拜氏梭菌及其以木糖渣為原料發酵製備生物丁醇的方法
2023-07-07 11:47:36
專利名稱：拜氏梭菌及其以木糖渣為原料發酵製備生物丁醇的方法
技術領域：
本發明屬於生物發酵技術領域，具體涉及高產丁醇的拜氏梭菌Clostridiumbei jerinckii Y_3及ー種利用エ業廢棄物木糖洛經氫氧化韓脫毒預處理、厭氧酶解及梭菌發酵生產生物丁醇的方法。
背景技術：
丁醇作為重要的有機化工原料，在醫藥エ業、塑料エ業、有機エ業、印染等方面具有廣泛用途。除可用作溶劑外，丁醇還是一種極具潛力的大宗動カ燃料，其燃燒值和汽油相當，是汽車用油的替代品。丁醇的生產エ藝主要有化學合成法和微生物發酵法兩種。隨著石油資源的日益枯竭，採用以石油為原料丙烯羰基合成法生產丁醇已舉步維艱，而且由於技術落後，裝置偏小導致產能不夠，致使中國丁醇市場長期供應不足，不能滿足國內市場的需求。生物發酵法製備丁醇有其獨到的優勢，發展生物丁醇將極大地緩解丁醇供應不足的現狀。目前，困擾生物丁醇產業發展的主要障礙有第一，發酵原料費用高，發酵用基質在丁醇發酵生產成本的70%左右；第二，由於發酵原料及產物的毒性，導致產物濃度低；第三，產物回收費用高，由於發酵產物濃度低，回收丁醇消耗大量能源。其中菌株和原料問題一直是困擾丁醇發酵的瓶頸。近年來，國內外對纖維原料發酵產丁醇的研究很多，主要圍繞菌種誘變選育，尋找合適的纖維原料及其糖液製備、發酵エ藝條件優化和溶劑提取等方面進行。Mermelstein等(Biotechnol. Bioeng. 1993,42 176-183)利用基因工程技術構建了重組菌株，丁醇產量比出發菌株提高了 37%。可見，進行菌株改良是提高丁醇產量，增強發酵競爭力的關鍵手段之一。另外由於我國人口眾多，用傳統的原料(玉米和甘蔗)發酵生產丁醇勢必會造成與人爭糧的問題，造成糧食短缺，因此開展以可再生的生物質材料為原料生物轉化生產生物丁醇是符合國情的研究方向。木糖渣是玉米棒芯經酸水解製取木糖、木糖醇後剩下的酸性固體纖維殘渣，其主要成分為纖維素、半纖維素和木質素。木糖渣中的半纖維素比例降低，纖維素比例較高，使木糖渣成為一種很有潛力的纖維素原料。而作為纖維殘渣的木糖渣目前卻被エ廠視為廢棄物，其存放不僅佔用了大量的耕地，並對周邊環境造成了嚴重汙染。因此合理地開發和利用廢棄木糖渣，不僅能控制汙染，保護農田生態環境，還可取得顯著的經濟效益。相比於其他原料如穀物、薯類、糖蜜及秸杆等而言，木糖渣作為丁醇生產的原料，具有來源穩定，收集和儲存成本低等優點。因此將其應用於液體生物丁醇的開發有具備較好的經濟價值。
發明內容
本發明的目的在於提供一株高產拜氏梭菌菌株，使其厭氧發酵丁醇產量提高，以解決生物發酵生產丁醇菌種能力問題。本發明的又一目的在於提供ー種利用該高產拜氏梭菌菌株以エ業廢棄物木糖渣、為原料製備生物丁醇的方法，以解決木糖渣製備生物丁醇過程中抑制物不利於纖維素酶酶解和該菌株厭氧發酵的難題。為實現上述目的，本發明提供的一株高產拜氏梭菌，其分類命名為拜氏梭菌Clostridium bei jerinckii Y-3,其保藏登記號為CGMCC 5805,保藏單位中國普通微生物菌種保藏管理中心。本發明提供的利用高產拜氏梭菌Y-3以木糖渣為原料發酵製備生物丁醇的方法，包括如下步驟I)利用氫氧化鈣脫毒エ藝對木糖渣的固液混合物進行預處理； 2)步驟I)預處理得到的木糖渣殘渣中加入纖維素酶進行酶解，得到含多組份糖的酶解液；
3)在酶解液中加入氮源，調節pH至6-8，製成木糖渣水解液發酵培養基；4)將拜氏梭菌Y-3接種至步驟3)製成的木糖渣水解液發酵培養基中，厭氧條件下發酵製備生物丁醇。所述的方法，其中，步驟I)的木糖渣為玉米芯酸水解後的殘渣。所述的方法，其中，步驟I)的氫氧化鈣脫毒エ藝中氫氧化鈣為O. 4-0. 6M的氫氧化鈣溶液，木糖渣的固液混合物中的料液比為8-12% w/v，用氫氧化鈣溶液調節木糖渣的固液混合物的pH至10-11，之後加入亞硫酸鈉。所述的方法，其中，步驟2)加入纖維素酶之前，先將經氫氧化鈣脫毒エ藝處理的木糖渣殘渣和pH為4-5，濃度為O. 1-0. 2M的醋酸鈉-醋酸緩衝液按固液比8-10% w/v混合，經過脫氧處理後高壓滅菌。所述的方法，其中，步驟2)所述纖維素酶為纖維素酶複合物和β -葡萄糖苷酶；酶解的pH值為4-5。所述的方法，其中，步驟3)中的木糖渣水解液發酵培養基為pH 6-8的含有碳源、氮源及無機鹽的固液培養基；其中的碳源為酶解液中的多組分糖；氮源為麩皮、玉米粉、豆柏、米糠、花生餅、牛肉膏、酵母膏、蛋白腖、硝酸鹽或銨鹽中的ー種以上混合物。所述的方法，其中，步驟4中發酵溫度為33_37°C。本發明的方法，將氫氧化鈣脫毒處理工藝應用於木糖渣的預處理，減少了纖維素酶解和梭菌厭氧發酵過程中存在的抑制物，從而提高產糖量及溶劑產量，最終減少生物丁醇的生產成本，解決了傳統生物發酵生產丁醇菌種能力和原料不足的問題，實現了エ業廢棄物向高附加值生物能源的轉變，是ー種環境友好、エ業應用前景良好的製備生物丁醇的方法。
具體實施例方式一方面，本發明要解決的技術問題是提供一株高產拜氏梭菌菌株，使其厭氧發酵丁醇產量提高，以解決生物發酵生產丁醇菌種能力問題；另ー方面，本發明要解決的技術問題是提供一種該高產拜氏梭菌菌株以エ業廢棄物木糖渣為原料製備生物丁醇的方法，以解決木糖渣製備生物丁醇過程中抑制物不利於纖維素酶酶解和該菌株厭氧發酵的難題。為了解決上述技術問題，發明採用的技術方案如下
一株高產拜氏梭菌，其分類命名為拜氏梭菌Clostridium bei jerinckii Y_3,其保藏登記號為=CGMCC 5805，保藏單位中國普通微生物菌種保藏管理中心(地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院生物研究所)，保藏日期為2012年2月24日。本發明所述的高產拜氏梭菌Clostridium beijerinckii Y_3的篩選方法,將出發菌株拜氏梭菌Clostridium beijerinckii NCIMB 8052 (購於英國國家エ業、海洋和食品菌種保藏中心)經甲基磺酸こ酯(EMS)誘變後，利用澱粉平板和2-脫氧-D-葡萄糖平板篩選得到高澱粉酶活力的菌株，再經厭氧發酵篩選得到高產丁醇、丙酮、こ醇的目標菌株。其具體誘變步驟如下a) EMS誘變將拜氏梭菌原始菌株活化培養，25mL厭氧瓶裝液量10 15mL，培養溫度33 37°C，培養時間12 16小時，得到處於對數生長期的菌液；取lmL，離心收集菌體，用50mM無菌磷酸鹽緩衝液(pH 7. O)洗滌菌體3次，之後加入含有O. 5 2% EMS的種 子培養基中，處理10 60分鐘後，離心棄上清，加入5%的硫代硫酸鈉終止反應；b)澱粉平板初篩菌株經EMS誘變後，用無菌生理鹽水洗出，稀釋成不同濃度塗布於澱粉平板培養基上，在33 37°C溫度下厭氧培養12 30小吋，滴加碘液，挑選出在該平板上透明圈較大的菌落；c) 2-脫氧-D-葡萄糖平板復篩將步驟b)篩選的菌株接種於25mL厭氧瓶裝液量10 15mL的種子培養基中，33 37°C厭氧培養10 14小時，無菌生理鹽水稀釋至適當濃度塗布於2-脫氧-D-葡萄糖平板培養基中，在33 37 °C溫度下厭氧培養12 30小時，滴加碘液，挑選出在該平板上透明圈較大的菌落；d)厭氧發酵將步驟c)篩出的菌落接入種子培養基擴大培養，培養溫度33 37°C，厭氧培養培養時間10 16小時，然後在發酵培養基中發酵，接種量5% 15% (v/V)，發酵溫度33 37°C，厭氧發酵發酵時間60 80小時；考察篩選出的菌落髮酵丁醇和總溶劑的產量。步驟a)中所述的EMS誘變方法中，優選I % EMS作為誘變劑量，20分鐘作為誘變時間。步驟b)所採用的澱粉平板培養基，碳源為澱粉和葡萄糖兩種的混合，氮源為有機或無機含氮化合物，其中無機含氮化合物為こ酸銨、氯化銨中的ー種或多種，有機含氮化合物為蛋白腖、酵母粉、牛肉膏和玉米漿的ー種或多種；無機鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽、磷酸鹽、亞鐵鹽中的ー種或多種；生長因子為對氨基苯甲酸、維生素B1、生物素和玉米漿中的一種或多種的混合，固體培養基中添加瓊脂。步驟c)所採用的2-脫氧-D-葡萄糖平板培養基，碳源為2-脫氧-D-葡萄糖和澱粉兩種的混合，氮源為有機或無機含氮化合物，其中無機含氮化合物為こ酸銨、氯化銨中的ー種或多種，有機含氮化合物為蛋白腖、酵母粉、牛肉膏和玉米漿的ー種或多種；無機鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽、磷酸鹽、亞鐵鹽中的ー種或多種；生長因子為對氨基苯甲酸、維生素B1、生物素和玉米漿中的ー種或多種的混合，固體培養基中添加瓊脂。步驟a)、c)和d)所採用的種子培養基中，碳源為葡萄糖和澱粉中的ー種或多種；氮源為有機或無機含氮化合物，其中無機含氮化合物為こ酸銨、氯化銨中的ー種或多種，有機含氮化合物為蛋白腖、酵母粉、牛肉膏和玉米漿的ー種或多種；無機鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽、磷酸鹽、亞鐵鹽中的ー種或多種；生長因子為對氨基苯甲酸、維生素B1、生物素和玉米漿中的ー種或多種的混合。步驟d)所採用的發酵培養基中，碳源為葡萄糖、澱粉、木質纖維水解液中的ー種或多種；氮源為有機或無機含氮化合物，其中無機含氮化合物為こ酸銨、氯化銨中的ー種或多種，有機含氮化合物為蛋白腖、酵母粉、牛肉膏和玉米漿的ー種或多種；無機鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽、磷酸鹽、亞鐵鹽中的ー種或多種；生長因子為對氨基苯甲酸、維生素B1、生物素和玉米漿中的ー種或多種的混合。本發明提供的利用上述高產拜氏梭菌以木糖渣為原料發酵製備生物丁醇的方法，包括如下步驟
I)利用氫氧化鈣脫毒エ藝對木糖渣的固液混合物進行預處理；2)步驟I)預處理得到的木糖渣殘渣中加入纖維素酶進行酶解，得到含多組份糖的酶解液；3)在酶解液中加入氮源，調節pH至6-8，製成木糖渣水解液發酵培養基；4)將高產拜氏梭菌接種至步驟3)製成的木糖渣水解液發酵培養基中，發酵製備生物丁醇。所述的方法，其中，步驟I)的木糖渣為玉米芯酸水解後的殘渣。所述的方法，其中，步驟I)的氫氧化鈣脫毒エ藝中氫氧化鈣為O. 4-0. 6 M的氫氧化鈣溶液，木糖渣的固液混合物中的料液比為8-12% w/v，用氫氧化鈣溶液調節木糖渣的固液混合物的pH至10-11，之後加入亞硫酸鈉。所述的方法，其中，步驟2)加入纖維素酶之前，先將經氫氧化鈣脫毒エ藝處理的木糖渣殘渣和pH為4-5，濃度為O. 1-0. 2M的醋酸鈉-醋酸緩衝液按固液比8-10% w/v混合，經過脫氧處理後高壓滅菌。所述的方法，其中，所述纖維素酶為諾維信公司生產的用於轉化木質纖維素原料的Biomass KU，其中包括纖維素酶複合物(NS 50013)和β -葡萄糖苷酶(NS 50010);酶解的pH值為4-5。所述的方法，其中，步驟3)中的木糖渣水解液發酵培養基為pH 6-8的含有碳源、氮源及無機鹽的固液培養基；其中的碳源為木糖渣酶解液中的多組分糖；氮源為麩皮、玉米粉、豆柏、米糠、花生餅、牛肉膏、酵母膏、蛋白腖、硝酸鹽或銨鹽中的ー種以上混合物。所述的方法，其中，步驟4)中的丁醇生產菌為拜氏梭菌Clostridiumbeijerinckii Y_3，發酵條件為厭氧，發酵溫度為33_37°C。本發明採用EMS誘變拜氏梭菌，利用澱粉平板和2-脫氧-D-葡萄糖平板篩選出高澱粉酶活力的菌株，該菌株能高效利用不同碳源發酵生產丁醇，葡萄糖為碳源時，在5L發酵罐中總溶劑和丁醇產量分別達到了 15. 8g/L和9. 4g/L，分別比出發菌提高了 30.6%和40. 3%。以下提供更佳實施例，同時列舉對比例對本發明的效果進行比較，以更好的理解本發明。然而本領域技術人員容易理解，實施例中所描述的物料配比、エ藝條件及其結果僅用於說明和幫助理解本發明的技術方案，而不應當也不會限制權利要求的範圍。實施例I :本實施例說明將原始菌株拜氏梭菌C. beijerinckii NCIMB 8052進行甲基磺酸こ酯(EMS)誘變的方法。原始菌株拜氏梭菌C. beijerinckii NCIMB 8052購於英國國家エ業、海洋和食品菌種保藏中心(NCMB)，進行EMS誘變的方法如下將原始菌株拜氏梭菌C. beijerinckii NCIMB 8052於33 37°C下活化培養12 18小時，得到生長旺盛、菌體粗壯的菌液；取新鮮培養的菌液lmL，離心收集菌體，用50mM無菌磷酸緩衝液(pH 7. O)洗滌菌體3次，之後加入含有O. 5 2% EMS的種子培養基中，處理10 60分鐘後，離心棄上清，加入5%的硫代硫酸鈉終止反應；通過計算存活率可知，I %EMS是最佳誘變劑量，20分鐘是最佳誘變時間。實施案例2 :本發明說明篩選優良拜氏梭菌的方法。其中，所使用的培養基配方如下(I)澱粉平板培養基可溶性澱粉5g/L，葡萄糖5g/L，酵母粉lg/L，磷酸氫ニ鉀、O. 5g/L，磷酸ニ氫鉀O. 5g/L，こ酸銨2. 2g/L，七水合硫酸鎂O. 2g/L，一水合硫酸錳O. 01g/L,七水合硫酸亞鐵O. 01g/L,氯化鈉O. 01g/L,對氨基苯甲酸O. 001g/L,維生素B1 O. 001g/L,生物素0.0001g/L，瓊脂15g/L，其餘為水，pH 6.5。(2) 2-脫氧-D-葡萄糖平板培養基可溶性澱粉5g/L，2_脫氧-D-葡萄糖5g/L，酵母粉lg/L，磷酸氫ニ鉀0. 5g/L，磷酸ニ氫鉀0. 5g/L，こ酸銨2. 2g/L，七水合硫酸鎂0. 2g/L，一水合硫酸錳0. 01g/L,七水合硫酸亞鐵0. 01g/L,氯化鈉0. 01g/L,對氨基苯甲酸0. OOlg/L，維生素B1 0.001g/L，生物素0.0001g/L，瓊脂15g/L，其餘為水，pH 6.5。(3)發酵種子培養基葡萄糖20g/L，酵母粉lg/L，磷酸氫ニ鉀0. 5g/L，磷酸ニ氫鉀0. 5g/L，こ酸銨2. 2g/L，七水合硫酸鎂0. 2g/L，一水合硫酸錳0. 01g/L,七水合硫酸亞鐵0. 01g/L，氯化鈉0. 01g/L,對氨基苯甲酸0. 001g/L,維生素B1 0. 001g/L,生物素0. OOOlg/L，其餘為水，pH 6.5。(4)發酵培養基葡萄糖60g/L，酵母粉lg/L，磷酸氫ニ鉀0. 5g/L，磷酸ニ氫鉀0. 5g/L，こ酸銨2. 2g/L，七水合硫酸鎂0. 2g/L，一水合硫酸錳0. 01g/L,七水合硫酸亞鐵
0.01g/L，氯化鈉0. 01g/L,對氨基苯甲酸0. 001g/L,維生素B1 0. 001g/L,生物素0. OOOlg/L，其餘為水，pH 6.5。篩選步驟I)澱粉平板初篩菌株經EMS誘變後，用無菌生理鹽水洗出，稀釋成不同濃度塗布於澱粉平板培養基上，在37°C溫度下厭氧培養30小時，滴加碘液，挑選出在該平板上生長、菌落較大、且透明圈明顯較大的菌落10株。2) 2-脫氧-D-匍萄糖平板復篩將初篩得到的菌株接種於25mL厭氧瓶裝液量10 15mL的種子培養基中，37°C厭氧培養14小時，無菌生理鹽水稀釋至適當濃度塗布2-脫氧-D-葡萄糖平板培養基中，在33 37°C溫度下厭氧培養30小時，滴加碘液，挑選出在該平板上透明圈明顯大於出發菌的菌落。最終菌株Y-3顯示了較高的澱粉酶活力。3)搖瓶發酵將誘變菌株Y-3和原始菌株接入種子培養基擴大培養，培養溫度37°C，IOOmL厭氧瓶裝液量50mL，培養12小吋。然後在發酵培養基中發酵，接種量為5% (v/v)，發酵溫度35°C，250mL厭氧瓶裝液量IOOmL,發酵時間96小時後檢查誘變菌株的總溶劑產量和丁醇產量如表I所示表I誘變菌株Y-3和原始菌株發酵結果比較
權利要求
1.ー株拜氏梭菌,其分類命名為拜氏梭菌Clostridium beijerinckii Y_3,其保藏登記號為=CGMCC 5805，保藏單位中國普通微生物菌種保藏管理中心。
2.權利要求I所述的拜氏梭菌在生產丁醇中的應用。
3.ー種利用拜氏梭菌Υ-3以木糖渣為原料發酵製備生物丁醇的方法，包括如下步驟 1)利用氫氧化鈣脫毒エ藝對木糖渣的固液混合物進行預處理； 2)步驟I)預處理得到的木糖渣殘渣中加入纖維素酶進行酶解，得到含多組份糖的酶解液； 3)在酶解液中加入氮源，調節pH至6-8，製成木糖渣水解液發酵培養基； 4)將拜氏梭菌Y-3接種至步驟3)製成的木糖渣水解液發酵培養基中，厭氧條件下發酵製備生物丁醇。
4.如權利要求3所述的方法，其中，步驟I)的木糖渣為玉米芯酸水解後的殘渣。
5.如權利要求3所述的方法，其中，步驟I)的氫氧化鈣脫毒エ藝中氫氧化鈣為O. 4-0. 6M的氫氧化鈣溶液，木糖渣的固液混合物中的料液比為8-12% w/v，用氫氧化鈣溶液調節木糖渣的固液混合物的PH至10-11，之後加入亞硫酸鈉。
6.如權利要求3所述的方法，其中，步驟2)加入纖維素酶之前，先將經氫氧化鈣脫毒エ藝處理的木糖渣殘渣和pH為4-5，濃度為O. 1-0. 2M的醋酸鈉-醋酸緩衝液按固液比8-10%w/v混合，經過脫氧處理後高壓滅菌。
7.如權利要求3所述的方法，其中，步驟2)所述纖維素酶為纖維素酶複合物和β-葡萄糖苷酶；酶解的PH值為4-5。
8.如權利要求3所述的方法，其中，步驟3)中的木糖渣水解液發酵培養基為pH6-8的含有碳源、氮源及無機鹽的固液培養基；其中的碳源為酶解液中的多組分糖；氮源為麩皮、玉米粉、豆柏、米糠、花生餅、牛肉膏、酵母膏、蛋白腖、硝酸鹽或銨鹽中的ー種以上混合物。
9.如權利要求3所述的方法，其中，步驟4中發酵溫度為33-37°C。
全文摘要
一株高產丁醇的拜氏梭菌，其分類命名為拜氏梭菌Clostridium beijerinckii Y-3，其保藏登記號為CGMCC 5805。本發明利用拜氏梭菌以木糖渣為原料製備生物丁醇的方法，包括氫氧化鈣脫毒預處理、厭氧酶解、C.beijerinckii Y-3厭氧發酵培養基的製備及發酵生產生物丁醇。本發明利用甲基磺酸乙酯(EMS)誘變，澱粉平板和2-脫氧-D-葡萄糖平板篩選得到的高產丁醇菌株，能夠利用經氫氧化鈣脫毒工藝處理後的木糖渣為原料發酵生產丁醇，解決了傳統生物發酵生產丁醇菌種能力和原料不足的問題，實現了工業廢棄物向高附加值生物能源的轉變，是一種環境友好、工業應用前景廣闊的製備生物丁醇的方法。
文檔編號C12R1/145GK102719371SQ20121008940
公開日2012年10月10日 申請日期2012年3月30日 優先權日2012年3月30日
發明者劉自勇, 張婉璐, 李福利 申請人:中國科學院青島生物能源與過程研究所