮酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶。 還原型輔酶、二氧化碳、亞鐵細胞色素M、氨離子、丙酮酸氧化酶、 丙氨酸脫氫酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是乾粉狀 態，在使用前加水溶解後使用；也可以配製成液體試劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1緩衝液、穩定劑、還原型輔酶、二氧化碳、亞鐵細胞色素bl、 氨離子。 試劑2緩衝液、穩定劑、丙氨酸脫氫酶。 試劑3緩衝液、穩定劑、丙酮酸氧化酶。 還原型輔酶、二氧化碳、亞鐵細胞色素bl、氨離子、丙酮酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以 是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也可以配製成液體試劑，直接使 用。無論是單劑、雙劑還是三劑，本發明測定乙酸濃度的方法，其還原型 輔酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一種。
具體實施方式
下面結合實施例子對本發明作進一步的說明。 實施例一本實施例的乙酸測定試劑為單試劑，包括三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩衝液 100mmol/L穩定劑 還原型輔酶 二氧化碳 亞鐵細胞色素bl500 mmol/L0.25 mmol/L20 mmol/L5 mmol/L20 mmol/L丙酮酸氧化酶8000 U/L12000U/L試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，進行冷凍乾燥，製成乾粉試劑；使 用前，加入純淨水，復溶後使用。在全自動生化分析儀上設定溫度37。C，反應時間10分鐘，起始吸光度1.8士0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測乙酸樣品與 試劑的體積比例為1/25，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約 O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化分 析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，從而測算出乙酸的 濃度大小。 實施例二本實施例的乙酸測定試劑為雙試劑，包括試劑1三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩衝液穩定劑還原型輔酶二氧化碳亞鐵細胞色素bl10Ommol/L 50 mmol/L0.25 mmol/L 20 mmol/L 5 mmol/L 20 mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩衝液 穩定劑丙酮酸氧化酶畫mmol/L 500 mmol/L 8000 U/L丙氨酸脫氫酶 12000 U/L試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，製成液體雙試劑，可以直接使用。在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反應時間10分鐘，起始吸光度1.8士0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測乙酸樣品與 試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應方向為負反應(下降反應)， 延遲時間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化分 析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，從而測算出乙酸的 濃度大小。 實施例三本實施例的乙酸測定試劑為三試劑，包括 試劑1三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩衝液穩定劑還原型輔酶二氧化碳亞鐵細胞色素bl100 mmol/L 50 mmol/L0.25 mmol/L 20 mmol/L 5 mmol/L 20 mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩衝液 穩定劑丙氨酸脫氫酶廳mmol/L 500 mmol/L 12000U/L試劑3三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩衝液 100mmol/L穩定劑500 mmol/L丙酮酸氧化酶 8000 U/L試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，製成液體三試劑，可以直接使用。測定乙酸濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37t:，反應時間IO分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm， 被測乙酸樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應方 向為負反應(下降反應)，延遲時間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左 右。加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化分 析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，從而測算出乙酸的 濃度大小。申請人經過實驗驗證,採用以上發明內容中記載的其他各種還原型色 原體組合均能達到本發明的目的，鑑於測定步驟等情況與以上實施例類 同，不另一一例舉。總之，實驗證明，採用本發明的測定方法完全可以通過一般生化分析 儀器得出所需的測定結果，並且靈敏度高、精確度好，便於推廣應用。
權利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯法技術的乙酸濃度測定方法，其方法原理如下乙酸+二氧化碳+亞鐵細胞色素b1丙酮酸氧化酶 丙酮酸+高鐵細胞色素b1+水丙酮酸+氨離子+還原型輔酶丙氨酸脫氫酶L-丙氨酸+水+輔酶將最終反應物置於紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，測算出乙酸的濃度大小測定結果。
2. —種乙酸測定試劑盒，主要成分包括: 緩衝液 穩定劑 還原型輔酶 二氧化碳 亞鐵細胞色素bl20--500 mmol/L-4000 mmol/Lo.r-0.35 mmol/L1-50 mmol/L1-50 mmol/L丙酮酸氧化f50 mmol/L1000——80000 U/L1000--80000 U/L其特徵在於試劑盒可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也 可以配製成液體試劑，直接使用。
3.根據權利要求2所述乙酸測定試劑盒，其特徵在於由緩衝液、穩定劑、還原型輔酶、二氧化碳、亞鐵細胞色素bl、氨離 子、丙酮酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶組成單劑試劑。
4. 根據權利要求2所述乙酸測定試劑盒，其特徵在於由緩衝液、穩定劑、還原型輔酶、二氧化碳、亞鐵細胞色素bl、氨離 子、丙酮酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶組成雙劑試劑；試劑l，由緩衝液、 穩定劑、還原型輔酶、二氧化碳、亞鐵細胞色素bl、氨離子組成；試劑2，由緩衝液、穩定劑、丙酮酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶組成。還原 型輔酶、二氧化碳、亞鐵細胞色素bl、氨離子、丙酮酸氧化酶、丙氨 酸脫氫酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據權利要求2所述乙酸測定試劑盒，其特徵在於由緩衝液、穩定劑、還原型輔酶、二氧化碳、亞鐵細胞色素bl、氨離 子、丙酮酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶組成多劑試劑；試劑l，由緩衝液、穩定劑、還原型輔酶、二氧化碳、亞鐵細胞色素bl、氨離子組成；試 劑2，由緩衝液、穩定劑、丙氨酸脫氫酶組成；試劑3，由緩衝液、穩定劑、丙酮酸氧化酶組成。還原型輔酶、二氧化碳、亞鐵細胞色素bl、氨離子、丙酮酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶在試劑l、試劑2或試劑3中 的位置可以不限。
6. 根據權利要求2所述乙酸測定試劑盒，其特徵在於還包括穩定劑1~4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩定劑為硫酸銨 (Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、 乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發明涉及一種利用酶比色法及酶聯法技術的乙酸測定試劑盒，同時本發明還涉及測定乙酸濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬於食品/環境檢驗測定技術領域。本發明的試劑盒主要成分包括緩衝液、還原型輔酶、二氧化碳、亞鐵細胞色素b1、氨離子、丙酮酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶及穩定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發生一系列的酶促反應，再將反應物置於紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的程度/速度，從而測算出乙酸的濃度大小。
文檔編號G01N21/31GK101324513SQ20071002337
公開日2008年12月17日 申請日期2007年6月13日 優先權日2007年6月13日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾傑生物科技有限公司