定量法B肝病毒前s1抗原酶聯免疫測定試劑盒及製備方法

2023-07-23 18:56:01

專利名稱：定量法B肝病毒前s1抗原酶聯免疫測定試劑盒及製備方法
技術領域：
本發明涉及免疫診斷試劑，具體涉及一種定量法B肝病毒前S1(PreS1)抗原(Ag)酶聯免疫測定試劑盒及製備方法。
背景技術：
長期以來，臨床醫生是根據「二對半」試劑盒檢驗結果判斷B肝患者的病情。但是「二對半」試劑查的是與B型肝炎病毒(HBV)相關的表面和核內抗原和抗體，不是直接查HBV。因此該方法不能確定患者有無HBV。此外，用「二對半」試劑盒檢查結果表明全世界約有3億人為B肝表面抗原(HbsAg)攜帶者，我國約有1.3億，已成為世界之最，但實際上其中的部分人既無臨床症狀，轉氨酶也不高，因此，並非所有HbsAg陽性者都攜帶HBV。況且「二對半」僅能定性不能定量。

發明內容
本發明所要解決的技術問題在於克服上述不足之處，設計「定量法HBV-PreS1 Ag(B肝病毒-前S1抗原)的酶免測定試劑盒」。
本發明提供了一種「定量法HBV-PreS1 Ag酶聯免疫測定試劑盒」。該試劑盒是由主要成份為抗體預包被反應條、酶標記抗前S1抗體、PreS1 Ag標準品及次要成份為陽性對照液1支、陰性對照液1支、20倍濃洗滌液1瓶、底物緩衝液甲1瓶、底物緩衝液乙1瓶和終止液1瓶組成。
本發明的試劑盒中所述PreS1 Ag標準品為滅活的HBV-DNA；抗體預包被反應條為48-96孔；陽性對照液為HBV-DNA和HbeAg均陽性血清；酶標記的PreS1抗體為辣根過氧化物酶；陰性對照液為正常人血清；底物緩衝液甲為H2O2；底物緩衝液乙為3，3』5.5』-四甲基聯苯胺(TMB)和終止液為4NH2SO4。
「定量法B肝病毒PreS1 Ag酶免測定試劑盒」。因為已證明PreS1Ag是HBV-DNA複製的必然標誌物，若檢測出病人PreS1 Ag陽性，說明其HBV-DNA存在。若進一步檢測出病人PreS1 Ag的含量，就是HBV-DNA含量。
定量法PreS1 Ag酶免試劑盒的方法學研究1.實驗方法1.1.定量PreS1 Ag檢測按「定量法HBV-PreS1 Ag酶聯免疫測定試劑盒」說明書進行操作如下(1)取出已包被條孔，插入支架上，用膠布固定，以防脫落。
(2)反應孔中分別加各濃度標準品每孔加0、2、10、20、30ng/ml、待檢血清、陰性對照血清及陽性質控血清各50μl，每次實驗設空白1孔，加蒸餾50μl，然後除空白孔外各孔加酶標記液50μl，置37℃中反應30分鐘。
(3)甩去反應孔內液體在草紙上拍2-3下，然後用洗滌液洗5次，每次孔中加滿洗滌液後停留30秒鐘，甩去洗滌液後都要在草紙上拍幹，以便洗滌徹底。(20倍濃洗滌液1ml+19ml蒸餾水即為工作洗滌液)(4)各孔滴加底物緩衝液甲、乙各1滴，37℃中反應10分鐘後再各孔滴加終止液1滴，置酶標儀450nm波長讀取各孔A值。
(5)以標準品濃度為橫座標，A值為縱座標繪出標準曲線，以各待測血清A值在標準曲線上查出該血清的前S1抗原濃度。(詳見定量法HBV-PreS1 Ag酶免試劑盒標準曲線)1.2.定量法測PreS1 Ag酶免試劑盒方法學鑑定定量法PreS1 Ag酶免試劑盒與二步法PreS1 Ag酶免試劑盒檢測的比較。
用中國藥品生物製品檢定所擬定的二步法PreS1 Ag酶免試劑盒，61份標準參考品來檢定二步法和「定量法PreS1 Ag酶免試劑盒」其檢定結果完全一致，結果如下檢驗項目標準規定 檢驗結果陰性參考品符合率不得出現假陽性(0/27)(+/-) 0/27陽性參考品符合率允許出現1份假陰性(1/30)(-/+) 1/30精密性CV(％)≤15 15靈敏度1# ≥1∶64 1∶5122# ≥1∶128 1∶10243# ≥1∶32 1∶256穩定性 37℃放3天後，檢定指標達到要求 合格說明「定量法測PreS1 Ag酶免試劑盒」的特異性、精密性、靈敏度和穩定性是良好的合格的。
1.3.定量法HBV-PreS1 Ag酶免試劑盒的定量標準曲線的制定。
1.4.正常人HBV-PreS1 Ag含量選369例體檢正常人(與獻血員相當)血用「定量法HBV-PreS1 Ag酶免試劑盒」測定結果如下酶標板代碼2002102314161900測量操作者預設測量樣本類型血清酶標儀測量類型(Single Wavelength)酶標儀進板方式(連續)測量主波長450nm酶標儀主波長測量(空白參考值0.000)0.0820.0860.0840.0870.0790.0830.0770.0810.0760.0760.0810.0770.0810.0870.0760.0750.0810.0770.0860.0850.0780.0860.0810.0900.0910.0800.0760.0790.0830.0870.0820.0780.0760.0930.0870.0880.0940.0740.0730.0880.0840.0890.0870.0740.0750.0830.0760.0890.0800.0850.0830.0750.0780.0800.0910.0830.0800.1200.0790.0780.0920.0790.0790.0780.0780.0910.0780.0840.0770.0780.0750.0860.0950.0870.1040.0770.0760.0790.0750.0750.1040.0860.0780.092
0.0840.0790.0850.0850.0800.0880.0870.0810.0880.0910.0790.0950.0820.0750.0720.0850.0850.0820.0760.0820.0800.0960.0790.0790.0740.0720.0720.0750.0780.0740.0720.0780.0730.0710.0710.0770.0820.0800.0760.0770.0780.0780.0770.0730.0720.0770.0820.0810.0820.0740.0710.0720.0710.0760.0750.0740.0830.0720.0690.0870.0810.0750.0710.0790.0740.0770.0740.0660.0860.1060.0900.0730.0760.0760.0740.0770.0770.0710.0760.0730.0780.0730.0760.0750.0860.0810.0790.0750.0750.0770.0780.0780.0790.0800.0800.0790.0840.0800.0760.0750.0670.0770.0780.0820.0820.0830.0720.0840.0760.0790.0790.0710.0770.0740.0770.0750.0760.0760.0760.0730.0730.0760.0680.0700.0730.0750.0760.0820.0700.0750.0750.0750.0900.0890.0730.0810.0800.0760.0720.0820.0970.0800.0740.0810.0760.0760.0700.0760.0720.0730.0730.0740.0710.0720.0740.0760.0710.0750.0760.0730.0910.0750.0790.0820.0720.0780.0830.0780.0810.0810.0740.0820.0780.0770.0750.0720.0730.0740.0790.0820.0880.0860.0780.0730.0790.0780.0830.0940.0760.0710.0820.0750.0880.0710.0790.0740.0830.0820.0710.0850.0850.0710.0790.0780.0720.0710.0710.0770.0780.0800.0730.0750.0820.0880.0770.0720.0761.1520.0670.0690.0710.0820.0810.0760.0750.0740.0710.0710.0650.0730.0700.0710.0770.0770.0700.0710.0730.0710.0710.0660.2060.0730.2970.0760.0770.0770.0920.0730.1500.0790.1310.1430.0800.0930.1220.0850.0680.0690.0830.0720.0740.1220.1580.1140.0670.0820.0720.0710.0730.0740.0750.0740.1300.0710.1370.1120.0660.0680.0710.0860.0740.0680.0720.0730.077上述體檢的正常人(與獻血員相當)血369例的A450值的均值X＝0.083694 標準偏差SD＝0.058291因此其cut off值(臨界值)為均值X+3SD＝0.258＝2.5ng/ml血即A450值大於0.258(2.5ng/ml血)為陽性。
而灰區範圍正常人A450值X-X+3SD為0.0836-0.258，遇到灰區範圍的A450值要複查。
定量HBV-PreS1 Ag酶免試劑盒的臨床應用和與定量PCR螢光試劑盒比較2000年8月至2002年2月第二軍醫大學附屬於長海醫院、上海第二醫科大學附屬新華醫院和上海市傳染病醫院使用我們研製建成的「定量法HBV-PreS1 Ag酶免試劑盒」和「HBV的PCR螢光定量法檢測試劑盒」同時檢測B肝患者陽性血清146份，以比較兩種定量之間的相關性。
1.臨床血清標本的來源各醫院臨床收集B肝患者血清標本總數為146份，其中長海醫院66份、新華醫院36份、傳染病醫院44份，共146份。另外，從長海醫院收集到體檢正常(與獻血員相當)血369份(做正常值用)2.使用定量法HBV-PreS1酶免法與HBV-PCR螢光定量法比較2.1.方法三個醫院分別使用「定量法HBVA-PreS1 Ag酶免試劑盒」(按其說明書操作)和PCR螢光定量法試劑盒(按HBV-PCR螢光檢測試劑盒說明書操作—深圳匹基生物技術開發有限公司)檢測同一血樣146份，並經統計學處理結果表明，該兩種方法檢測的結果非常顯著的相關，以表1和

圖1-3顯示如下2.2.結果三個醫院分別使用「定量法PreS1 Ag酶免試劑盒」和PCR螢光定量法試劑盒檢測同一血樣146份結果。
表1 三個醫院兩種方法比較醫院血樣數 相關係數(r)P值備註長海66 0.659 0.000 非常顯著相關新華36 0.508 0.001 非常顯著相關傳染44 0.407 0.002 非常顯著相關上海三個醫院使用「定量法HBV-PreS1 Ag酶免試劑盒」與「HBV-PCR螢光定量試劑盒」測定同一血樣的比較結果，兩種方法均非常顯著相關，均P值＜0.01。說明兩種方法具有同等的使用價值，「定量法HBV-PreS1 Ag酶免試劑盒」與「HBV-PCR螢光定量試劑盒」相媲美。
討論PreS1蛋白是HBVS區基因編碼產物，它和PreS2蛋白一起在HBV附著和侵入肝細胞的機制中起重要作用。PreS1蛋白主要存在於Dane顆粒中。已證實HBV的PreS1蛋白的P21-47肽是吸附於靶細胞受體的配體。
目前，通過血清學檢查以判斷HBV感染狀態的常用手段是檢測HBV-M，即所謂「兩對半」HbsAg-HbsAb，HbeAg-HbeAb和HbcAb，其中HbeAg和HbcAb陽性，表明HBV在肝內複製。然而，常規HBV-M檢測方法繁瑣、耗時，且結果分析比較複雜。PCR法定量測定HBV-DNA(PCR定量法)亦已在一些大醫院開展，但是儘管該方法有敏感性高等特點，亦因其操作步驟繁瑣、費時、技術要求高、消耗性試劑昂貴收費價又高，很難被普遍應用。Theilman等首先報告用western blot技術檢測了HbsAg陽性病人血清PreS1蛋白，認為該蛋白與HbeAg和HBV-DNA有良好的相關性，是HBV在體內複製的標誌。我們用重組PreS1 Ag免疫豚鼠製備多體或免疫Balb/c小鼠得抗PreS1單抗，經過(NH4)2SO4粗提，再柱層析(DE52)，獲高效價多體或單抗。用Sepharos 4B親和層析柱純化B肝患者血清中的HBV-DNA，再用抗正常人(IgG)Sepharos 4B柱得進一步純化的HBV-DNA做標準品。在國內首先建成了「定量法B肝病毒PreS1 Ag酶免試劑盒」。經方法學鑑定證明「定量法B肝病毒PreS1 Ag酶免試劑盒」的特異性、精密性、靈敏度和穩定性合格，定量是準確的。經過臨床應用結果表明，定量法HBV-PreS1 Ag檢測試劑盒在下述兩個方面具有重要價值。
首先，「定量法B肝病毒PreS1 Ag酶免試劑盒」不僅能查出HBV的感染(或載毒)，而且還能查到感染者HBV的含量，可與「HBV-PCR螢光測定試劑盒」相媲美。這對B肝患者的防治，特別療效的判定指標明確，治療能使HBV減多少可判定之。
另外，「定量法B肝病毒PreS1 Ag酶免試劑盒」也具有操作簡便、快速和經濟的特點，40分鐘出報告，廣大臨床檢驗工作者省時、省費用，而B肝患者省費用，所以很受歡迎。
本發明的另一所要解決的問題是提供了「定量法(立可讀)PreS1Ag酶免測定試劑盒」的製備方法。該方法包括下列步驟1.抗體製備1.1.製備抗原HBV-DNA重組PreS1 Ag基因片斷的21-47aa及1-199aa；1.2.製備抗體1.2.1.用上述重組抗原免疫豚鼠，得抗PreS1抗血清或免疫Balb/C小鼠得陽性鼠脾細胞與骨髓瘤細胞融合成雜交瘤細胞，篩選陽性克隆建株，得腹水；1.2.2.抗血清或腹水用(NH4)2SO4或正辛酸沉澱處理，得粗提抗PreS1抗體；1.2.3.用DE52離子交換層析法得純抗PreS1抗體；1.2.4.經高壓液相色譜(HPLC)檢定，純抗PreS1抗體呈單一峰，其純度95％以上。
2.HRP-抗前S1抗體製備辣根過氧化物酶(HRP)與純化的抗前S1抗體偶聯；3.前S1 Ag標準品的製備收集B肝患者陽性血清，過Sepharos4B親和層析柱，再過抗常人(IgG)Sepharos 4B柱後，測HBV-DNA含量。經鈷60r-線照射使HBV-DNA滅活。分裝成0、2、10、20、30、40ng/ml共5支。
4.包被抗體成為予包被反應條用抗HBS或抗PreS1豚抗；5.分裝試劑盒其餘7種成份，按試劑盒需要量分裝在小瓶或尖底離心管中；6.檢定試劑盒的特異性、靈敏度、精密度、穩定性合格；7.組裝成為成品。
本發明的試劑盒在使用時可以如下操作1.取出已包被條孔，插入支架上，用膠布固定，以防脫落。
2.反應孔中，分別加各濃度標準品。待檢血清50μl，各板設陽性對照1孔(50μl)陰性對照1孔(50μl)，空白對照1孔(加蒸餾水50μl)，然後除空白對照孔外各孔加酶標記液50μl，置37℃中反應30分鐘。
3.取出反應板甩去孔內液體後停留30秒鐘，每次甩去洗滌液後都要在草紙上拍幹，以便洗滌徹底。(20倍濃洗滌液1ml+19ml蒸餾水即為工作洗滌液)4.各孔滴加底物緩衝液甲、乙各1滴，室溫避光10-15分鐘後再每孔滴加終止液1滴，置酶標儀中450nm波長讀數。
5.結果判定以標準品濃度為橫座標，以待檢血清A值為縱座標繪出標準曲線，從各待檢血清A值就可在標準曲線上查出該血清的PreS1 Ag濃度。
本發明的試劑盒能非常專一地定量測出檢測患者血清中HBV-PreS1蛋白的含量。它具有簡便、靈敏和穩定等特點。且本試劑盒操作簡便快速，採用一步法可在40分鐘左右獲得實驗結果，比PCR檢測法省時(PCR法最快需6-8小時完成實驗)，經臨床試用PreS1蛋白定量法與PCR定量的HBV-DNA有很好的符合率，因而本試劑盒對判斷病人是否有病毒複製和定量，確定B肝感染病程預後及用藥後的療效具有十分重要的參考意義。本試劑盒與PCR法相比，PCR法需貴重的儀器設備，消耗性試劑昂貴，收費價又高，而本試劑盒整個實驗中無需貴重儀器設備，消耗性試劑便宜且收費價低廉，能適用於各級醫院及臨床測試中心，也可用於流行病學普查。定量法PreS1Ag試劑盒，具有簡便、靈敏、重複性好的優點，能檢出病人完整HBV含量，將可被普遍使用，做為HBV感染，複製和B肝病人診斷、治療和預後的一個新的標誌，與其抗PreS1抗體聯合可成為新的B肝檢測系統。
具體實施例方式
實施例1 製備定量法B肝病毒前S1蛋白酶免試劑盒的生產步驟(一)純化包被抗體(HbsAb)HbsAg免疫豚鼠得單抗或用重組PreS1 Ag免疫豚鼠得抗PreS1多抗。加等體積的飽和(NH4)2SO4沉澱，粗提後再經DE-52柱純化，收集蛋白峰，PBS透析得抗HBs或抗PreS1多抗純品。經HPLC檢定得純抗PreS1抗體，呈現單一峰。純度＞95％，效價＞10萬。
(二)酶標記抗體製備1.抗體製備基因重組的PreS1 Ag(21-47aa)及(1-119aa)免疫豚鼠得抗PreS1抗體或重組PreS1 Ag免疫Balb/c小鼠得腹水。用飽和(NH4)2SO4沉澱粗提兩次，再經DE-52柱純化，得純抗PreS1抗體或單克隆抗體。效價＞10萬，經HPLC鑑定純度在95％以上。
2.酶標記抗體製備抗PreS1抗體用過碘酸鈉法與辣根過氧化物偶聯對PBS充分透析，加等體積甘油，-20℃以下保存。效價＞2000。
3.前S1 Ag標準品的製備收集B肝患者陽性血清，過Sepharos 4B親和層析柱，再過抗正常人(IgG)Sepharos 4B柱，測HBV-DNA含量。經鈷60r-線照射使HBV-DNA滅活。分裝成0、2、10、20、30ng/ml共5支。
4.酶標記抗體濃度選定採用方陣滴定法選擇酶標記抗體的工作濃度大於1∶2000。PreS1重組抗原從10μg/ml倍增稀釋，包被酶標板，加梯度稀釋的酶標抗體測定，以確定最適稀釋度。
(三)預包被抗體板的製備1.包被Na2CO30.6gNaHCO31.58g
重蒸水 500ml加入適量Anti-S抗體，調整PH至9.5，加入微孔板各孔中，置溼盒中加蓋，4℃過夜甩幹。
2.洗滌Na2HPO4·12H2O 2.6gNaH2PO4·2H2O 0.4g20％Tween-20 2.5mlNaCL 8.2g重蒸水 100ml調整PH至7.2，1∶10稀釋後，加入微孔板各孔中，靜置5秒後甩幹，上述操作重複三次，以除去剩餘抗體。
3.封閉明膠 1.1g 微波爐加溫 注入酶標BSA 5.0g 至呈透明溶液 板各孔中0.1N PBS 20ml—→ 冷卻至室溫—→蒸餾水至100ml棄去液體放入溼盒中(加蓋) 吸水紙上拍乾重復一次，待乾燥後，——→37℃1hr—→放入有乾燥劑的塑膠袋封口，保存於4℃。
(四)陽性對照的製備HBeAg和HBV-DNA同時呈陽性的B肝患者血清，60℃放置1個小時，除菌過濾，用本藥盒測定A值＞0.3，備用，分裝。
(五)陰性對照的製備用本試劑盒測定正常人血清A值在0-0.03，加萬分之二硫柳汞，分裝備用。
(六)酶標單抗配置——————→10％小牛血清90％0.15MPBS
Anti-preS1-HRP————————→稀釋20倍，分裝。
(稀釋度1∶2000)(七)酶標單抗稀釋液BSA 0.5gNa2HPO4·12H2O 2.6gNaH2PO4·2H2O0.4gNaCL 8.2g20％Tween-20 100ml調整PH至7.2(八)底物液ANa2HPO4·12H2O 1.7g檸檬酸.H2O 0.5g3％H2O2200μl重蒸水 100ml調整PH至5.0(九)底物液BNa2HPO4·12H2O 1.7g檸檬酸.H2O 0.5g重蒸水 100ml調整PH至5.0後，加入10mlDMSO含60mgTMB的溶液25μl(十)終止液濃H2SO4 10ml重蒸水 80ml(十一)10x洗滌液Na2HPO4·12H2O 2.6gNaH2PO4·2H2O0.4g20％Tween-20 2.5ml重蒸水 100ml調整PH至7.2(十二)半成品及成品的組成上述(一)→(十一)步驟所得產品裝入小瓶及尖底離心管中，即為半成品。抽出三份經過特異性、穩定性、靈敏度及精密度檢定合格才能組裝成preS1試劑盒。組裝成盒後還需抽出三份同半成品一樣經過檢定合格才能出售。
權利要求
1.一種「定量法B肝病毒PreS1抗原酶聯免疫測定試劑盒」，其特徵在於該試劑盒是由主要成份前S1抗原標準品5支、抗體預包被反應條48-96孔、酶標記前S1抗體和次要成份陽性對照液1支、陰性對照液1支、20倍濃洗滌液1瓶、底物緩衝液甲1瓶、底物緩衝液乙1瓶及終止液(4N H2SO4)1瓶組成。
2.一種如權利要求1所述的一種「定量法B肝病毒PreS1抗原酶聯免疫測定試劑盒」的製備方法，其特徵在於該方法包括下列步驟I.抗體製備(1)製備抗原HBV-DNA重組PreS1 Ag基因片斷的21-47aa及1-199aa；(2)製備抗體用上述重組抗原免疫豚鼠，得抗PreS1抗血清或免疫Balb/C小鼠得陽性鼠脾細胞與骨髓瘤細胞融合成雜交瘤細胞，篩選陽性克隆建株，得腹水；抗血清或腹水用(NH4)2SO4或正辛酸沉澱處理，得粗提抗PreS1抗體；用DE52離子交換層析法得純抗PreS1抗體；經高壓液相色譜(HPLC)檢定，純抗PreS1抗體呈單一峰，其純度95％以上。(3)PreS1 Ag標準品的製備收集B肝患者陽性血清，過Sepharos 4B親和層析柱，再過抗正常人(IgG)Sepharos 4B柱，測HBV-DNA含量。經鈷60r-線照射使HBV-DNA滅活。分裝成0、2、10、20、30ng/ml共5支。(4)HRP-抗前S1抗體製備辣根過氧化物酶(HRP)與純化的抗前S1抗體偶聯；(5)包被抗體成為予包被反應條用抗HBs或抗PreS1豚抗；(6)分裝試劑盒其餘7種成份，按試劑盒需要量分裝在小瓶或尖底離心管中；(7)檢定試劑盒的特異性、靈敏度、精密度、穩定性合格；(8)組裝成為成品。
3.根據權利要求1所述的一種「定量法B肝病毒PreS1抗原酶聯免疫測定試劑盒」，其特徵在於其中所述的前S1抗原標準品為滅活的HBV-DNA、5支、抗體預包被反應條為48-96孔、酶標記抗體、陽性對照液為HBV-DNA和HBeAg均陽性血清、酶標記的前S1抗體為辣根過氧物酶、陰性對照液為正常人血清、濃洗滌液磷酸-Tween-20、底物緩衝液甲為H2O2、底物緩衝液乙為3，3』.5.5』-四甲基聯苯胺、終止液為4NH2SO4。
全文摘要
本發明屬免疫診斷試劑。本發明公開了一種「定量法B肝病毒前S1蛋白酶免測定試劑盒」。該試劑盒能定量檢出完整HBV，並且具有簡便、靈敏和穩定等特點，操作簡便快速，可以補充或替代常規的「兩對半」和PCR檢測法。本發明提供了製備方法。
文檔編號G01N33/576GK1512178SQ0215172
公開日2004年7月14日 申請日期2002年12月27日 優先權日2002年12月27日
發明者杜鳳鳴 申請人:杜鳳鳴