Dtpa衍生物的區域選擇性合成的製作方法
2023-07-07 17:33:26
專利名稱：Dtpa衍生物的區域選擇性合成的製作方法
1、發明領域本發明涉及製備DTPA衍生物的方法。具體地說，本發明涉及區域選擇性合成DTPA衍生物的高產率方法，其中所述的DTPA衍生物在放射免疫治療和顯象中用作雙官能團螯合劑。
2、背景技術在顯象、腫瘤診斷和免疫治療中，人們對新放射標記劑的興趣日益增加，其可減少常規試劑引起的各種缺陷。
常規試劑通常基於放射性含滷素化合物，例如基於碘同位素的放射性化合物。然而，這些試劑存在許多局限性。例如，碳-碘鍵在體內降解速率非常高，因而極大地限制了碘同位素的應用；另一個限制涉及其發射特性不夠理想，並且碘放射性核素的物理半衰期也不夠理想。因此，許多工作者努力去開發新的腫瘤診斷劑，以克服基於滷素的放射性標記試劑的缺陷。
提供更有效的顯象和腫瘤診斷劑的一個途徑是以螯合金屬放射核形式的有機金屬化合物。通過活性羰基的乙醯化、芳基重氮偶聯、溴乙醯基烷基化在蛋白質和螯合物之間形成的共價鍵或者通過硫脲鍵，以這種方式通常能夠把顯象和腫瘤診斷劑偶合到蛋白質上。
然而，已知的有機金屬配合物並沒有最佳的方式標記和治療效果。例如，除了需要選擇特定的放射同位素外，成功的腫瘤診斷和放射免疫治療還依賴於對有效螯合物的選擇，所述的螯合物必須在保持抗體完整性同時能夠容易地連接到特定的抗體以及能夠容許放射性核素的插入。
在設計有效的用於顯象和腫瘤診斷和/或免疫治療的放射金屬螯合抗體時，必須考慮到若干因素。例如，有效的放射性核素必須根據其理化生物特性來進行選擇。理想的核素必須是常規能夠得到的，易於結合到MAb並需要具有合適的物理半衰期，從而能夠選擇性診斷和/或消除靶腫瘤組織，而不影響正常組織。
選擇把放射性核酸運載到腫瘤靶的MAb必須基於下列因素靶抗原的分布、抗體與其靶的特異性和親和力。
設計有效的放射性金屬螯合的抗體需要考慮的另一個重要方面涉及用於把放射性核素結合到抗體的螯合劑(CA)的選擇。例如，有效的放射性金屬螯合的抗體必須具有體內穩定性。體內穩定性所取決的因素為螯合連接和放射性標記過程不會改變抗體特異性和生物分布。
另外，為了優化螯合劑和所選放射性核素和MAb之間的適應性，對螯合劑的選擇和合成也是重要的。具體地說，選擇和合成螯合劑應該避免放射性核素在體內不適當地釋放。這一方面也是同樣重要的，因為常規螯合劑出現的最常見問題就是它們不能連接到抗體或不能與抗體牢固地結合。結果，在這些試劑到達腫瘤細胞表面之前，大量放射性核素在體內從MAb-CA配合物分離開。游離的毒性放射性核素在正常組織中積累會損害正常組織而且不能有益於治療和/或診斷腫瘤靶目標。另一個重要方面涉及需要性，即所選擇的螯合劑能夠使MAb-CA絡合物維持由所選MAb的特異性所提供的優點。
因此，對於選定的MAb，選擇合適的螯合劑時必須考慮若干標準。例如(a)CA的加入不應改變其MAb對抗原靶的特異性和親和力；(b)其加入到MAb不應以其它方式損害該抗體(損害抗體將改變其代謝速率和組織分布模式)；(c)其應該牢固地結合放射性金屬從而在體內放射性同位素不至於過早地從MAb-CA配合物中釋放出來；(d)與MAb的連結不應改變螯合劑容留放射性核素的能力；(e)與MAb的連結方式應該儘可能具有特異性從而有助於對腫瘤靶目標的特異性檢測和治療方案設計以及有助於對腫瘤治療和檢測的相關數據進行分析；和(f)螯合劑必須能夠有助於在MAb-CA-放射性核素配合物的分解代謝後清除放射性核素。
一組合適的金屬螯合物由二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)和乙二胺四乙酸(EDTA)及其衍生物提供。業已開發出DTPA和EDTA的化學改性衍生物作為能有效螯合放射性核素的金屬配體，其容易與免疫球蛋白結合。然而，由於這些試劑對結合的放射性核素的親和力降低，因此這些試劑的效果降低到最低，結果放射化學化合物在正常組織中蓄積。
可以通過許多常規方法把EDTA和DPTA金屬配合物與蛋白質偶聯。然而，這些方法尚未達到有效顯象和腫瘤診斷所需要的高效速率。例如，常規方法存在許多缺陷，例如在放射標記前需要進行廣泛的純化，螯合所述金屬的能力不足，這是由於在與蛋白質形成共價鍵時需要應用金屬結合位點造成的。因此，已經研究了蛋白連接的新模式，並業已提出了能夠保留所有金屬結合位點的新模式。
例如，Brechbiel等在1986年第25卷《無機化學(Inorg.Chem.)》第2722-2781頁「DTPA和EDTA的(1-(對-異硫氰基苄基)衍生物合成。抗體標記和腫瘤顯象研究」一文中詳細記載了化學改性的配體，這些配體能夠快速高效地與抗體反應，並且其存留金屬的時間比顯象或治療所應用的放射性核素的半衰期要長。上文公開的內容在此引入作為參考。
Brechbiel等提出了具有能有效偶聯蛋白質的異硫氰酸根基團的化學改性螯合物。此螯合物的合成可總結為「兩步法」，其中第一步包括生成一種乙二胺或二亞乙基三胺，然後對該胺進行烷基化形成相應的聚乙酸；第二步包括把苄基取代的官能團轉變得到用於蛋白偶聯的活性部分。
然而，對於合成MX-DTPA和EDTA類似物來說，上述「兩步法」被局限為低於2％的低總產率。該方法需要對中間體進行繁雜的純化過程，包括用於陽離子和陰離子交換色譜。另外，所述合成產生了MX-DTPA的兩個位置異構體，並且再現性差。
因此，需要提供一種高產率生產DTPA衍生物的新合成方法。並要求所述新合成方法不需要通過離子交換色譜來分離中間體，從而提供一種能夠容易按比例擴大的方法。另外，還需要這樣一種製備單一位置異構體螯合物的方法，從而可以對所需要的用作有效放射標記試劑的螯合物進行區域專一性合成。
發明概述本發明涉及製備用作放射免疫治療和顯象中的螯合劑的DTPA衍生物的方法。本發明的方法能夠高產率地合成DTPA衍生物。具體地說，本發明包括區域專一性合成DTPA衍生物的方法，所述的DTPA衍生物適合螯合放射性金屬以及適合偶聯到免疫球蛋白。該方法包括把單保護的二胺和一種化合物偶聯，其中所述的化合物含有胺和能有效地把DTPA衍生物偶聯到免疫球蛋白的部分或者含有胺和能夠被轉變成有效把DTPA衍生物偶合到免疫球蛋白的部分。
一方面，本發明提供製備式(I)DTPA衍生物的方法， 該方法包括(a)把N-叔丁氧羰基-對硝基-L-苯丙氨酸(A)和單保護的二胺(B)偶合生成化合物(C)；(b)除去(C)中的胺保護基團得到TFA-鹽(D)；(c)把(D)還原形成(E)；(d)對(E)進行五烷基化得到(F)；(e)除去(F)中的胺保護基團得到三氟乙酸鹽(G)；(f)還原(G)中的硝基得到三氟乙酸鹽(H)；(g)把(H)中的氨基改變形成DTPA衍生物。
本發明的方法可以合成多種DTPA衍生物。在不限制本發明範圍條件下，通過本發明方法能有利地製備DTPA衍生物的例子包括MX-DTPA、1B3M-DTPA和CHx-DTPA。
本發明一方面提供製備DTPA衍生物的方法，其中DTPA衍生物的特性通過選擇單保護的二胺(B)來決定。選擇化合物(B)中的R1和R2獲得化學改性的DTPA衍生物。
本發明另一方面提供製備MX-DTPA的方法，包括(a)把N-叔丁氧羰基-對硝基-L-苯丙氨酸(A)和單-N-叔丁氧羰基保護的二胺(B′)偶聯形成N-(2-N-叔丁氧羰基-氨基丙基)-N-叔丁氧羰基-對硝基苯丙胺醯胺(C′)；(b)除去(C′)中的叔丁氧羰基得到N-(2-氨基丙基)-對硝基苯丙胺醯胺TFA-鹽(D′)；(c)還原(D′)得到2-甲基-6-(對硝基苄基)二亞乙基三胺三鹽酸鹽(E′)；(d)對(E′)進行五烷基化得到N，N，N′，N″，N″-五[(叔丁氧羰基)甲基]-2-[(4-硝基苯基)甲基]-6-甲基二亞乙基三胺(F′)；(e)除去(F′)中的叔丁氧羰基得到N，N，N′，N″，N″-五(羧甲基)-2-[(4-硝基苯基)甲基]-6-甲基二亞乙基三胺三氟乙酸鹽(G′)；(f)還原(G′)中的硝基得到N，N，N′，N″，N″-五(羧甲基)-2-[(4-氨基苯基)甲基]-6-甲基二亞乙基三胺三氟乙酸鹽(H′)；和(g)把(H′)中的氨基轉變形成2-(對異硫氰基苄基)-6-甲基二亞乙基三胺-N，N，N′，N″，N″-五乙酸(MX-DTPA)。一方面，本發明提供合成MX-DTPA的方法，其中步驟(a)包括應用苯並三唑-1-基氧三(二甲胺基)鏻六氟磷酸鹽(BOP)作為偶合試劑。
另一方面，本發明提供合成MX-DTPA的方法，其中步驟(a)包括應用雙(2-氧-3-噁唑烷基)次膦醯氯(BOP-Cl)作為偶合試劑。
另一方面，本發明提供合成MX-DTPA的方法，其中單叔丁氧羰基保護的二胺(B′)通過包括下列步驟的方法得到(i)用氫氧化銨處理乳腈得到α-氨基腈(2)；(ii)用鹽酸處理(2)得到胺鹽酸鹽(3)；(iii)用二叔丁基二碳酸酯(di-tert-butyl dicarbonate)保護該胺得到叔丁氧羰基保護的衍生物(4)；(iv)在兩大氣壓的氫氣下，應用阮內鎳在飽和乙醇溶液中還原該腈得到單叔丁氧羰基保護的二胺(B′)。
在另一方面，本發明提供合成MX-DTPA的方法，其中單叔丁氧羰基保護的二胺(B′)由包括下列步驟的方法得到(i)在相轉移條件下，對席夫鹼(5)進行烷基化得到單烷基化產品(6)；(ii)用1N鹽酸脫保護(6)，然後用二叔丁基二碳酸酯保護胺得到叔丁氧羰基保護的胺(4)；和(iii)用阮內鎳還原(4)得到單叔丁氧羰基保護的二胺(B′)。
另一方面，本發明提供合成MX-DTPA的方法，其中，除去(C′)中的叔丁氧羰基形成(D′)的反應是在二氯甲烷中應用三氟乙酸進行的。
另一方面，本發明提供合成MX-DTPA的方法，其中還原(D′)的步驟包括用硼烷-四氫呋喃配合物處理(D′)，然後接著用鹽酸處理得到三胺鹽酸鹽(E′)。
另一方面，本發明提供合成MX-DTPA的方法，其中對中間體(E′)進行五烷基化的反應通過應用乙腈和碳酸鉀進行的。
另一方面，本發明提供合成MX-DTPA的方法，其中對中間體(E′)的五烷基化是通過應用在二甲基甲醯胺中的溴叔丁基乙酸酯和碳酸鈉進行的。
另一方面，本發明提供合成MX-DTPA的方法，其中用矽膠色譜純化(F′)。
另一方面，本發明提供合成MX-DTPA的方法，其中對(F′)中的羧酸脫保護形成五乙酸衍生物(G′)的反應是通過應用三氟乙酸進行的。
另一方面，本發明提供合成MX-DTPA的方法，其中把(G′)中的硝基還原形成(H′)反應進行如下在水中，在兩大氣壓氫氣下，應用鈀置於碳表面進行反應。
另一方面，本發明提供合成MX-DTPA的方法，其中把(H′)轉變成DX-DTPA的步驟包括通過硫光氣把胺(H′)轉變成瓦狀異硫氰酸酯基團。該轉變可以通過若干方式進行。例如，通過(i)把硫光氣加入到含有五乙酸衍生物(H)的氯仿和水的雙相混合物中；(ii)快速攪拌該混合物2小時；(iii)減壓除去溶劑得到殘餘物；(iv)用反相矽膠純化殘餘物；和(v)用含有1％乙酸的25％乙腈水溶液洗脫。該轉變還可以應用下列物質進行二氯甲烷和三乙胺，或乙腈和碳酸氫鈉或碳酸鈉。
另一方面，本發明提供改進的MX-DTPA組合物，其中所述改進包括其基本上只含有單一的螯合物區域異構體。在本發明中，「基本上只含有」單個區域異構體意指相對於任何其它異構體，單一異構體的百分比至少為90％，更優選至少95％，最優選至少99％。
另一方面，本發明涉及這樣改進的MX-DTPA組合物在製備蛋白質或抗體螯合劑和其放射標記物中的應用。
另一方面，本發明涉及這樣改進的MX-DTPA組合物在製備放射標記螯合物中的應用。
另一方面，本發明提供製備CHx-DTPA的方法，包括(a)把N-叔丁氧羰基-對硝基-L-苯丙氨酸(A)與單保護的二胺(B″)偶聯形成化合物(C″)；(b)除去(C″)中的氨基保護基團形成TFA-鹽(D″)；(c)還原(D″)得到(E″)；(d)對(E″)進行五烷基化得到(F″)；(e)除去(F″)中的氨保護基團得到三氟乙酸鹽(G″)；(f)還原(G″)中的硝基得到三氟乙酸鹽(H″)；和(g)轉變(H″)中的氨基得到CHx-DTPA。其單保護的二胺(B″)可以用作順式或反式異構體。
附圖簡述
圖1是概述了式(I)DTPA衍生物的區域專一性合成的七步方法的反應方案。
圖2是概述了MX-DTPA的區域專一性合成的七步方法的反應方案。
圖3是合成(B′)的四步反應方案。
圖4是合成(B′)的另一種反應方案。
圖5是圖2反應方案中另一種步驟1的反應方案。
圖6是代表(B′)和4-硝基-L-苯丙氨酸甲酯在(a)甲醇中和(b)甲苯中的未成功縮合的反應方案。
圖7是烷基化(E′)形成(F′)的兩種供選擇的反應方案(a)和(b)。
圖8是一種把(H′)轉變成MX-DTPA的另一種反應方案。
圖9是概述CHx-DTPA的區域專一性合成的七步方法的反應方案。
圖10是描述通過本發明方法選擇性製備CHx-DTPA的區域異構體的方案。
圖11是合成(B″)的兩步反應方案。
優選實施方案的詳細描述除非另有說明，此處所用的所有科技術語具有本發明所屬技術領域的一般技術人員通常理解的相同意義。雖然可以應用類似於或等同於此處描述的任意方法和材料來實施或測試本發明，但此處描述優選的方法和材料。
本發明提供高產率區域專一性合成化學改性DTPA衍生物的方法，該方法不需要通過離子交換色譜分離中間體。而且，由於該方法得到螯合物的單個區域異構體，其提供用作放射標記試劑所需螯合物的區域專一性合成。
更具體地說，圖1是總結區域專一性合成式(I)DTPA衍生物的七步方法的反應方案。在此方案中，本發明提供式(I)DTPA衍生物的製備方法，其包括下列步驟(a)把N-叔丁氧羰基對硝基-L-苯丙氨酸(A)和單保護的二胺(B)偶合生成化合物(C)；(b)除去(C)中的胺保護基團得到TFA-鹽(D)；(c)把(D)還原形成(E)；(d)對(E)進行五烷基化得到(F)；(e)除去(F)中的胺保護基團得到三氟乙酸鹽(G)；(f)還原(G)中的硝基得到三氟乙酸鹽(H)；和(g)把(H)中的氨基轉變形成式(I)的DTPA衍生物。
本發明方法可以合成多種DTPA衍生物。在不限制本發明的範圍條件下，可以通過本發明方法有利地製備DTPA衍生物的例子包括MX-DTPA、1B3M-DTPA和CHx-DTPA。
本發明一方面提供製備DTPA衍生物的方法，其中DTPA衍生物的特性通過選擇單保護二胺(B)確定。在化合物(B)中選擇R1和R2得到所需要的DTPA化學改性衍生物。
圖2含有概述了根據本發明一個方面應用七個步驟進行MX-DTPA區域選擇性合成的反應方案。在此方案中，MX-DTPA的區域專一性合成包括下列步驟(a)把N-叔丁氧羰基對硝基-L-苯丙氨酸(A)和單-N-叔丁氧羰基保護的二胺(B′)偶聯形成N-(2-N-叔丁氧羰基-氨基丙基)-N-叔丁氧羰基-對硝基苯丙胺醯胺(C′)；(b)除去(C′)中的叔丁氧羰基得到N-(2-氨基丙基)-對硝基苯丙胺醯胺TFA-鹽(D′)；(c)還原(D′)得到2-甲基-6-(對硝基苄基)二亞乙基三胺三鹽酸鹽(E′)；(d)對(E′)進行五烷基化得到N，N，N′，N″，N″-五[(叔丁氧羰基)甲基]-2-[(4-硝基苯基)甲基]-6-甲基二亞乙基三胺(F′)；(e)除去(F′)中的叔丁氧羰基得到N，N，N′，N″，N″-五(羧甲基)-2-[(4-硝基苯基)甲基]-6-甲基二亞乙基三胺三氟乙酸鹽(G′)；(f)還原(G′)中的硝基得到N，N，N′，N″，N″-五(羧甲基)-2-[(4-氨基苯基)甲基]-6-甲基二亞乙基三胺三氟乙酸鹽(H′)；和(g)把(H′)中的氨基轉變形成2-(對異硫氰基苄基)-6-甲基二亞乙基三胺-N，N，N′，N″，N″-五乙酸(MX-DTPA)。
從單叔丁氧羰基保護的二胺(B′)和叔丁氧羰基-對硝基-L-苯丙氨酸(A)開始，該區域專一性合成MX-DTPA的方法的總產率約20％，並且該方法適合按比例擴大。因此，與已知方法的總產率(小於2％)相比，本發明MX-DTPA的合成方法的總產率約高一個數量級。並且，以前的合成方法必須通過繁雜的陰離子和陽離子交換色譜技術對中間體進行純化；相反，本發明方法消除了該昂貴的純化步驟，並高純度地提供目標化合物。例如，在本發明方法中，僅僅需要一個正相柱色譜和一個反相柱就可純化最終化合物。
圖3是合成單叔丁氧羰基保護的二胺(B′)的四步反應方案。合成(B′)方案如下用氫氧化銨處理市售乳腈得到α-氨基腈(2)，用鹽酸處理得到胺鹽酸鹽(3)。用二叔丁基二碳酸酯保護該胺得到叔丁氧羰基保護的衍生物(4)。在兩大氣壓氫氣下，應用阮內鎳在飽和乙醇溶液中還原該腈得到所需的單叔丁氧羰基保護的二胺(B′)。從經濟角度考慮，該反應方案非常具有吸引力，因為其可再生，並且易於按比例擴大。
還考慮了製備(B′)的許多其它條件。例如，圖4顯示了合成(B′)的反應方案，其中(B)通過下列方法製備在相轉移環境中，對席夫鹼(5)進行烷基化，中等產率地得到單烷基化產物(6)。用1N鹽酸對(6)脫保護，然後用二叔丁基二碳酸酯保護得到叔丁氧羰基保護的氨(4)，再用阮內鎳還原得到所需要的叔丁氧羰基保護的二胺(B′)。
在圖1顯示的方案中，所述合成反應應用了偶合於單-N-叔丁氧羰基保護的二胺(B′)的N-叔丁氧羰基-對硝基-L-苯丙氨酸(A)。進行該反應優選的偶合試劑為苯並三唑-1-基氧三(二甲胺基)鏻六氟磷酸鹽(BOP)。應用這些條件合成化合物(C′)時，該步驟單獨的產率為72-83％。通過酸/鹼洗滌再用己烷磨碎來對(C′)進行純化。
圖5是圖2反應方案另一種步驟1的反應方案。正如圖5所示，應用雙(2-氧-3-噁唑烷基)次膦醯氯(BOP-Cl)也導致得到所需產品(C′)；然而，在圖2中，步驟1反應的產率可以達到83％，而在圖5中步驟1的反應產率僅僅為23％。
合成(C′)的其它反應途徑是不成功的。例如，如圖6反應方案所示，為了得到(C′)的相關衍生物，把(B′)和4-硝基-L-苯丙氨酸甲酯(1)通過(a)在甲醇中攪拌或者(b)在甲苯中回流加熱來進行縮合，結果沒有成功。
已經成功合成化合物(C′)後，可以在二氯甲烷中應用三氟乙酸除去叔丁氧羰基保護基團得到二胺(D′)。在此方法中，定量得到(產率100％)固體(D′)。
正如圖2所述，用硼烷-四氫呋喃配合物還原醯胺(D′)，然後用鹽酸處理得到三胺鹽酸鹽(E′)。另外，除圖2中所描述的烷基化步驟外，也可以應用其它反應方法。例如，圖7顯示把(E′)烷基化生成(F′)的兩種反應方案(a)和(b)。應用溴叔丁基乙酸酯，在二甲基甲醯胺中以碳酸鈉作為鹼，或者以乙腈作溶劑和碳酸鉀，均可對中間體(E′)進行五烷基化。當應用後一反應條件時，更容易擴大規模，並且不需要應用按常規方法難以除去的二甲基甲醯胺。但反應進行72-96小時時，此步反應單獨產率為60％。優選應用矽膠柱色譜純化(F′)。
如圖2所示，可以通過脫保護羧酸(優選通過應用三氟乙酸進行)製備五乙酸衍生物(G′)。在兩大氣壓氫氣下，應用置於碳表面的鈀在水中進行硝基的還原。需要注意的是本發明人避免了在現有已知的合成方法中存在的缺陷。例如，本發明避免應用難以除去的氫氧化銨，因為產生硫脲副產品，需要產生異硫氰酸酯的步驟，使合成方法變複雜。
在圖2反應方案中，最後一步涉及通過硫光氣把胺轉變成瓦狀異硫氰酸酯(isothiocyanate)基團。關於這一步，本發明者研究了許多操作條件。
把(H′)轉變成MX-DTPA的優選條件描述於圖2方案最後一步。這些條件包括把硫光氣加入到含有五乙酸衍生物(H′)的氯仿和水雙相混合物中，快速攪拌2小時。減壓除去溶劑，殘餘物用反相矽膠純化，用含有1％乙酸的25％乙腈水溶液洗脫，高產率地得到目標化合物MX-DTPA。
還研究了其它操作條件。例如，圖8顯示這樣的反應方案應用二氯甲烷作溶劑，以三乙胺為鹼，把(H′)轉變成MX-DTPA。然而，除MX-DTPA外，該反應還產生難以除去的副產品鹽酸三乙胺。
把(H′)轉變成MX-DTPA還可以這樣進行應用乙腈為溶劑，以碳酸氫鈉和碳酸鈉為鹼進行反應。此反應也產生許多雜質。
本發明合成的MX-DTPA可以有效地用於需要螯合劑的許多方面。例如，經本發明方法得到的MX-DTPA提供有效的放射標記螯合劑、抗體螯合劑和蛋白質螯合劑。放射標記的MX-DTPA是許多應用方面的有效工具，例如用於閃爍照相術、放療和放射免疫分析。
在這一方面，本發明MX-DTPA合成方法具有許多優點。例如，該方法不需要陽離子和陰離子交換色譜進行繁雜的中間體純化步驟。由於不需要進行陽離子和陰離子交換色譜，本發明方法容易按比例擴大規模。
本發明方法的另一優點是高產率。如上所述，有效用於放射免疫分析的螯合劑必須容易獲得，在數量上足以滿足可能的高需要。本發明方法可以提供高達20％的MX-DTPA，比現有合成MX-DTPA的方法高一個數量級。
通過本發明方法合成的MX-DTPA螯合物具有高純度。高純度的螯合物具有許多優點，例如容易調節和製備螯合的MAbs，其中可以把不需要的副產品降低至最少量。在合成的螯合物中最大限度地減少雜質能夠較容易地調理生物學應用中的螯合物。
另一個優點是本發明方法具有區域專一性。本發明提供MX-DTPA區域專一性合成的新途徑。
不願意被任何理論所束縛，本發明可以通過應用單一異構體形式的化合物(A)達到MX-DTPA的區域專一性合成。在合成方法中一旦選擇化合物(A)的一個特定異構體作為起始原料，則在整個合成方法中能夠維持(A)中手性碳原子的構型。
應用單個區域異構體形式的MX-DTPA具有若干優點。例如，應用MX-DTPA單個異構體具有更好的閃爍照相結果，並且避免由於應用外消旋混合物導致的光學信號損失。而且，應用單個異構體能夠設計高特異性的MAb-CA配合物。在這一方面，應用單個異構體能夠使所有螯合分子以基本上相同的方式與Mab相連。
專一性合成MX-DTPA單個區域異構體的另一優點在於能夠控制螯合的放射性核素相對於MAb、最終相對於靶腫瘤的相對位置。通過應用MX-DTPA的單個異構體，有可能控制放射性核素的位置。通過應用單個異構體提供單個連結方式的優點包括能夠潛在地改進由MAb-CA配合物得到的顯象和免疫治療結果。
按照本發明合成的MX-DTPA適合螯合多种放射性核素。這些螯合物還適合與多種Mabs和蛋白質絡合。因此，可以預料當與任意適合結合MX-DTPA的放射性核素或MAb結合時，按照本發明區域專一性合成製備的MX-DTPA能夠提供等效的放射標記和治療試劑。
在一個實施方案中，MX-DTPA與2B8抗體結合形成2B8-MX-DTPA。當對淋巴瘤患者給藥時，2B8是顯示影響B細胞缺失的抗CD-20抗體。在美國專利US 5,736,137中詳細記載了製備2B8-MX-DTPA的具體方案，該文內容在此引入作為參考。
然而，本領域技術人員顯然明白按照本發明合成的DTPA螯合物可以用於放射標記其它抗CD-20抗體或者用於放射標記已經結合到DTPA或其它多價螯合劑的任何其它抗體。另外，按照本發明製備的MX-DTPA螯合物可以與其它蛋白質或肽結合，例如受體、激素、生長因子，如生長激素釋放抑制因子肽。
上面的詳細記載集中針對於MX-DTPA的合成，本發明方法對於合成其它化學改性DTPA衍生物也是同樣有用的。在這一方面，本發明方法可以有利地用於區域專一性合成許多適合螯合放射性金屬和偶合到免疫球蛋白的DTPA衍生物，該方法包括把單保護的二胺和一種化合物偶聯，其中所述的化合物含有胺和能有效地把DTPA衍生物偶聯到免疫球蛋白的部分，或者含有胺和能夠被轉變成有效把DTPA衍生物偶合到免疫球蛋白的部分。本領域技術人員容易理解本發明方法是非常有益的，因為許多單保護的二胺可以偶合到許多種含有胺和能有效地把DTPA衍生物偶聯到免疫球蛋白的部分的、或者含有胺和能夠被轉變成有效把DTPA衍生物偶合到免疫球蛋白的部分的化合物。這樣的DTPA衍生物的合成也包括在本發明範圍之內。
例如，在本發明一個方案中，1B3M-DTPA是按照類似於圖2反應方案的反應方案製備得到的。1B3M-DTPA是應用異構體(B′)製備的，其中R1(即H)和R2(即CH3)的位置可以交換。
可以按照本發明方法製備的DTPA衍生物的另一個例子是CHx-DTPA。圖9是概述CHx-DTPA的合成方法的一個反應方案。在圖9方案的步驟(a)中，單叔丁氧羰基保護的二氨基環己烷(B″)與化合物(A)縮合得到化合物(C″)。得到化合物(C″)後，再按照類似於圖2的步驟合成CHx-DTPA。
可以應用順式-或反式-二胺(B″)製備相應的CHx-DTPA異構體。圖10描述了CHx-DTPA的區域異構體，其可通過把選定的化合物A和(B″)的異構體組合製備。
單保護的二胺(B″)可以按照多種途徑製備，製備(B″)的優選途徑描述於圖11的兩步反應方案中。
實施例應用市售試劑和HPLC級或無水溶劑無需再進行純化。分別應用ICN矽膠(63-200，60A)和含有螢光指示劑的默克矽膠(60A)進行正相柱色譜和TLC。分別應用EM Science LiChroprep RP-18(40-63um)和含有螢光指示劑的Techware RPS-F反相烴浸滲矽膠進行反相柱色譜和TLC。
1-N-叔丁氧基羰基-2-甲基-乙二胺(B′)的合成
a.2-氨基丙腈鹽酸鹽(3)的合成把含有23.1g(324.99mmol)乳腈(技術等級90％純度)、7.1g(132.74mmol)氯化銨和86ml(2208.3mmol)氫氧化銨室溫下攪拌2小時。混合物用二氯甲烷(2×500ml)提取，有機相用無水硫酸鎂乾燥。過濾混合物，減壓除去溶劑得到24g黃色油(2)。用250ml無水乙醚稀釋該黃色油，用冰浴冷卻。然後加入350ml(350mmol)1N鹽酸的乙醚液。攪拌10分鐘後，過濾得到的固體，用乙醚洗滌，真空乾燥得到28.79產品，基於起始原料乳腈的純度計算，產率92.83％。
b.N-叔丁氧羰基-2-氨基丙腈(4)把104ml(746.16mmol)三乙胺加入到含有28.5g(268.79mmol)2-氨基丙腈鹽酸鹽的300ml無水二氯甲烷的混合物中。在冰浴中冷卻混合物，然後以30分鐘時間加入64.5g(295.53mmol)二叔丁基二碳酸酯的100ml無水二氯甲烷溶液。把反應混合物溫熱至室溫，攪拌48小時。通過玻璃燒結漏鬥過濾反應混合物，然後減壓縮小濾液體積。加入1L乙醚，攪拌混合物15分鐘。再次用玻璃燒結漏鬥過濾除去剩餘的三乙胺鹽酸鹽。減壓濃縮濾液，殘餘物進行矽膠柱色譜，洗脫劑為30％的乙酸乙酯/己烷，得到18.50g產品，產率為40.44％。
c.1-N-叔丁氧羰基-2-甲基-乙二胺(B′)把18.4g(108.10mmol)N-叔丁氧羰基-2-氨基丙腈和200ml用氨飽和的無水乙醇加入到500ml Parr燒瓶中。然後加入阮內鎳(10g 50％水漿液)，把燒瓶加壓至50psi氫氣，然後放氣。再次把燒瓶加壓至50psi氫氣，然後放氣。然後，把燒瓶加壓至50psi氫氣並振搖，直至不在攝取氫氣，通常過夜才能達到此效果。讓燒瓶放氣，把混合物通過硅藻土(celite)521墊。減壓濃縮濾液，定量(100％產率)得到19.2g無色油狀產品。
或者，2-氨基丙腈鹽酸鹽(3)可以從N-(二苯基亞甲基)氨基乙腈按照下列方法製備a.N-(二苯基亞甲基)-2-甲基-氨基乙腈(6)
把4.5g(19.76mmol)氯化苄基三乙基銨(BTEAC)加入到含有50g(226.98mmol)N-(二苯基亞甲基)氨基乙腈的250ml甲苯中，然後加入28.3g(707.50mmol)氫氧化鈉的50ml水溶液中。在冰浴中冷卻該反應物，以1小時時間滴入22ml(232.51mmol)硫酸甲酯。把反應物溫熱至室溫24小時。用1升二氯甲烷稀釋反應混合物，用水洗滌(2×1L)。用無水硫酸鎂乾燥有機相。過濾，除去溶劑，殘餘物進行矽膠柱色譜，用20％乙酸乙酯/己烷洗脫，得到產品46.2g，產率62.05％。
b.2-氨基丙腈鹽酸鹽(3)把含有3.0g(12.80mmol)N-二苯基亞甲基-2-甲基-氨基乙腈的30ml己烷溶液和25ml(25mmol)1N鹽酸水溶液的混合物室溫下攪拌72小時。分離水相，用己烷洗滌。減壓濃縮水相，得到1.25g產品，產率92.10％。
N-(2-N-叔丁氧羰基-氨基丙基)-N-叔丁氧羰基-對硝基苯丙氨醯胺(C′)把12.5ml(89.68mmol)三乙胺加入到含有25g(80.57mmol)N-叔丁氧羰基-對硝基-L-苯丙氨酸的300ml無水二氯甲烷溶液中，然後加入37g(83.66mmol)苯並三唑-1-基-氧三(二甲氨基)鏻六氟磷酸鹽(BOP)。室溫攪拌1小時後，加入15.1g(86.66mmol)1-N-叔丁氧羰基-2-甲基乙二胺的40ml無水二氯甲烷溶液。室溫下攪拌反應20小時。用300ml二氯甲烷稀釋反應混合物，用1N鹽酸水溶液(2×500ml)、飽和碳酸氫鈉水溶液(2×500ml)和水(1×500ml)洗滌。用無水硫酸鎂乾燥有機相。過濾，減壓除去溶劑，得到黃色固體。加入己烷(600ml)，攪拌反應混合物20分鐘。過濾固體，乾燥得到27.0g(71.83％)白色固體產品。
N-(2-氨基丙基)-對硝基苯丙氨醯胺TFA-鹽(D′)把65ml(843.77mmol)三氟乙酸加入到含有26.50g(56.80mmol)N-(2-N-叔丁氧羰基-氨基丙基)-N-叔丁氧羰基-對硝基苯丙氨醯胺的300ml二氯甲烷溶液中。室溫下攪拌反應1小時，減壓除去溶劑，然後加入500ml無水乙醚。用玻璃燒結漏鬥過濾得到的固體，然後用400ml乙醚洗滌，真空乾燥固體得到32.0g(100％)含有一些殘餘三氟乙酸和乙醚的產品。
2-甲基-6-(對硝基苄基)二亞乙基三胺三鹽酸鹽(E′)把500ml 1M硼烷-四氫呋喃配合物以30分鐘時間加入到含有35g(70.80mmol)N-(2-氨基丙基)-對硝基苯丙氨醯胺TFA鹽的500ml無水四氫呋喃溶液中。回流加熱反應16小時。冰浴冷卻反應物後，緩緩加入122ml甲醇除去過量的硼烷試劑。完全放完氣體後，減壓除去溶劑。殘餘物溶解於265ml無水乙醇中，在冰浴冷卻的同時用鹽酸(g)飽和該溶液，然後用200ml無水乙醚稀釋混合物，過濾得到的固體，真空乾燥得到19.39g產品，產率75.72％。
N，N，N′，N″，N″-五[(叔丁氧羰基)甲基]-2-[(4-硝基苯基)甲基]-6-甲基二亞乙基三胺(F′)把86.60g(626.58mmol)碳酸鉀加入到含有19.0g(52.53mmol)2-甲基-64-對硝基苄基)二亞乙基三胺三鹽酸鹽的550ml無水乙腈混合物中，然後加入42ml(284.44mmol)溴乙酸叔丁酯。室溫攪拌90小時後，用500ml水稀釋混合物，用乙酸乙酯提取(2×500ml)。有機相用無水硫酸鎂乾燥。過濾，減壓除去溶劑得到黃色油狀物。在矽膠柱上進行柱色譜，用30％乙酸乙酯/己烷洗脫，得到26.37g產品，產率60.99％。
N，N，N′，N″，N″-五(羧甲基)-2-[(硝基苯基)甲基]-6-甲基二亞乙基三胺三氟乙酸鹽(G′)把含有5.0g(6.08mmol)N，N，N′，N″，N″-五[(叔丁氧羰基)甲基]-2-[(4-硝基苯基)甲基]-6-甲基二亞乙基三胺在35ml三氟乙酸中的溶液室溫下攪拌48小時，減壓除去溶劑，真空乾燥所得固體，得到4.02g淺黃色固體產品，產率為74.75％。
N，N′，N′，N″，N″-五(羧甲基)-2-[(4-氨基苯基)甲基]-6-甲基二亞乙基三胺三氟乙酸鹽(H′)把3.40g(3.84mmol)N，N，N′，N″，N″-五(羧甲基)-2-[(4-硝基苯基)甲基-]-6-甲基二亞乙基三胺三氟乙酸鹽和50ml水加入到Parr燒瓶中，然後加入0.3g 5％的鈀-碳。把燒瓶加壓至30psi氫氣並放氣，進行兩次。然後把容器加壓至45psi氫氣，振搖。當氫氣攝取停止後(一般為2-4小時後)，把燒瓶放氣，經硅藻土(celite)墊過濾混合物。用20ml水洗滌該硅藻土。減壓濃縮濾液，得到3.02g產品，產率為92.03％。產品的光譜數據符合參考標準值。
2-(對-異硫氰基苄基)-6-甲基二亞乙基三胺-N，N，N′，N″N″-五乙酸(MX-DTPA)在1L裝有電磁攪拌器的園底燒瓶中，把7.0g(7.23mmol)N，N，N′，N″，N″-五(羧甲基)-2-[(4-氨基苯基)甲基]-6-甲基二亞乙基三胺三氟乙酸鹽加入到含有150ml水和300ml氯仿的混合物中，然後加入4.67(44.06mmol)碳酸鈉。所得溶液的pH值約為9.0。把0.64ml(8.39mmol)硫光氣加入到此雙相混合物中，然後室溫下攪拌溶液2小時。減壓除去溶劑得到殘餘物。把殘餘物溶解於15ml 1％乙酸所水溶液中，將其置於反相矽膠柱上，用1％乙酸洗脫，然後用含有1％乙酸的25％乙腈/水洗脫。把含有所述產品的部分合併，減壓除去溶劑，得到2.47g產品，呈淡黃色油狀固體，產率為61.60％。
已經以優選實施方案方式描述了本發明，本領域技術人員容易理解在不偏離本發明精神範圍的前提下，可以進行各種修飾、替換、刪減和改變。因此，本發明範圍應該只能由權利要求書(包括其等同描述)來限定。
權利要求
1.區域專一性合成適合螯合放射性金屬並適合偶聯於免疫球蛋白的DTPA衍生物的方法，該方法包括區域選擇性偶聯(a)單保護的二胺；和(b)含有胺和能有效地把DTPA衍生物偶合於免疫球蛋白的部分的化合物；或者含有胺和能轉變成有效把DTPA衍生物偶合於免疫球蛋白的部分的化物；因此合成基本上含純異構體的DTPA衍生物。
2.製備式(I)DTPA衍生物的方法， 該方法包括(a)把N-叔丁氧羰基-對硝基-L-苯丙氨酸(A)和單保護的二胺(B)反應形成化合物(C)；(b)除去(C)中的胺保護基團得到TFA-鹽(D)；(c)還原(D)得到(E)；(d)對(E)進行五烷基化得到(F)；(e)除去(F)中的氨保護基團得到三氟乙酸鹽(G)；(f)還原(G)中的硝基得到三氟乙酸鹽(H)；和(g)把(H)中的氨基轉變形成式(I)的DTPA衍生物。
3.權利要求2的方法，其中式(I)化合物為MX-DTPA。
4.權利要求2的方法，其中式(I)化合物為1B3M-DTPA。
5.權利要求2的方法，其中式(I)化合物為CHx-DTPA。
6.權利要求2的方法，其中DTPA衍生物的特性通過選擇二胺(B)控制。
7.製備MX-DTPA的方法，包括(a)把N-叔丁氧羰基對硝基-L-苯丙氨酸(A)和單-N-叔丁氧羰基保護的二胺(B′)偶聯形成N-(2-N-叔丁氧羰基-氨基丙基)-N-叔丁氧羰基-對硝基苯丙胺醯胺(C′)；(b)除去(C′)中的叔丁氧羰基得到N-(2-氨基丙基)-對硝基苯丙胺醯胺三氟乙酸鹽(D′)；(c)還原(D′)得到2-甲基-6-(對硝基苄基)二亞乙基三胺三鹽酸鹽(E′)；(d)對(E′)進行五烷基化得到N，N，N′，N″，N″-五[(叔丁氧羰基)甲基]-2-[(4-硝基苯基)甲基]-6-甲基二亞乙基三胺(F′)；(e)除去(F′)中的叔丁氧羰基得到N，N，N′，N″，N″-五(羧甲基)-2-[(4-硝基苯基)甲基]-6-甲基二亞乙基三胺三氟乙酸鹽(G′)；(f)還原(G′)中的硝基得到N，N，N′，N″，N″-五(羧甲基)-2-[(4-氨基苯基)甲基]-6-甲基二亞乙基三胺三氟乙酸鹽(H′)；和(g)把(H′)中的氨基轉變形成2-(對異硫氰基苄基)-6-甲基二亞乙基三胺-N，N，N′，N″，N″-五乙酸(MX-DTPA)。
8.權利要求7的方法，其中(a)包括應用苯並三唑-1-基氧三(二甲胺基)鏻六氟磷酸鹽(BOP)作為偶合試劑。
9.權利要求7的方法，其中(a)包括應用雙(2-氧-3-噁唑烷基)次膦醯氯(BOP-Cl)作為偶合試劑。
10.權利要求7的方法，其中單叔丁氧羰基保護的二胺(B′)由包括下列步驟的方法得到(i)用氫氧化銨處理乳腈得到α-氨基腈(2)；(ii)用鹽酸處理(2)得到胺鹽酸鹽(3)；(iii)用二叔丁基二碳酸酯保護該胺得到叔丁氧羰基保護的衍生物(4)；(iv)在兩大氣壓的氫氣下，應用阮內鎳在飽和乙醇溶液中還原該腈得到單叔丁氧羰基保護的二胺(B′)。
11.權利要求7的方法，其中單叔丁氧羰基保護的二胺(B′)有包括下列步驟的方法得到(i)在相轉移條件下，對席夫鹼(5)進行烷基化得到單烷基化產品(6)；(ii)用1N鹽酸脫保護(6)，然後用二叔丁基二碳酸酯保護得到叔丁氧羰基保護的胺(4)；和(iii)用阮內鎳還原(4)得到單叔丁氧羰基保護的二胺(B′)。
12.權利要求7的方法，其中應用在二氯甲烷中的三氟乙酸除去(C′)中的叔丁氧羰基得到(D′)。
13.權利要求7的方法，其中還原(D′)的步驟包括用硼烷-四氫呋喃配合物處理(D′)，接著用鹽酸處理得到三胺鹽酸鹽(E′)。
14.權利要求7的方法，其中應用乙腈和碳酸鉀進行中間體(E′)的五烷基化。
15.權利要求7的方法，其中應用在二甲基甲醯胺中的溴叔丁基乙酸酯和碳酸鈉進行中間體(E′)的五烷基化。
16.權利要求7的方法，其中應用矽膠柱色譜純化(F′)。
17.權利要求7的方法，其中應用三氟乙酸脫保護(F′)的羧酸得到五乙酸衍生物(G′)。
18.權利要求7的方法，其中在兩大氣壓氫氣下，在水中用鈀/碳還原(G′)中的硝基得到(H′)。
19.權利要求7的方法，其中把(H′)轉變成MX-DTPA的步驟包括通過硫光氣把胺(H′)轉變成瓦狀異硫氰酸酯基團。
20.權利要求14的方法，其中把(H′)轉變成MX-DTPA的步驟包括(i)把硫光氣加入到含有五乙酸衍生物(H′)的氯仿和水的雙相混合物中；(ii)快速攪拌該混合物2小時；(iii)減壓除去溶劑得到殘餘物；(iv)用反相矽膠純化殘餘物；和(v)用含有1％乙酸的25％乙腈水溶液洗脫。
21.權利要求19的方法，其中應用二氯甲烷和三乙胺把(H′)轉變成MX-DTPA。
22.權利要求19的方法，其中應用乙腈和碳酸氫鈉或碳酸鈉把(H′)轉變成DX-DTPA。
23.按照權利要求7所述方法製備的MX-DTPA組合物。
24.應用MX-DTPA以產生抗體螯合劑的改進方法，其中的改進包括應用按照權利要求7製備的MX-DTPA。
25.基本上含純淨異構體的MX-DTPA組合物。
26.應用權利要求25的MX-DTPA組合物產生放射標記的MX-DTPA的方法。
27.製備CHx-DTPA的方法，包括(a)把N-叔丁氧羰基-對硝基-L-苯丙氨酸(A)與單保護的二胺(B″)偶聯形成化合物(C″)；(b)除去(C″)中的氨基保護基團形成TFA-鹽(D″)；(c)還原(D″)得到(E″)；(d)對(E″)進行五烷基化得到(F″)；(e)除去(F″)中的氨保護基團得到三氟乙酸鹽(G″)；(f)還原(G″)中的硝基得到三氟乙酸鹽(H″)；和(g)轉變(H″)中的氨基得到CHx-DTPA。
28.權利要求27的方法，其中單保護的二胺(B″)為順式。
29.權利要求27的方法，其中單保護的二胺(B″)為反式。
全文摘要
本發明提供高產率區域專一性合成DTPA衍生物的方法，該方法不需要應用離子交換色譜分離中間體。而且，該方法得到單一的螯合物區域異構體，其對用作放射標記試劑所需的螯合物提供區域專一性合成。
文檔編號C07C331/28GK1548419SQ20041003125
公開日2004年11月24日 申請日期2000年3月2日 優先權日1999年3月3日
發明者P·秦, A·吉爾科斯, M·J·拉巴勒, S·魯爾, T·萊斯坎普, P 秦, 撲, 拉巴勒, 箍財 申請人:Idec藥物公司