B型肝炎治療疫苗及其製備方法
2023-07-24 00:46:46 1
專利名稱：B型肝炎治療疫苗及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種B型肝炎治療疫苗。具體而言，本發明涉及一種B型肝炎表面抗原和一蛋白載體偶聯的治療疫苗。更具體而言，本發明涉及一種含有B型肝炎表面抗原與破傷風類毒素經化學偶聯而成的結合物，再經適宜配製成為治療疫苗。本發明還涉及這種治療疫苗的製備方法。
背景技術：
B型肝炎是嚴重影響人類健康的傳染性疾病之一，全世界約有3.5億人為慢性攜帶者(Lee，W.M.等人，N Engl J Med，3371733-45，1997)。我國是B型肝炎高發流行區，約有1億人口攜帶B肝表面抗原，慢性B肝病人約2000～3000萬。慢性B肝是引起肝硬化、肝癌的最主要原因(Wright，T.L.等人，Lancet，3421340-4，1993)。目前為止，尚無有效的治療藥物和治療手段，B型肝炎成為重大的社會衛生問題。
抗病毒治療是清除B肝病毒，減少併發症，防止肝纖維化的措施之一。目前抗病毒藥物療效明確的有幹擾素和拉米夫啶，其他藥物如胸腺素、白介素-12、泛昔洛韋等也有一定的抗病毒作用。幹擾素既能抑制病毒複製，又能調節宿主免疫功能。但幹擾素的持續有效率僅為20％，且治療費用昂貴，難以推廣應用，尤其對ALT正常的病人效果較差(Hoonfnagle，J.H.等人，N Engl J Med，336347-356，1997)。拉米夫啶口服吸收好，在肝細胞內磷酸化為三磷酸拉米夫啶，通過抑制HBV-DNA逆轉錄酶和DNA多聚酶的活性而起到抗病毒作用，但拉米夫啶停藥後復燃及長期用藥後耐藥株的出現是急待解決的問題(Dienstag，J.L.等人，N Engl J Med，3331657-1661，1995)。
B型肝炎慢性化機制十分複雜，其中免疫耐受是形成慢性化的機制之一。B型肝炎慢性化為HBV抗原和感染宿主相互作用的結果，特異性免疫治療是打破免疫耐受的方法之一。治療性B肝疫苗可通過改變抗原提呈和加工途徑，激活耐受機體的免疫應答，從而打破免疫耐受，改變慢性B肝的臨床過程。研究表明B肝疫苗或B肝疫苗合用免疫調節劑可打破轉基因小鼠的免疫耐受，具有較好的治療前景(Mancini.M.等人，J Med Virol，3967-74，1993)。
目前，葛蘭素史克公司和美國Cytel等公司均已有治療性疫苗進入臨床考核階段。近年來，國內治療性B肝疫苗發展迅速，B肝表面抗原和B肝免疫球蛋白複合物製劑，已經I期臨床證明安全性好，正在進行II期臨床考核；多肽表位疫苗已批准進入I期臨床，此外作為免疫調節劑使用的60μg劑B肝疫苗也進入審評階段。
B肝抗原作為治療性B肝疫苗的主要成分，在臨床應用具有良好的前景具實用性，多年來已積累了豐富的臨床經驗，證明安全性好，價格低廉，治療方案較易接受，但療效仍無定論，可能與選擇疫苗的種類、劑量、佐劑成分以及治療對象的選擇等因素有關。研究方向應從疫苗劑量的增加、免疫調節劑的配合，給藥途徑，或與幹擾素抗病毒藥物聯合應用，特別是新型疫苗佐劑等方面深入研究。
B肝缺乏動物模型，藥效學評價困難。單用B肝疫苗不易打破免疫耐受，必須輔助以能增加B肝疫苗的細胞免疫反應免疫增強劑，而如何選擇和使用免疫增強劑是治療性B肝疫苗研究的難點。近期研究表明，早期誘導特異性的TH1類細胞反應是治療B肝的關鍵，因此研究的重點應為尋找能增加特異性細胞免疫反應的免疫增強劑或類似物(佐劑)。
免疫實踐證明，細菌莢膜多糖屬於T細胞非依賴性抗原，其免疫效果與接種對象的年齡明顯相關，嬰幼兒的免疫系統發育尚不完善，接種多糖疫苗後不能有效激活T輔助細胞和T記憶細胞，不能誘導產生免疫回憶反應，因而，免疫保護時間短暫，再次免疫接種也不能產生加強免疫效應。例如，腦膜炎球菌多糖抗原雖能誘導產生IgM和IgG抗體，但人類所產生的IgG主要是IgG2亞類，而人血清IgG2亞類抗體出現較遲，一般要到8～12歲才能上升至成人水平。這可能與分泌IgG2亞類抗體的B淋巴細胞發育遲緩有關。故此，嬰幼兒接種多糖疫苗後，產生只有短暫作用的IgM抗體為主。為提高多糖疫苗的免疫效果，主要辦法是將多糖抗原與蛋白載體結合，使多糖抗原由T細胞非依賴性抗原轉變為T細胞依賴性抗原。研究表明，多糖與蛋白載體結合後，T細胞能識別載體，刺激B細胞對多糖產生應答，並能誘導T細胞介導的免疫回憶反應使更多的B細胞產生特異性抗體。
已經發現，細菌多糖和一蛋白載體偶聯後的效果在Hib(b型流感嗜血桿菌)結合疫苗和C群腦膜炎球菌結合疫苗中得到了驗證。多糖和蛋白載體偶聯後，T細胞能識別載體，刺激B細胞對多糖產生抗體應答，並能誘導T細胞免疫記憶反應。上述結合疫苗均能產生足夠.高水平的抗莢膜IgG抗體和有免疫記憶的B細胞。目前已有4種蛋白載體用於結合疫苗，破傷風類毒素、突變無毒白喉毒素(CRM197)、白喉類毒素和B群腦膜炎球菌外膜蛋白。
破傷風梭菌在適宜培養基上生長繁殖的過程中所產生的破傷風毒素是一種由1,315個胺基酸所組成的、分子量為150,700的單純蛋白質。破傷風毒素是一種外毒素，最初是在菌體內形成單一多肽鏈，當從菌體釋放出後便形成具有輕鏈和重鏈的以雙硫鍵相連的多肽鏈。破傷風毒素經甲醛脫毒處理後轉變成類毒素，依然保留良好的破傷風抗原的免疫原性，而其毒力降低並不引起相應症狀(Gapta，R.K.et al，J.of Biol.Stand.，1985，13355～359)。
鑑於上述原因，本發明採用蛋白載體和B肝表面抗原經化學共價偶聯。該蛋白載體作為免疫增強劑誘導機體產生對B肝表面抗原的細胞免疫反應，從而達到打破B肝病人的免疫耐受，改變慢性B肝的臨床過程的目的。
目前最常用的人用疫苗佐劑仍為氫氧化鋁和磷酸鋁。而APC佐劑、T細胞佐劑，可選擇性誘導T細胞免疫，有效控制和殺傷細胞內病原體和腫瘤細胞，故為研究的重點。近年來，TH1極化佐劑的研究已成為研究熱點。一些佐劑配方包括微生物來源的FCA、MDP、MPL、細胞因子如IL-12、r-IFN、脂質體等均可刺激小鼠產生TH1應答，可望成為用於免疫治療的新型疫苗佐劑或免疫調節劑。
鑑於上述原因，本發明將B肝表面抗原與破傷風類毒素為代表的蛋白載體經化學偶聯行成的結合物，以綠膿桿菌製劑作為佐劑，再經適宜配製成為B型肝炎治療疫苗。該治療疫苗用於臨床上治療B型肝炎患者和健康人預防B型肝炎病毒感染。
發明內容
為了克服現有技術的不足之處，本發明的目的在於提供一種新的疫苗，特別是，本發明提供了一種B型肝炎表面抗原和一蛋白載體化學共價偶聯而成的B型肝炎治療疫苗。優選的是，含有以破傷風類毒素為載體的並與B型肝炎表面抗原經化學偶聯形成的共價結合物為主要成份的B型肝炎治療疫苗，用以臨床上治療B型肝炎患者和健康人預防B型肝炎病毒感染。
本發明還提供了一種製備B型肝炎治療疫苗的方法，該方法包括(A)將2.5～90微克B型肝炎表面抗原和5～60微克的蛋白載體偶聯地一偶聯物；(B)將B型肝炎表面抗原和蛋白載體的偶聯物經配製而成一種B型肝炎治療疫苗。
其中所述的蛋白載體是選自破傷風類毒素、白喉類毒素、無毒性白喉變異株CRM197毒素和B群腦膜炎球菌外膜蛋白群組的任何一種。優選的是，所述的蛋白載體是破傷風類毒素。本發明的疫苗可以用鋁佐劑和/或緩衝生理鹽水配製。
在本發明，B型肝炎表面抗原可以與作載體的破傷風類毒素經化學偶聯形成共價結合物，再將此共價結合物配製成一種新的B型肝炎治療疫苗的方法。
本發明所用B型肝炎表面抗原為商品化的基因工程B肝抗原，其來源包括酵母細胞和中國倉鼠卵巢細胞(CHO)等表達系統。B型肝炎表面抗原的製備方法見《中國生物製品製品規程》(化學工業出版社，2000年，175～183頁)。
本發明所用破傷風類毒素是指商品化破傷風類毒素，如精製破傷風類毒素。破傷風類毒素的製備方法見《中國生物製品製品規程》(化學工業出版社，2000年，213～218頁)本發明的一個實施方案中，作為載體的蛋白可以是破傷風類毒素、突變無毒白喉毒素(CRM197)、白喉類毒素和B群腦膜炎球菌外膜蛋白中的任何一個。這裡給出的破傷風類毒素僅僅是為了例示性說明本發明，如果滿足需要也可採用其它蛋白載體。
本發明採用溴化氰(CNBr)活化B型肝炎表面抗原，以虎鉑醯亞胺(SPDP)為雙功能親核間隔基，是之形成B型肝炎表面抗原虎鉑醯亞胺衍生物。進一步通過碳二亞胺(EDAC)介導的縮合作用與破傷風類毒素共價結合，獲得B型肝炎表面抗原-破傷風類毒素偶聯結合物。再經超濾濃縮，柱層析純化獲得的高分子偶聯結合物，經除菌過濾、配製、稀釋分裝成為治療疫苗。
如上所述，在B型肝炎表面抗原和破傷風類毒素形成偶聯物的過程中，可以由單個B型肝炎表面抗原經活化後可能有多個位點同時結合多個破傷風類毒素。同樣也可以由活化後的單個破傷風類毒素的多個位點同時結合多個B型肝炎表面抗原。B型肝炎表面抗原和破傷風類毒素的結合併不限定於1∶1，也就是一個B型肝炎表面抗原分子上可以偶聯上1個或者多個破傷風類毒素分子；同樣地，一個破傷風類毒素分子上可以偶聯上1個或者多個B型肝炎表面抗原分子。在B型肝炎表面抗原和破傷風類毒素的偶聯中，優選發生B型肝炎表面抗原和破傷風類毒素的一一對應的結合。但是如上所述，B型肝炎表面抗原和破傷風類毒素的各種結合只要並不影響本發明的治療疫苗所能達到的效果，那麼所有這些偶聯中的細節變化均應包括在本發明範圍之內。
本發明所述的B型肝炎表面抗原與破傷風類毒素的偶聯方法僅僅是用於說明，所以，可以採用各種等同的方法實現本發明所述的偶聯過程，因此任何用於蛋白分子偶聯的方法和工藝或者過程都有可能用於實施本發明。
在本發明的治療疫苗中，B型肝炎表面抗原每劑免疫劑量為2.5～90微克之間，蛋白載體，例如破傷風類毒素，含量在5～60微克之間，至於用量的上限，本領域的技術人員可以根據治療疫苗臨床使用的常規實踐靈活掌握。
本發明的治療疫苗中可以進一步添加綠膿桿菌製劑作為佐劑，增強治療疫苗的免疫應答水平。
在本發明的治療疫苗中可以進一步添加吸附佐劑，例如氫氧化鋁和/或磷酸鋁等鋁佐劑。使用時，可以對本發明的治療疫苗進行稀釋，合適的稀釋液的不限定的實例有緩衝生理鹽水稀釋液。
總之，目前還沒有一種新的利用B型肝炎表面抗原與一種蛋白載體經化學偶聯而成的治療疫苗。本發明通過將B型肝炎表面抗原和蛋白載體進行化學偶聯，以綠膿桿菌製劑作為佐劑，得到新型的B型肝炎治療疫苗。該治療疫苗可特異性的誘導細胞免疫和體液免疫，用於臨床上治療B型肝炎患者和健康人預防B型肝炎病毒感染。
本發明的另一重點是，採用綠膿桿菌製劑為佐劑，優選的是以綠膿桿菌MSHA菌毛株製劑。本發明首次將綠膿桿菌MSHA菌毛株製劑(PA)作為佐劑加入B型肝炎治療疫苗中。用MSHA菌毛株製備的綠膿桿菌製劑已作為治療腫瘤的藥物上市，該製品能調整人體體液免疫和細胞免疫的不平衡狀態，增加巨噬細胞和NK細胞的活性，維持T細胞的數量與比例，調節白細胞介素-2、幹擾素與抗體的協同作用(中國生物製品規程，化學工業出版社，2000年，265頁)。
本發明治療性B肝疫苗具有較高的安全性，理由如下1.B肝表面抗原B肝表面抗原作為預防性疫苗的主要成分已在世界範圍內經數億人次、近20年的大量應用，應用效果充分證明了其安全性。
2.破傷風類毒素破傷風類毒素已作為常規疫苗在全世界範圍內使用，其良好的安全和保護效果早已公知。
3.綠膿桿菌製劑作為佐劑應用的安全性綠膿桿菌製劑是中國食品藥品監督管理局批准的治療腫瘤的上市品種，其製造檢定規程已列入《中國生物製品製品規程》(2000年版)。綠膿桿菌製劑臨床應用的安全性已被證實。
4.B肝表面抗原與破傷風毒素偶聯後的安全性在整個偶聯過程中採用了透析、超濾、柱層析等綜合措施，有效地去除了化學試劑的殘餘物和小分子量物質，保證了製品的安全性。
5.B肝治療疫苗的安全驗證經異常毒性實驗證實B肝治療疫苗在動物體內有良好的安全性。
圖1B肝抗原與TT偶聯後免疫小鼠體液免疫反應，其中ED50單位為稀釋度，HbsAg+TTB肝抗原與TT偶聯，HbsAg+AL-TTB肝疫苗(含鋁佐劑)與TT混合，HbsAg+AlB肝疫苗(含鋁佐劑)，HbsAg-TTB肝抗原與TT混合。
圖2B型肝炎表面抗原偶聯TT與與PA混合組誘導體液免疫反應，其中，HBsAg+TTB肝抗原與TT偶聯，HBsAg+TT+PAB肝抗原與TT偶聯混合PA，HBsAg+AlB肝疫苗(含鋁佐劑)。
圖3B型肝炎治療疫苗誘導抗體的IGg2a/IGg1比值，其中G1B型肝炎表面抗原偶聯TT與PA混合組；G2B肝疫苗組；G3B型肝炎表面抗原偶聯TT組。
圖4治療性B肝疫苗免疫小鼠脾細胞ELISPOT檢測γ-IFN結果。
圖5治療性B肝疫苗免疫小鼠脾細胞ELISPOT檢測IL-2結果。
圖6治療性B肝疫苗不同劑量HBsAg免疫小鼠脾細胞ELISPOT檢測γ-IFN結果。
具體實施例方式
下面結合附圖和實施例描述本發明以破傷風類毒素為蛋白載體與B型肝炎表面抗原通過化學偶聯形成共價結合物，經配製成治療疫苗，並經動物試驗證明該治療疫苗具有可靠的安全性和顯著的免疫原性。
實施例1B型肝炎表面抗原(HBsAg)和精製破傷風類毒素(TT)共價偶聯物的製備取濃度為1～2mg/ml的HBsAg，加0.5～1.0mg/ml溴化氰(CNBr)活化，在23±3℃下作用0.5～1小時，維持PH8.2～10。加N-琥鉑醯亞胺-3-(2-硫代吡啶)丙酸(SPDP)2.5～4mg/ml活化物，維持PH8.2～10.0，作用10～30分鐘。於2～8℃攪拌10～20小時，透析去除小分子物質。加濃度為2～4mg/ml的等體積TT混合均勻，加入碳二亞胺(EDAC)15～25mg/ml混合物，5～15℃作用0.5～1小時，調PH5～7。偶聯原液經300KD透析膜在0.2M NaCl溶液透析12～15小時。收集透析後結合物，經Sephacryl S 400柱層析，用0.15～0.2M NaCl洗脫，收集V0峰附近高分子量結合物。除菌過濾後無菌保存於2～8℃。
圖1、B型肝炎表面抗原與破傷風類毒素經化學偶聯而成的共價結合物柱層析圖。圖中的上層峰B型肝炎表面抗原鋒，與破傷風類毒素結合後，分子量增大，以V0附近高分子量化合物為主；下層峰破傷風類毒素峰，與B型肝炎表面抗原結合後，分子量隨之增大，以V0附近高分子量化合物為主。
實施例2 B型肝炎治療疫苗配製和稀釋分裝(無佐劑)根據B型肝炎表面抗原和破傷風類毒素偶聯物中B型肝炎表面抗原含量測定結果，用緩衝生理鹽水無菌稀釋分裝，使每劑治療疫苗為；≥0.5ml分裝量、含有B型肝炎表面抗原2.5～90微克、含有破傷風類毒素5～60微克、pH 5.5～7.2、硫柳汞30～70微克。
實施例3B型肝炎治療疫苗配製和稀釋分裝(含佐劑)根據B型肝炎表面抗原和破傷風類毒素偶聯物中B型肝炎表面抗原含量測定結果，用氫氧化鋁稀釋液無菌稀釋分裝，使每劑治療疫苗為；≥0.5ml分裝量、含有B型肝炎表面抗原2.5～90微克、含有破傷風類毒素5～60微克、pH 5.5～7.2、硫柳汞30～70微克、氫氧化鋁0.35～0.70毫克。
實施例4B型肝炎治療疫苗安全性研究對B型肝炎治療疫苗的安全性進行考核，分別採用小鼠、豚鼠異常毒性試驗法，考核其安全性。
選用豚鼠、腹腔接種5mlB型肝炎治療疫苗，分別於免前、免後7天稱體重，並每日觀察接種反應。
選用SPF級Balb/C小鼠，腹腔接種0.5mlB型肝炎治療疫苗，分別於免前、免後7天稱體重，並每日觀察接種反應。
實驗結果列於表1、表2。
表1.B型肝炎治療疫苗豚鼠安全性試驗
表2.B型肝炎治療疫苗小鼠安全性試驗
異常毒性試驗表明B型肝炎治療疫苗具有可靠的安全性。
實施例5B型肝炎表面抗原偶聯TT誘導動物體液免疫的研究—ED50測定將B肝表面抗原與破傷風類毒素偶聯物，B肝表面抗原與破傷風類毒素(TT)混合物，B肝疫苗與破傷風類毒素混合物和B肝疫苗分別稀釋4、16、64、256倍後，腹腔注射BALB/c小鼠，原倍抗原為含10μg HbsAg，每組10隻小鼠。免疫後4周時，採集血清，應用RIA試劑檢測B肝表面抗體。應用Reed-Munch法計算ED50。由圖1可見B肝疫苗-TT偶聯組抗體效力最高(6.68)，顯著高於B肝疫苗與TT混合組(2.59)，B肝疫苗與TT混合組(0)和B肝疫苗組(4)(P＜0.01)。其次為B肝疫苗與TT混合組和B肝疫苗組，而B肝表面抗原與TT混合組免疫小鼠後檢測不到抗體反應。
實施例6B型肝炎表面抗原偶聯TT與綠膿桿菌製劑(PA)混合誘導體液免疫的研究將B型肝炎表面抗原偶聯TT與PA混合後，稀釋4、16、64、256倍後腹腔注射BALB/c小鼠。每組10隻，對照組為表面抗原混合PA組，氫氧化鋁佐劑疫苗組。免疫、採集血清、檢測B肝表面抗體和ED50統計方法同前。
由圖2可見B肝疫苗-TT偶聯組和B肝疫苗-TT偶聯混合PA組抗體效力顯著高於B肝疫苗組(19.0；28.9；5.0，P＜0.01)；而B肝疫苗-TT偶聯混合PA組誘導抗體反應又明顯高於B肝疫苗-TT偶聯組，提示混合PA可進一步增高B型肝炎表面抗原偶聯TT的抗體反應。
實施例7B型肝炎表面抗原偶聯TT與PA混合組誘導體液免疫抗體亞型的研究將B型肝炎表面抗原偶聯TT組及B型肝炎表面抗原偶聯TT與PA混合組，稀釋4、16、64、256倍後腹腔注射BALB/c小鼠。每組10隻，對照組為氫氧化鋁佐劑疫苗組。免疫、採集血清等方法同前，應用酶聯免疫方法分別檢測抗-HBs IgG、IGg2a和IGg1。結果見圖3。
由圖3可見B肝治療性疫苗組免疫小鼠誘導IGg2a/IGg1比例(1.1412)顯著高於B型肝炎表面抗原偶聯TT組(0.421)和B肝疫苗組(0.235)(P＜0.01)，表明B肝治療性疫苗可誘導高水平IGg2a，即可誘導較強的TH1細胞反應。
實施例8B型肝炎表面抗原偶聯破傷風類毒素(TT)與PA混合組誘導特異性細胞因子的研究將B型肝炎表面抗原偶聯TT與PA混合後，背部皮下免疫小鼠，其中HBsAg的含量均為3μg/只，分別按實驗組和對照組每組10隻小鼠，共5組。分別於第5日、10日、15日放血處死。按常規製備脾懸液並經淋巴細胞分離液分離出單個核細胞(MNC)，用完全培養基(含15％胎牛血清的RPMI-1640培養液)調整細胞濃度至2×106ml-1，，於24孔培養板上每孔加入1000μl該懸液，200μl HBsAg多肽，HBsAg的終濃度為50μg·ml-1，培養板置37℃、5％CO2條件下培養5天，收集上清。分別用ELISPOT試劑盒檢測細胞因子γ-IFN和IL-2。
由圖4，5、6可見，在小鼠免後5、10和20天時，誘導CTL效應細胞因子γ-IFN或IL-2產生的能力均以B肝治療性疫苗與PA混合組最高，其次為B肝治療性疫苗組，均顯著高於疫苗對照組。
應用含1、3和6μg HBsAg的B肝治療性疫苗與PA混合組、B肝治療性疫苗組、疫苗對照組分別免疫小鼠，在免後10天時處死，應用ELISPOT試劑盒檢測γ-IFN。結果表明隨免疫HBsAg含量增加，B肝治療性疫苗組和B肝治療性疫苗與PA混合組誘導γ-IFN細胞數明顯升高，3和6μg HBsAg的B肝治療性疫苗組及與PA混合組顯著高於1μg組(P＜0.05)；而6μgB肝治療性疫苗組及與PA混合組與3μg組間無顯著差異(P＞0.05)。
實施例9HBsAg轉基因小鼠打破免疫耐受的研究分別應用B型肝炎表面抗原偶聯TT與PA混合組、B肝治療性疫苗組、B肝疫苗對照組，免疫HBsAg轉基因小鼠，其中HbsAg含量均為3ug，免疫3次後1周時處死，檢測HBsAg、抗-HBs。
表3治療性B肝疫苗免疫轉基因小鼠後打破免疫耐受的研究
參見表3，結果表明，B型肝炎表面抗原偶聯TT組和B型肝炎表面抗原偶聯TT與PA混合組均能顯著增強打破轉基因小鼠的免疫耐受，而對照B肝疫苗組10隻小鼠免疫3次後，仍有9隻HBsAg陽性，提示B肝治療性疫苗的治療前景。
綜上從誘導體液免疫，抗體亞型；特異性CTL效應細胞因子測定、轉基因小鼠打破免疫耐受的研究等方面證明了B型肝炎表面抗原偶聯TT(HBsAg+TT)的治療作用；同時研究發現，B型肝炎表面抗原偶聯TT與PA混合組(HBsAg+TT+PA)組免疫效果更優。
權利要求
1.一種B型肝炎治療疫苗，由B型肝炎表面抗原和一蛋白載體化學共價偶聯而成。
2.根據權利要求1所述的B型肝炎治療疫苗，其特徵在於，所述的B型肝炎表面抗原為基因工程B型肝炎表面抗原。
3.根據權利要求2所述的B型肝炎治療疫苗，其特徵在於，所述的基因工程B型肝炎表面抗原來源包括酵母細胞和中國倉鼠卵巢細胞(CHO)表達系統製備的B型肝炎表面抗原。
4.根據權利要求1所述的B型肝炎治療疫苗，其特徵在於，所述的蛋白載體是選自破傷風類毒素、白喉類毒素、無毒性白喉變異株CRM197毒素和B群腦膜炎球菌外膜蛋白群組的任何一種。
5.根據權利要求1所述的B型肝炎治療疫苗，其特徵在於，所述化學偶聯由單個B型肝炎表面抗原經活化後的多個位點同時結合多個破傷風類毒素實現的。
6.根據權利要求1所述的B型肝炎治療疫苗，其特徵在於，所述的化學偶聯由單個破傷風類毒素經活化後的多個位點同時結合多個B型肝炎表面抗原實現的。
7.根據權利要求1所述的B型肝炎治療疫苗，其特徵在於，所述的B型肝炎表面抗原的含量在每毫升2.5～90微克之間，蛋白載體含量在5～60微克之間。
8.根據權利要求1-7之一所述的B型肝炎治療疫苗，其特徵在於，可以用鋁佐劑和/或緩衝生理鹽水配製。
9.根據權利要求1-7之一所述的B型肝炎治療疫苗，其特徵在於，以綠膿桿菌製劑為佐劑。
10.根據權利要求9所述的B型肝炎治療疫苗，其特徵在於，所述的綠膿桿菌製劑為綠膿桿菌MSHA菌毛株製劑。
11.根據權利要求1-7之一所述的B型肝炎治療疫苗，其特徵在於，其製劑包括脂質體、毫微顆粒(納米級顆粒)以及它們的凍乾粉形式的製劑。
12.一種製備B型肝炎治療疫苗的方法，該方法包括(A)將2.5～90微克B型肝炎表面抗原和5～60微克的蛋白載體偶聯地一偶聯物；(B)將B型肝炎表面抗原和蛋白載體的偶聯物經配製而成一種B型肝炎治療疫苗。
13.根據權利要求12所述的B型肝炎治療疫苗的方法，其特徵在於，所述的蛋白載體是選自破傷風類毒素、白喉類毒素、無毒性白喉變異株CRM197毒素和B群腦膜炎球菌外膜蛋白群組的任何一種。
14.根據權利要求13所述的B型肝炎治療疫苗的方法，其特徵在於，所述的蛋白載體是選自破傷風類毒素。
全文摘要
本發明涉及一種B型肝炎治療疫苗及其製備方法，包括將B型肝炎表面抗原和一蛋白載體進行偶聯形成結合物，該結合物中的B型肝炎表面抗原與蛋白載體發生化學共價偶聯。本發明可以採用綠膿桿菌製劑為佐劑。本發明中B型肝炎面抗原和蛋白載體偶聯後形成的結合物可誘導機體產生針對B型肝炎表面抗原較高且特異的細胞免疫和體液免疫反應，由此結合物製備的新型偶聯治療疫苗可用於臨床上治療B型肝炎患者和健康人預防B型肝炎病毒感染。
文檔編號A61K47/42GK1618466SQ200310113770
公開日2005年5月25日 申請日期2003年11月21日 優先權日2003年11月21日
發明者薛平, 張國銘 申請人:薛平, 張國銘