用免疫測定技術鑑別和定量聚合物的方法

2023-07-24 07:55:46 4

專利名稱:用免疫測定技術鑑別和定量聚合物的方法
發明背景本發明涉及一種使用免疫測定技術鑑別和定量水溶液系統中的聚合物的方法。具體地講，單克隆抗體(Mab’s)的製備是針對於用於開始聚合過程的引發劑(或其片段)；用於在聚合過程中製備預測定聚合物的鏈轉移劑；或是一個能在隨後連接到鏈轉移劑上的功能基。本發明還涉及表達這些MAbs的新的雜交瘤(不死的細胞系)。本發明對於測定水處理應用中的聚合物濃度特別有用。
水溶性聚合物被用於許多水溶液系統，例如作為礦物分散劑；作為鍋爐用水、冷凝塔、反滲透應用、糖精製、紙生產、地熱過程、和油井的水處理添加劑；作為去汙添加劑，起助洗劑、抗薄膜劑、分散劑、分離劑、包鞘抑制劑的作用。在這些類型的應用中，多聚物與礦物質或其它物質形成配合物使它們從水中消除，以防止在水處理應用中產生腐蝕和礦物質沉澱(水垢)。一段時間後，隨著聚合物上配合位點的飽和，聚合物開始失活或分解，從而必須加入更多的活性聚合物。特別重要的是，在水處理應用中，活性聚合物不足可導致溶解的礦物質對水處理的破壞，引起嚴重的腐蝕或水垢沉澱；而維持高於所需的活性聚合物的濃度則昂貴而浪費。因此，希望能夠方便地測定在不同時間下系統內的聚合物濃度，以確定是否需要另外加入聚合物。
關於測定水溶液系統中的聚合物的問題之一在於，傳統的檢測方法(例如比色或螢光分析)缺乏靈敏度，因為聚合物通常以極低的水平存在，從百萬分之(「ppm」)500至5以下。關於測定水溶液中的聚合物的另一個問題在於，檢測方法常常缺乏選則性，可能對水溶液系統中的非聚合物成分給出錯誤的結果。
克服這些問題的嘗試包括，針對聚合物產物的鏈節製造MAbs、然後用這些MAbs通過免疫測定技術檢測聚合物產物的存在或濃度的方法。在例如EP 540314 A1(Wetegrove等)、EP 535347 A2(Wetegrove等)、和EP 59249 A1(Weatherby等)中公開和討論了這種方法。在所有這些方法中，MAbs結合於聚合物的選定位點上，但是，由於聚合物鏈內有大量的重複單元，因而MAbs和具體的聚合物鏈之間不可能一一對應；此外，由於聚合物具有變動的鏈長度，因而結合於各聚合物上的MAbs的數量會有變化。因此，關於MAbs和聚合物濃度的比例的測定是批次依賴性的(即該比例將依據所製備的聚合物的具體批次而變化)，並且這種測量的精確度的變化可能相對較大。
PCT US94/09264(Garner等)公開了一種標記產品以用於隨後的鑑別的方法。該方法包括製備一種低分子量半抗原，將該半抗原共價結合於一個載體化合物上，然後將這種半抗原標記的化合物與產物締合，這樣，半抗原作為標記物可以在隨後用免疫測定技術測定。載體化合物可以是聚合物，這樣，可以將半抗原連接到已形成的聚合物上，或者將半抗原在聚合之前連接到單體上。如想用於該方法，半抗原標記的化合物(「標記物化合物」)應對產物是無影響的，對產物而言是惰性的，並且事先沒有締合在產物上。通常通過將標記物化合物與產物混合使其與產物締合，但它可以在包裝或標記產物時存在。
儘管Garner等公開了「以與未標記化合物固定的比例使用這種標記的化合物可以示蹤標記的化合物」，但他們的方法的性質使其不可能快速而方便地測定聚合物產物的濃度。Garner等指出，可以將半抗原締合於已形成的聚合物上，或在聚合之前締合於單體上；然而，在所有情況下，由於各個聚合物的鏈長度是不固定的，締合於個具體的聚合物鏈上的半抗原數量會隨之變動，所以，不可能絕對地測定出半抗原聚合物的比例。因此，半抗原聚合物的比例是批次依賴性的，使聚合物的濃度難於測定對於各批的標記聚合物均需作出標準濃度曲線；加入系統中的聚合物不可能與先前加入的聚合物來自同一批次，可能會影響測定的校準和精確度；系統中總的聚合物濃度可能由來自於不同批次而不是僅僅一個批次的聚合物組成，也可能影響測定的校準和精確度。
發明陳述一種鑑別和定量水溶液系統中的聚合物的方法，其中至少有一部分聚合物含有選自於鏈轉移劑、引發劑或其片段、或連接於鏈轉移劑上的基團的可檢測末端，該方法由以下步驟組成a)製備可檢測末端的單克隆或多克隆抗體；b)獲得要測定的水溶液系統的樣品，將該樣品與單克隆或多克隆抗體一起孵育；c)檢測和測量單克隆或多克隆抗體的結合程度以鑑別聚合物並測定水溶液系統中的聚合的濃度。
附圖簡述
圖1是圖解聚合物的濃度(μg/ml)對反應性(％抑制)的曲線，說明不同聚合物在TNT-Tag免疫測定中的反應性。曲線的圖標如下-◆-＝TNT-CYS-PAA；-■-＝CYS-PAA；-▲-＝PAA-PAA；-X-＝Acusol445N。
發明詳述本說明書中使用的下列術語具有以下定義，除非文中另有明確的指示。「致免疫抗原」或「致免疫分子」指一種物質，當將其引入到免疫系統具有功能的動物體內時，可激發免疫反應而導致免疫狀態。「抗原決定蔟」或「表位」指致免疫分子上可被特異抗體鑑別的部分。「半抗原」是一種不能在體內致免疫的低分子量分子，但它可以作為致免疫分子上的抗原決定簇的一部分；也就是說，如果事先將這些半抗原偶聯於一個致免疫抗原，就可以形成抗配合物的不同部分的抗體，包括抗某些可特異性結合於半抗原的部分的抗體。「標記」指聚合物鏈上已形成單克隆或多克隆抗體的可檢測末端，其中的可檢測末端選自鏈轉移劑、引發劑(或其片段)、或連接於鏈轉移劑上的基團；「標記的」指聚合物，用於表示所指的聚合物含有標記。除非特別說明，指定的範圍均包括端值。
在使用鏈轉移劑的自由基聚合過程中，聚合反應由鏈轉移劑中止。由此產生的自由基成為新聚合物鏈的開端。當僅有有限量的聚合分支時〔例如通常在低分子量(小於50000)聚合物中出現的情況-代表性的是anti-scalants〕，鏈轉移劑與聚合物鏈的比例大約是1∶1；因此，檢測標記的聚合物濃度的方法將導致對系統內聚合物的總濃度的直接測定。通過使用靈敏和選擇性的免疫測定技術對標記進行測定，本發明的方法提供了一種簡便、有效的檢測聚合物的方法。
在水溶液系統內使用的所有聚合物均可被標記，或者是某一特定部分的聚合物可以被標記。優選僅標記系統內的一小部分聚合物。當僅有一部分聚合物被標記時，未標記的聚合物無需與標記的聚合物相同，但是優選未標記的聚合物和標記的聚合物在系統內的性質相似，從而使標記的聚合物的排除率能夠精確地反映整個系統的排除率。
本發明的標記的聚合物可以是可與鏈轉移劑聚合的任何類型，一般是乙烯基聚合。在本申請的使用本發明的標記聚合物來測定水處理聚合物的實施方案中，優選使用多元羧酸的聚合物或共聚物，尤其是丙烯酸酯聚合物和其衍生物。特別有用的丙烯酸酯聚合物包括從下列單體製得的聚合物和共聚物，所述單體包括，每個分子含有3-5個碳原子的烯鍵不飽和的一元羧酸、每個分子含有4-8個碳原子的烯鍵不飽和的二元羧酸、以及它們的鹼金屬和銨鹽、和順式二元羧酸的酸酐。一元羧酸的例子包括但不僅限於丙烯酸、甲基丙烯酸、乙烯基乙酸、巴豆酸、和丙烯氧基丙酸。其中的丙烯酸和甲基丙烯酸為優選。適當的二元羧酸的例子包括但不僅限於馬來酸、衣康酸、甲基富馬酸、富馬酸、檸康酸、四氫化鄰苯二甲酸、四氫化鄰苯二甲酸酐、和馬來酸酐。在這些二元酸單體中，馬來酸酐為優選。
起始聚合物還可以由最高為百分之70重量比(「wt％」)的不含酸的單烯鍵不飽和單體構成，只要聚合物仍然是水溶性的。這些單體包括但不僅限於丙烯酸或甲基丙烯酸的烷基酯，例如丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丁酯、和甲基丙烯酸異丁酯；丙烯酸或甲基丙烯酸的羥烷基酯，例如丙烯酸羥乙基酯、丙烯酸羥丙基酯、甲基丙烯酸羥乙基酯、和甲基丙烯酸羥丙基酯；其它類型的丙烯酸或甲基丙烯酸酯，例如(甲)丙烯酸2-硫代乙基酯、(甲)丙烯酸3-硫代丙基酯、(甲)丙烯酸2-硫酸根合乙基酯、丙烯酸二甲氨基乙酯和甲基丙烯酸二氧磷基乙基酯；丙烯醯胺和烷基取代的丙烯醯胺，例如甲基丙烯醯胺、叔丁基丙烯醯胺、N-叔丁基丙烯醯胺、N-甲基丙烯醯胺、N，N-二甲基丙烯醯胺、和3-N，N，-二甲基氨基丙基丙烯醯胺；丙烯腈，例如甲基丙烯腈；烯丙醇；烯丙基磺酸；烯丙基膦酸；乙烯基膦酸；2-乙烯基吡啶；4-乙烯基吡啶；N-乙烯基吡咯烷酮；N-乙烯基甲醯胺；N-丙烯嗎啉；丙烯醛；乙二醇二丙烯酸酯；三羥甲基丙烷三丙烯酸酯；鄰苯二甲酸二烯丙基酯；乙酸乙烯酯；苯乙烯；乙烯基磺酸、對苯乙烯磺酸、和2-丙烯醯胺基-2-甲基丙磺酸；甲基丙烯基磺酸酯和1-丙烯氧基-2-羥丙基磺酸酯(COPS)；丙烯醯胺基乙二酸；以及上述化合物的鹽。
起始聚合物最為優選多元丙烯酸，或丙烯酸和馬來酸和馬來酸酐的共聚物。此外，起始聚合物或共聚物的數均分子量(「Mn」)優選在500-100000，更為優選1000-50000，最為優選2000-25000的範圍內。
用於控制聚合物成分的分子量的鏈轉移劑均可以用作本發明的標記物。這些鏈轉移劑包括但不僅限於硫醇、次膦酸酯(phosphinate)、膦酸酯、亞磺酸(例如苯基亞磺酸和對甲苯基亞磺酸)、和氨基硫醇。適當的次膦酸酯包括U.S.5294371(Clubley等)中所公開的分子式I(col.1)的化合物和U.S.5376731(Kerr等)中所公開的分子式III(col.4)的化合物，適當的氨基硫醇包括U.S.5298585(McCallum等)中所公開的類型。再此引入這三篇專利用於參考他們描述這些類型的鏈轉移劑和製備它們的方法的範圍。優選使用半胱氨酸(「CYS」)、氨基乙基硫醇(「AET」)、或苯基次膦酸(「PPA」)作為鏈轉移劑。
用於引發自由基加成聚合反應的然後引發劑和引發劑的片段均可以用作本發明的標記物。這些引發劑或引發劑的片段包括但不僅限於過氧酯，例如過氧苯甲酸叔丁酯和過氧苯甲酸叔戊酯；二烷基過氧化物，例如過氧化二枯基；二芳基過氧化物，例如過氧化苯甲醯、氫過氧化物，例如氫過氧化枯烯；偶氮化合物，例如2-苯基偶氮-4-甲氧基-2，4-二甲基戊腈、2，2』-偶氮二-2-甲基-N-苯基丙醯脒二鹽酸鹽、2，2』-偶氮二-2(N-(4-氯苯基)-2-甲基丙醯脒)二鹽酸鹽、2，2』-偶氮二-(2-(5-甲基-2-咪唑啉-2-基)丙烷)二鹽酸鹽、和2，2』-偶氮二(2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷)二鹽酸鹽。
當標記物是連接到鏈轉移劑上的基團時，可選則的鏈轉移劑是氨基硫醇，尤其是CYS或AET。可連接到這些鏈轉移劑上的基團是那些可以與所需基團發生特異性的反應、而不與聚合物的其它鏈節反應的基團。當鏈轉移劑含有胺的側基時，優選在它們上連接可與胺反應的基團作為標記物。優選的可與胺反應的基團包括但不僅限於1-(二甲胺氨基)-5-萘磺酸和其滷化物(「丹醯基」)；4-二甲胺基偶氮苯-4-磺酸和其滷化物(「dabsyl」)；2，4，6-三硝基苯磺酸和其鹽(「TNT」)；3-苯甲醯基喹啉-2-甲醛；3-(2-呋喃甲醯基(furfoyl))喹啉-2-甲醛；2，4-二硝基氟苯(Sanger's試劑)；和茚三酮。特別優選的基團包括丹醯基、dabsyl、和TNT。
本發明的單克隆或多克隆抗體可以通過本領域技術人員所知的技術進行製備。有許多製備多克隆抗體的技術，包括由B.A.L.Hurn和S.M.Chantler記載的技術，「試劑抗體的製備」，酶學方法，70104-142(1980)。製備MAbs的技術首先由G.Kohler和C.Milstein記載，Nature，265495(1975)。在本發明的免疫測定技術中優選使用MAbs。
為了製備抗特殊標記物的MAbs，首先在接種結合物的小鼠體內製備標記物的致免疫結合物和致免疫載體。在1到300天或更長的時間內進行多次接種。接種可以通過許多途徑中的任意一種進行，包括腹腔內、靜脈內或皮下注射，每次注射劑量為5-50微克(「μg」)結合物。結合物可以單獨注射，或與其它物質結合以增強其致免疫性。在免疫作用期結束時，收集來自脾臟的淋巴細胞，將其與骨髓瘤細胞融合形成雜交瘤。然後將這些雜交瘤分離、培養並測試，以測定哪種雜交瘤對標記物具有所需的特異性和親和性。然後，根據本領域技術人員所知的技術讓來自於這些選定的雜交瘤的MAbs在體外和體內生長。
本發明的雜交瘤包括所謂的Hybrid 1、Hybrid 2、Hybrid 3，通過瑞士或Balb/c小鼠的免疫作用獲得。通過這些雜交瘤加工的MAbs，可與PPA本身、與2-羧基丙基(苯基)膦酸(本質上，PPA加一單位的AA)、或與標記的聚合物(PPA-PAA)在低至1ppm的濃度下反應，但是對未標記的聚合物(PAA)僅有少量親和力或沒有親和力。這些MAbs適用於本發明的免疫測定測定方法中，包括直接夾層、間接夾層和競爭性ELISA測定。優選使用直接夾層ELISA。
在競爭性測定中，首先將抗原吸入到塑料載體上，然後加入游離的(未結合)抗原(通常來自於標準溶液)，隨後加入抗體，然後孵育溶液。在孵育期結束時，洗去溶液，僅留下附著於結合抗原上的抗體並對其進行檢測。剩餘抗體的濃度與樣品中的半抗原的濃度成反比。
對於非競爭性測定，使用兩個不同的抗體，每一個針對抗原上的不同表位，一個抗體將抗原結合於固體基質，第二個用於檢測抗原並測定其濃度。在直接夾層中，可檢測的標記被直接附著於第二個抗體；而在間接夾層中，使用標記的抗-免疫球蛋白測定第二個抗體本身。
由雜交瘤細胞表達並且對標記物具有所需的特異性和選擇性的MAbs(「抗-標記MAbs」)可用於本發明的免疫檢測測定方法中。一般地，根據本領域技術人員所知的技術對適當的雜交瘤系進行選擇、使用這些雜交瘤系所表達的MAbs作為具體的免疫測定中的反應物並對其進行優化。
在以下的實施例中使用如下縮寫。L＝升；mL＝毫升；μL＝微升；g＝克，μg＝微克；M＝摩爾；mM＝亳摩爾；rpm＝轉/分；nm＝納米。KLH＝鑰孔槭血藍素；BSA＝牛血清白蛋白；OVA＝卵白蛋白；AP＝鹼性磷酸酶。CFA＝完全弗氏佐劑；IFA＝「不完全」弗氏佐劑。另外，在以下的實施例中使用如下試劑。PBS13.8mMNaCl+2.7mMKCl，pH7.4。10倍PBS(10L)138mMNaCl(800g)+2.7mMKCl(20g)+4.28mMNaPO4，二鹼的(dibasic)7H2O(115g)+1.46mMKPO4(20g)，pH7.2。PT(20L)10倍PBS(2L)+5％吐溫20(200ml)+水(足量)。PCT(1L)PBS(990ml)+酪蛋白(10g)+5％吐溫20(10ml)，pH7.2，組織培養液(1L)小牛血清(10％)+L-穀氨醯胺(1％)+2-mercapthanol(6％)+Iscove’s修飾的Dulbecco’s培養液(痕量)。TMB3，3』，5，5』-四甲基聯苯胺(0.4g/L)在酸性緩衝液中的溶液。本段中所有的％均指體積。
實施例1免疫結合物的製備A.TNT-酶結合物(DNP-AP)的製備TNT-酶結合物通過將TNT衍生物(二硝基苯磺酸)以各種(w/w)比例加入到鹼性磷酸酶中進行製備。
B.PAP-PAA-蛋白結合物的製備將苯膦酸(PAA)修飾的聚合物(其中PAA用作鏈轉移劑)的丙烯酸部分用各種摩爾比的碳二亞胺激活，然後將這些激活的聚合物以各種(w/w)比例加入到載體蛋白(選於KLH，BSA，OVA或AP)中，產生適當的PPA-PAA-蛋白結合物。未反應的半抗原通過用PBS充分透析去除。為了進行比較，用類似方法製備PPA-蛋白結合物。
實施例2Mabs的製備根據如下的免疫作用方法，對於各組的5隻小鼠用3個月的時期注射一種實施例1B的免疫結合物。
在出生大約2個月後，將5隻瑞士小鼠放血(尾靜脈放血)，合併血液測定血清。大約2周後，將0.1ml抗原(免疫結合物)在0.1mlCFA的鹽水溶液中乳化的混合物注射入各小鼠的腹腔內。隨後以2周為間隔，將0.1ml抗原的鹽水溶液用0.1mlIFA乳化並注射入小鼠的腹腔內，共進行大約3個月。以1個月的間隔、以及在免疫作用期結束時取血樣，以監測抗體水平。
到免疫作用期結束時，從脾臟獲得致敏的淋巴細胞並將其與骨髓瘤細胞融合以形成雜交瘤細胞。可使用任何一種大量的骨髓瘤細胞系，但是優選的細胞係為P3×63Ag8.653。這些融合方法是本領域技術人員已知的；例如，Kearney等所記載的J.Immunol.，1231548(1979)。簡單地講，將淋巴細胞與骨髓瘤細胞在聚乙二醇的存在下結合一段時間、培養、檢測對抗原各部分的特異性。
實施例3檢測Mab特性使用以各種末端基團標記的聚合物進行競爭性測定。
TNT-CYS-聚合物(標記的聚合物)通過將半胱氨酸修飾的聚合物的氨基末端與TNBS反應進行製備。未反應的TNBS通過用Amicron微型濃縮器過濾除去。這種半胱氨酸修飾的聚合物(其中的半胱氨酸用作鏈轉移劑)由McCallum等記載，參見前。
將Immulon-2培養皿用純化的抗TNT MAb在0.1M碳酸鹽緩衝液(pH9.6)中的5μg/mL的溶液包被，每孔100μL，將培養皿在4℃下孵育過夜或在37℃下孵育1小時。孵育後，將培養皿用PT衝洗3次，旋轉180°，再用PT衝洗3次。此刻，加入125μL/孔PCT，於室溫下將培養皿在設置在120rpm的培養皿搖動器上孵育1小時。孵育後，將培養皿用PT衝洗3次，旋轉180°，再用PT衝洗3次。製備TNT-CYS-聚合物、CYS-PAA、PPA-PAA、和Acusol的不同濃度的抑制溶液，將各種抑制溶液和DNP-AP的1∶75的稀釋液同時加入孔中。然後於室溫下將培養皿在設置在120rpm的培養皿搖動器上孵育1小時。孵育後，將培養皿用PT衝洗3次，旋轉180°，再用PT衝洗3次。然後向各孔中加入100μL對硝基苯基磷酸鹽(PNPP)的硫酸二乙醇胺緩衝液的稀釋液。然後於室溫下將培養皿在設置在120rpm的培養皿搖動器上另外孵育15分鐘。最後，將培養皿在設置在405nm的螢光計上讀數。
圖1顯示該實驗的結果。圖解數據清楚地證明TNT-CYS-PAA在0.1到10μg/ml的濃度範圍下易於檢測，而相同濃度下的CYSPAA、PPA-PAA、和Acusol445N反應微小。而且，圖1的數據顯示，至少在檢測的濃度範圍內，在反應性和聚合物濃度之間存在著線性關係。
權利要求
1.一種鑑別和定量水溶液系統中的聚合物的方法，其中所述聚合物通過鏈聚合生產，且其中所述方法包括以下步驟a)獲得所述水溶液系統的樣品，其中所述系統中至少一定百分數的所述全部聚合物為可檢測聚合物，所述各種可檢測聚合物具有單一的可檢測末端，所述末端選自由鏈轉移劑、鏈引發劑、鏈引發劑片段和連接於鏈轉移劑的基團組成的組，b)將該樣品與特異性結合到所述可檢測末端的抗體一起孵育；並且c)檢測並測量所述抗體與所述系統中可檢測末端的結合程度，其中所述結合表示所述可檢測聚合物的濃度，並允許測量水溶液系統中各種聚合物的濃度，其中所述鏈轉移劑選自硫醇、次膦酸、膦酸、亞磺酸、氨基硫醇、或其鹽。
2.權利要求
1的方法，進一步包括製備適當的抗可檢測末端的單克隆或多克隆抗體的步驟。
3.權利要求
1的方法，其中的可檢測末端包括引發劑或引發劑片段，所述引發劑或引發劑片段選自過氧酯、二烷基過氧化物、二芳基過氧化物、氫過氧化物、和偶氮化合物。
4.權利要求
1的方法，其中的可檢測末端包括連接於鏈轉移劑上的可與胺反應的基團，且其中的鏈轉移劑包括氨基硫醇。
5.權利要求
4的方法，其中的可與胺反應的基團選自1-(二甲胺氨基)-5-萘磺酸和其滷化物；4-二甲胺基偶氮苯-4-磺酸和其滷化物；2，4，6-三硝基苯磺酸和其鹽；3-苯甲醯基喹啉-2-甲醛；3-(2-呋喃甲醯基)喹啉-2-甲醛；2，4-二氟硝基苯；和茚三酮。
6.權利要求
1的方法，其中使用酶連免疫吸附測定來檢測並測量單克隆或多克隆抗體的結合程度。
專利摘要
公開了一種使用免疫測定技術定量鑑別水溶液系統中的聚合物的方法，其中至少有一部分聚合物含有可檢測末端。這對水處理系統特別有用。還公開了表達可特異性識別該可檢測末端的MAbs的新的雜交瘤細胞系。
文檔編號G01N33/53GKCN1144045SQ97102272
公開日2004年3月31日 申請日期1997年1月17日
發明者L·H·凱勒, B·溫斯坦, L H 凱勒, 固 申請人:羅姆和哈斯公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan