基因工程製備人毛乳頭細胞hspc016蛋白質的方法、表達載體和工程菌的製作方法

2023-07-23 21:50:36

專利名稱：基因工程製備人毛乳頭細胞hspc016蛋白質的方法、表達載體和工程菌的製作方法
技術領域：
本發明涉及利用DNA重組技術生產蛋白質或多肽藥物的領域，具體地講，本發明涉及基因工程製備人毛乳頭細胞HSPC016(hematopoietic stem/progenitor cells，HSPC)蛋白質的方法，還涉及有關的表達載體和工程菌。
背景技術：
毛囊是重要的皮膚附屬器官，是毛髮的主體。毛髮具有調節體溫、排洩代謝物、緩衝外界機械壓力等重要生理功能，對人類而言同時還有美學、裝扮、特徵辨認等社會學意義。毛囊異常生長所致的多毛或少毛不僅會影響毛髮生理功能的正常發揮，而且正在或可能將要給越來越多的患者造成心理壓力，直接影響患者的生活質量和健康。因此，了解毛囊生長的確切機制、調控原理及探討臨床診治毛囊疾病的方法與措施具有重要意義。多數學者認為毛乳頭在毛囊的形態學發生和成年毛囊的周期性生長與調控中起主導作用，毛乳頭細胞是毛囊研究的中心環節之一。HSPC016是我國復旦大學學者在人造血幹細胞中發現的新基因，本申請人首次發現了HSPC016基因作為上調表達基因在凝集性生長狀態人毛乳頭細胞差異表達cDNA文庫中的表達。對於一個新基因而言，獲取其重組蛋白，是進一步對該基因功能進行深入研究所必需的。
毛囊的明顯特性是自我更新和周期性生長。完整的毛囊生長周期包括生長期(anagen)、退行期(catagen)、休止期(telogen)。毛囊的胚胎發育和周期性生長主要依靠來源於毛囊上皮與間質毛乳頭(dermal papillae，DP)的相互作用。毛乳頭是真皮成分突入毛球內形成的特殊結構，為含血管和神經的間充質成分。毛乳頭細胞(dermalpapilla cells，DPC)是組成毛乳頭的唯一細胞，在毛囊的胚胎發生和周期性生長過程中起著十分重要的作用，一方面提供毛囊生長和分化必需的信號因子和營養支持，另一方面還決定毛囊的分化方向。因此，毛乳頭細胞是毛囊研究的中心環節之一。
毛乳頭是一個可誘導的結構，它能發送或接受信號，從而影響毛囊的發育和周期性生長。通過對小鼠/大鼠模型的研究，一些與毛囊周期性生長有關的調節分子如成纖維細胞生長因子(fibobalast growth factors，FGFs)、骨形態發生蛋白(bonemorphogenetic proteins，BMPs)、刺蝟蛋白(sonic hedgehog，Shh)、神經營養因子(neurotrophins)、血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)等已相繼被鑑定出來。組成毛囊的細胞如DPC、外根鞘細胞(out root sheath，ORS)、毛母質細胞等可分泌這些生長因子及其受體；而且就單一細胞因子而言，其產生和分泌都與毛囊周期的特定時相有關。但是，關於這些細胞因子調節毛囊胚胎發生和毛囊周期性生長的具體分子機制如通過什麼信號轉導途徑、與什麼分子作用等均不十分清楚。Inamatsu等在實驗中發現凝集生長狀態的DPC仍能保持誘導毛囊發生的能力。為了探索哪些基因在DPC凝集生長狀態下表達，篩選與DPC凝集生長相關的基因，宋志強博士等應用抑制性消減雜交技術成功地建立了凝集性生長的人毛乳頭細胞差異表達基因cDNA文庫，並從凝集生長狀態的人毛乳頭細胞中篩選出一批上調表達和下調表達基因。HSPC016即是通過上述方法篩選得到的與DPC凝集生長相關的基因，它被首次從CD34+造血幹細胞/祖細胞中分離鑑定，HSPC016基因位於第三對染色體p21.31位點上，包含4個外顯子，全長mRNA為3943bp(GENEBANK NM_015933)，HSPC016共有65個胺基酸，成熟蛋白分子量約7.2kDa，但功能不清。鑑於DPC具有幹細胞的特點，如自我更新、凝集性生長、處於受保護的隱蔽位置、血供豐富等，有學者將DPC轉化為紅系及髓系血細胞觀察發現在動物體內可維持達1年之久，我們推測HSPC016對維持DPC凝集性生長及其功能可能發揮重要作用。
基於上述原因和條件，利用基因工程製備人毛乳頭細胞HSPC016蛋白質成為必然。有研究證實非糖基化後修飾的HSPC016的蛋白質同樣具有促進毛乳頭細胞增殖的能力，這就為原核表達有活性的HSPC016提供了理論基礎，為進一步對該基因功能進行深入研究奠定了基礎。

發明內容
本發明的目的就是提供一種高效製備基因工程人毛乳頭細胞HSPC016蛋白質的方法，及其有關的表達載體和工程菌。
本發明的第一方面，提供一種基因工程人毛乳頭細胞HSPC016的表達載體。該載體為含有人毛乳頭細胞HSPC016基因序列的質粒pET-22b(+)，且HSPC016基因編碼序列位於pET-22b(+)載體Nde I和XhoI酶切位點之間，克隆HSPC016基因的引物為P1 5』-CATATGTCCGGCCGCGAAGGT-3』(Nde I)P2 5』-CTCGAGCTTTTTGCCAGATTTCT-3』(XhoI)。
該表達載體是pET-22b(+)/HSPC016，其構建過程如附圖1所示。
本發明的第二方面，提供一種基因工程菌。它是大腸桿菌(Escherichia coli)BL21(DE3)(購置NOVEGA公司)，並被本發明所述的表達載體所轉化。該基因工程菌是pET-22b(+)/HSPC016/BL21。(自申請之日起30年內向公眾提供該工程菌)本發明的第三方面，提供一種表達基因工程人毛乳頭細胞HSPC016目的蛋白的方法。該方法包括a)基因重組工程菌pET-22b(+)/HSPC016/BL21用發酵罐高密度發酵；b)離心收集細菌；c)超聲破菌，分離上清和沉澱，鑑定表達形式；d)親和層析純化；e)目的蛋白HSPC016的鑑定；f)目的蛋白HSPC016促進毛乳頭細胞增殖的活性實驗流式細胞儀及3H-TdR檢測毛乳頭細胞增殖情況。
本發明首次將HSPC016基因克隆至質粒pET-22b(+)在大腸桿菌中表達。其優勢在於一是目的蛋白質表達量高，表達率在28％以上。大腸桿菌表達系統的高效表達質粒pET-22b(+)是一種基於大腸桿菌T7噬菌體RNA聚合酶和T7啟動子間特異性識別而建立起來的高效偶聯表達系統——T7表達系統。使用該系統的各種表達質粒如pET-11c(+)，pET-21a(+)，pET-28a(+)，pET-30a(+)等都含有一段lac I、lac UV5啟動子和T7 RNA聚合酶基因的DNA片段，用噬菌體DE3的溶原菌，如BL21(DE3)等作為表達宿主，經IPTG誘導表達，其基因的表達水平在目前使用的各種表達系統中是很有優勢的。儘管如此，同一基因在該系統不同的表達質粒之間，或者在同一表達質粒不同酶切位點之間，其基因的表達水平也有很大差別。本發明反覆試用多種表達質粒，並且更換不同酶切位點，確定使用pET-22b(+)作為表達質粒、HSPC016編碼序列插入Nde I和Xho I酶切位點之間構建的克隆表達效果最好，表達率在28％以上，這是本發明的創新點之一。
二是加入6×His純化標籤，利於蛋白純化。在構建克隆的引物設計中，下遊引物已經去掉HSPC016基因ORF的終止密碼子，使表達的蛋白帶上載體pET-22b(+)的XhoI酶切位點之後序列翻譯的6×His純化標籤。帶有6×His純化標籤的目的蛋白可以被鎳離子化的親和層析柱高效特異地捕獲，然後用一定濃度的咪唑溶液洗脫，從而實現目的蛋白與雜蛋白的分離純化，而且改進了前期實驗構建的重組子pcDNA3.1(+)/HSPC016幾乎不表達、pPIC9K/HSPC016和pET-28a(+)/HSPC016表達率能達12％左右但純化效果差的弱點，這是本發明的創新點之二。
三是選擇pET-22b(+)作為表達可溶性外源蛋白HSPC016的載體，既保證了目的蛋白的高表達，又維持了目的蛋白在合成過程中形成的正確構象，保持了生物學活性。流式細胞儀檢測和3H-TdR摻入實驗均發現pET-22b(+)/HSPC016重組蛋白對第9代毛乳頭細胞的增殖活性及其DNA合成具有促進作用，對第3代毛乳頭細胞的增殖活性及其DNA合成與對照組相比無明顯差異。這可能是由於低傳代毛乳頭細胞本身特異表達HSPC016蛋白，pET-22b(+)/HSPC016重組蛋白的介入不會對其增殖產生顯著影響；而高傳代毛乳頭細胞一般不表達HSPC016蛋白，該蛋白的介入促進了毛乳頭細胞的增殖。pPIC9K/HSPC016和pET-28a(+)/HSPC016重組蛋白對毛乳頭細胞的增殖未見明顯促進作用。這在國內外尚未報導，為本發明的創新點之三。


圖1重組質粒pET-22b(+)/HSPC016的構建2目的基因HSPC016的ORF克隆圖3pET-22b(+)/HSPC016重組表達質粒的酶切鑑定。
圖4pET-22b(+)/HSPC016基因重組菌誘導表達SDS-PAGE電泳5pET-22b(+)/HSPC016表達形式鑑定圖6鎳離子親和層析法純化重組洗脫7目的蛋白pET-22b(+)/HSPC016純化後SDS-PAGE電泳圖8流式細胞儀檢測HSPC016重組蛋白對DPC增殖的影響；圖93H-TdR檢測HSPC016重組蛋白對DPC增殖的影響。
具體實施例方式
以下結合附圖及實施例對本發明進行進一步描述。
實施例1 人毛乳頭細胞HSPC016的編碼基因的克隆1.引物設計合成由GenBank公布的HSPC016基因核苷酸序列確定其ORF序列195bp，根據酶切位點檢索和引物設計原則，設計引物如下P1 5』-CATATGTCCGGCCGCGAAGGT-3』(Nde I)P25』-CTCGAGCTTTTTGCCAGATTTCT-3』(XhoI)引物用Primer Premier 5.0軟體設計和分析評價，由上海博亞生物技術有限公司合成，PAGE方式純化。
2.目的基因的PCR擴增
模板製備pcDNA3.1(+)/HSPC016過夜培養菌液5ml 10000rpm離心5min去上清，加入0.5ml雙蒸水混勻煮沸10min，同樣離心後取上清作模板。
PCR擴增反應體系如下模板DNA 1μlP1(25pmol/μl) 2μlP2(25pmol/μl) 2μldNTPs(2.5mmol/L each) 8μl10×PCR buffer 10μlMgCl2(25mmol/L) 10μlEx-Taq DNA polymerase 1μlddH2O 66μltotal volume100μl將反應體系振蕩混勻，離心處理後，加入40μl石蠟油。94℃預變性5min，94℃變性90s，60℃退火60s，72℃延伸90s，35個循環，72℃完全延伸10min。
3.PCR產物的回收(1)灌制可上樣200μl的1.0％瓊脂糖凝膠。
(2)將PCR擴增產物加入電泳上樣孔中，指示劑遷移至適當位置時停止電泳。
(3)在紫外線燈下切割分離含目的片段的凝膠，移入1.5ml EP管。
(4)加入DNA binding buffer，65℃水浴使凝膠完全溶化並保持溶液pH在5.0～6.0之間。將溶膠液移入分離管，12000g離心1min，棄去收集管中的液體。
(5)加入500μl Washing buffer，12000g離心1min，棄去收集管中的液體。
(6)重複步驟(5)。
(7)12000g離心1min，分離管移置另一乾淨1.5ml EP管，加入一定體積的TEbuffer，65℃孵育10min，12000g離心1min，取一定量電泳，UVP紫外光掃描檢查回收效果。
PCR擴增效果如圖2所示泳道1為核酸(DNA)分子量標準(Marker)泳道2為目的基因HSPC016擴增產物(約195bp)。
表明目的基因HSPC016與預計(195bp)大小基本一致。
實施例2 重組質粒pET-22b(+)/HSPC016的構建及篩選一.pMD18-T/HSPC016的構建(一)連接反應HSPC016的PCR產物經DNA膠回收後，通過紫外分光光度計檢測其回收產物核酸含量為200ng/μl，pMD18-T vector為50ng/μl，control insert DNA50ng/μl。根據外源片段與載體摩爾數比一般為1∶2～10的原則，設計連接反應體系如下目的片段連接HSPC016(200ng/μl) 1μlpMD18-T(50ng/μl) 1μlddH2O 3μlligation solution 5μlTotal volume10μlControl insert DNA連接Contral insert DNA(50ng/μl)1μlpMD18-T(50ng/μl) 1μlddH2O 3μlligation solution 5μltotal volume10μl16℃連接16h。
(二)連接產物轉化及重組子的篩選、鑑定1.E.coli DH5α感受態菌的製備(CaCl2法)(1)無菌接種環蘸取-70℃凍存的DH5a保種液，三線法劃線接種於LB平板，37℃培養12～16h。
(2)挑取單個菌落接種於2ml LB培養液中，37℃搖床培養12～16h。
(3)將過夜培養的DH5a按1％比例轉種至LB培養液中，37℃搖床培養至OD600為0.2～0.4時，8000g離心5min收集細菌。
(4)加入1ml預冷的0.1MCaCl2重懸沉澱，冰水浴3h。4℃8000g離心5min，棄上清。加入100μl預冷的0.1M CaCl2懸浮沉澱，冰水浴1h，備用。
2.含有X-Gal、IPTG的Amp+LB平板的製備LB固體培養基用前熔化，待溫度降至50℃左右加入Amp至終濃度為100mg/L，混勻後傾到平板，自然凝固。使用前2～3h取Amp+LB平板，加入40μl X-Gal、5μl IPTG，用L棒塗布均勻，置於37℃孵箱備用。
3.連接產物轉化(1)同時取三管感受態菌液各100μl，第一管加入連接反應產物；第二管加入control insert DNA連接產物，作為陽性對照；第三管不加外源DNA，作為陰性對照，冰水浴60min。42℃水浴熱休克100s，迅速放置冰水浴1～2min。
(2)每管各加100μl LB培養液，37℃搖床培養1h。
(3)各管以8000g離心10min，吸棄100μl上清後混勻沉澱，各取50μl塗布平板，37℃孵箱培養過夜。
4.重組子pMD18-T/HSPC016的篩選與鑑定(1)LB陰性對照平板布滿細菌，Amp+LB陰性對照平板無菌落出現；陽性對照平板有藍、白斑菌落生長，說明感受態菌的製備和連接反應兩步操作正確，結果可信。挑取轉化平板上分隔良好的藍、白斑菌落分別接種Amp+LB培養液中，37℃搖床培養過夜。
(2)質粒DNA抽提[1]取菌液分裝於1.5ml離心管中，12000g離心3min，留取沉澱。
每管加100μl Solution I懸浮，充分振蕩混勻。
加入100μl Solution II，輕柔混勻，冰水浴5min。
加入250μl Solution III，輕振混勻，室溫放置10min。
4℃、12000g離心10min，將上清移至分離管中。
12000g離心1min，傾倒收集管中的廢液。
加入500μl washing buffer於分離管中，同上離心並棄去收集管中的廢液。
重複步驟[7]。
12000g離心1min，使乙醇完全揮發。
將分離管置於另一乾淨EP管中並加入一定量的TE buffer，65℃水浴5min，12000g離心1min。
取一定量洗脫液進行電泳，其餘置於-20℃保存備用。
(3)酶切鑑定質粒DNA進行Nde I+Xho I雙酶切。
Recombinant plasmid DNA 5μlNde I 0.5μlXho I 0.5μl10×buffer(H) 1μlddH2O 3μl
total volume 10μl混勻，37℃水浴4h。電泳表明HSPC016基因已被克隆至pMD18-T中。
二.重組質粒pET-22b(+)/HSPC016的構建pMD18-T/HSPC016質粒經Nde I+Xho I雙酶切回收目的片段後與同樣經Nde I+Xho I雙酶切回收的pET-22b(+)載體相連接，構建重組質粒pET-22b(+)/HSPC016。
1.質粒抽提大量抽提質粒pET-22b(+)以及pMD18-T/HSPC016，操作方法同前。
2.酶切反應載體pET-22b(+)以及pMD18-T/HSPC016均用Nde I+Xho I雙酶切，反應體系如下pET-22b(+)pMD18-T/HSPC016plasmid DNA80μl 120μlNde I 5μl 5μlXho I 5μl 5μl10×buffer(H) 20μl 20μlddH2O 90μl 50μltotal volume 200μl200μl混勻，37℃水浴4h。
3.酶切後目的片段的回收灌制1.0％瓊脂糖回收膠，將上述酶切反應體系中各加入20μl 10×Loadingbuffer，80V電泳待指示劑遷移至距凝膠前沿1.5cm時停止電泳，分別切割含pMD18-T/HSPC016的小片段(約195bp)以及pET-22b(+)的大片段(約5493bp)的瓊脂糖凝膠，Omega膠回收試劑盒回收所需片段，操作同前。
4.連接反應紫外分光光度計檢測回收產物核酸含量，HSPC016的ORF片段為150ng/μl，載體片段pET-22b(+)為200ng/μl。根據目的片段與載體摩爾數比一般為1∶2～10的原則，設計連接反應體系如下ORF fragment(150ng/μl) 2.5μlpET-22b(+)(200ng/μl) 2μlddH2O 0.5μlligation solution 5μl
total volume 10μl16℃連接3h。
5.連接產物轉化及陽性重組子的篩選、鑑定(1)E.coli DH5α感受態菌的製備(CaCl2法)同前。
(2)Amp+LB平板的製備同前。
(3)連接產物轉化[1]同時取5管感受態菌液各100μl，一管加入pET-22b(+)質粒作為陽性對照；一管不加外源DNA，作為陰性對照；其餘三管分別加入上述連接反應產物，冰水浴60min。置42℃水浴熱休克100s，迅速放置冰水浴1～2min。
每管各加100μl LB培養液，37℃搖床培養1h。
各管以5000g離心10min，吸棄100μl上清後混勻沉澱，各取50μl塗布Amp+LB平板，37℃孵箱培養過夜。
(4)陽性重組子的篩選與鑑定[1]不含抗生素的LB平板布滿細菌，Amp+LB陰性對照平板無菌落出現；陽性對照平板有菌落生長，說明感受態菌製備操作正確，結果可信。挑取轉化平板上分隔良好的菌落接種Amp+LB培養液中，37℃搖床培養過夜。
質粒抽提。
質粒DNA進行Nde I+Xho I雙酶切鑑定。
同上以Nde I+Xho I進行雙酶切鑑定重組質粒pET-22b(+)/HSPC016，陽性重組質粒經雙酶切後出現約195bp左右的插入片段，大小與設計一致，初步證明重組質粒構建成功。酶切鑑定結果如圖3所示泳道1為重組質粒pET-22b(+)/HSPC016雙酶切Nde I/Xho I產物(約195bp)；泳道2為重組質粒pET-22b(+)/HSPC016雙酶切Nde I/Xho I產物(約195bp)；泳道3為核酸(DNA)分子量標準(Marker)。
6.基因鹼基序列測定採用T7啟動子和終止子通用引物測定重組質粒pET-22b(+)/HSPC016的鹼基序列，由上海博亞生物技術有限公司完成。測序結果表明所擴增的HSPC016基因ORF序列與GenBank公布的序列完全一致。
實施例3 pET-22b(+)/HSPC016在E.coli BL21(DE3)中的表達一.HSPC016的表達
1.pET-22b(+)/HSPC016/BL21(DE3)工程菌株的構建(1)製備感受態BL21(DE3)，操作同DH5α感受態的製備。
(2)將陽性重組子pET-22b(+)/HSPC016轉化至感受態BL21(DE3)中，操作同前。
通過Amp+抗性篩選和Nde I/Xho I雙酶切鑑定，確認重組質粒已成功轉入BL21(DE3)中。
2.SDS-PAGE檢測目的蛋白HSPC016的表達(1)重組工程菌的誘導將重組工程菌接種於3ml Amp+LB培養液中，37℃搖床培養過夜。次日將過夜培養的重組工程菌按1％的比例轉種於20ml Amp+LB培養液中，37℃搖床培養(200rp/min)待OD600≈0.8時，加入IPTG至終濃度為1mmol/L開始誘導，於誘導0、1、2、3、4、5、6小時取樣並分別測定其OD600值，同時作空載體菌誘導對照。
(2)HSPC016的表達按公式菌液量(ml)＝1/OD600取樣離心，100μl雙蒸水重懸沉澱，加入100μl 2×上樣緩衝液，混勻，煮沸15min備用。配製SDS聚丙烯醯胺凝膠，待凝膠完全聚合後，拔出上樣梳，用陰級緩衝液清洗上樣孔並用濾紙吸乾孔內水分。待測樣本與蛋白分子量標準同時上樣，當考馬斯亮藍到達凝膠底部時停止電泳。凝膠於固定液中固定30～60min，考馬斯亮藍加熱至60℃染色20min，脫色液脫色至背景無色。UVP掃描分析電泳結果，計算目的蛋白條帶的相對含量。
Nde I/Xho I雙酶切鑑定確認重組質粒成功轉入，並且誘導表達良好的重組工程菌命名為pET-22b(+)/HSPC016，按照實驗室常規方法進行菌種保存。
重組工程菌pET-22b(+)/HSPC016/BL21(DE3)經IPTG誘導後，SDS-PAGE觀察搖瓶條件下目的蛋白表達情況。與對照菌相比重組菌在7.2kDa附近均出現新的蛋白表達條帶(箭頭所示)，與推定目的蛋白Mr為7255Da基本相符，且表達量隨誘導時間的延長而增加，搖瓶條件下於6h時達到高峰，UVP掃描分析目的蛋白約佔菌體總蛋白的28％。誘導表達結果如圖4所示泳道1空質粒菌pET-22b(+)誘導前(0hr)；泳道2空質粒菌pET-22b(+)誘導後(4hr)；泳道3～9工程菌pET-22b(+)/HSPC016/BL21分別誘導0，1，2，3，4，5，6hr；泳道10蛋白質分子量標準(Marker)。
基因重組菌經過誘導後在分子量7.2kDa處有增加的蛋白表達條帶，與目的蛋白分子量一致。
二.HSPC016表達形式的鑑定1.常規方法培養細菌，培養結束後離心收集細菌並留取培養液濃縮10倍(PEG10000透析)待測。
2.超聲破菌(1)超聲波裂解菌體，功率300W超聲30s，間歇30s，工作30次。取樣染色後於顯微鏡下觀察破菌效果，未破細菌＜2個/油鏡視野為裂菌完全。750g×30min差速離心去掉未破細菌，差速上清經12000g×30min高速離心後，分離上清和沉澱。
(2)將分離所得上清和沉澱，與誘導前後的全菌以及濃縮後的培養液一起作SDS-PAGE電泳。
利用超聲波裂解或高壓均質破菌誘導後的工程菌HSPC016進行SDS-PAGE檢測目的蛋白的表達形式。結果顯示目的蛋白主要存在於破菌上清液中，在破菌沉澱和培養液泳道中無明顯的目的蛋白條帶，說明目的蛋白HSPC016為可溶性表達。表達方式鑑定結果如圖5所示泳道1誘導前全菌；泳道2誘導後全菌；泳道3破菌上清；泳道4破菌沉澱；泳道5培養液(濃縮)；泳道6蛋白質分子量標準(Marker)。
三.目的蛋白N-端胺基酸測序鑑定將誘導表達的樣品SDS-PAGE電泳後轉PVDF膜，考馬斯亮蘭染色，脫色後切下目的蛋白條帶用塑膠袋密封后送至中國醫學科學院基礎醫學研究所用全自動測序儀進行N-端胺基酸序列分析。所測N-端5個胺基酸依次為甘氨酸-蛋氨酸-絲氨酸-甘氨酸-精氨酸(GMSGR)，與實驗設計序列完全吻合。
實施例4 基因重組菌的發酵發酵工藝如下採用德國B.Bron 10L發酵罐，發酵過程中種子菌10％比例接種，保持70％溶氧、溫度37℃、pH7.0，在A600未達到2時不加補料，之後每0.5h流加補料一次使葡萄糖、胰化蛋白腖和8％酵母抽提物的終濃度分別為0.5％、0.2％、和0.2％。在第4次補料後待葡萄糖濃度降為0.1％時加入IPTG 500μmol/L誘導4h收菌。
發酵過程在級聯溶氧控制的分批培養基礎上，流加補料。
發酵過程所用培養基為改良M9-CAA培養基，在M9-CAA的基礎上添加0.6％酵母浸出液和2mg/L ZnCl2·4H2O、2mg/L CoCl2·4H2O、4mg/L FeSO4·16H2O、5mg/L H3BO3、1.6mg/LMnCl2·4H2O、4mg/L CuSO4而成。
發酵結束後回收菌液，4℃離心(8000g)15分鐘。吸棄上清，收集細菌，稱重後凍存備用。
結果10L發酵菌液可以收穫細菌溼重800克。
實施例5 目的蛋白HSPC016的純化1.Chelating Sepharose HP或Chelating Sepharose FF親和柱純化1)用相應緩衝液以0.5mL/min流速平衡Chelating Sepharose HP或ChelatingSepharose FF親和柱(柱體積10ml)，調校A280nm基線。
2)將經過超濾的上清以0.5mL/min流速上柱。
3)待上樣20mL後，用平衡緩衝液衝洗雜蛋白至A280nm回復至基線。
4)用洗脫緩衝液梯度洗脫結合於柱上的目的蛋白(0-100％B，20min)，收集洗脫峰，如圖6所示目的蛋白峰(fraction 5)獲得95％以上的純度，目標蛋白的回收率在71％左右。1為流穿峰；2為雜蛋白洗脫峰；3為目的蛋白峰。
5)合併目的蛋白峰，測定蛋白濃度。超濾濃縮至適當濃度以備凝膠過濾層析純化。
2.Superdex200凝膠過濾層析純化1)先以凝膠過濾平衡緩衝液平衡層析柱，0.5mL/min，100min。
2)將HSPC016蛋白注入Superdex200凝膠過濾柱，收集目的蛋白峰。
純化後的目的蛋白進行SDS-PAGE(如圖7)，檢測其純度。Lowry法檢測蛋白濃度。
泳道1純化前工程菌pET-22b(+)/HSPC016/BL21；泳道2空質粒菌pET-22b(+)誘導後(4hr)；泳道3～9工程菌pET-22b(+)/HSPC016/BL21純化後各上樣15μl；泳道10蛋白質分子量標準(Marker)。
實施例6 目的蛋白HSPC016促進毛乳頭細胞增殖的活性實驗DMEM培養基和小牛血清購自Hyclone公司；第3代毛乳頭細胞和第9代毛乳頭細胞由申請人用「二步酶法」製備並常規保存[方法見文獻鍾白玉，楊衛兵，楊希川，等.二步酶消化法分離人頭皮毛乳頭細胞[J].中華皮膚科雜誌，2003，36(7)406.]。
促進毛乳頭細胞增殖活性實驗包括二個方面1.流式細胞儀檢測 細胞在培養瓶內生長至70％～80％匯合時，加入HSPC016蛋白質至終濃度為0.1mg/ml；37℃、5％CO2培養箱培養48h，用0.25％胰酶+0.02％EDTA消化，離心棄上清，PBS洗滌3次；用70％乙醇固定；離心棄乙醇，PBS洗滌2次，去除固定液；加RNA酶(1g/L)，37℃孵育30min，然後用溴化乙錠(EB)作細胞DNA染色，4℃避光作用30min。結果顯示第3代DPC對照組的細胞處於S期的細胞和增殖常數(PI)分別為80.73和90.01，而HSPC016重組蛋白處理組處於S期的細胞和PI值分別為33.81和97.03，二者比較無顯著差異，說明HSPC016重組蛋白對第3代DPC的增殖沒有作用；第9代DPC對照組的PI值為0，HSPC016重組蛋白處理組的PI值為42.60，說明該重組蛋白促進第9代DPC的增殖(見圖8)。
2.3H-TdR檢測 取對數期生長細胞，製成3×105/ml的細胞懸液，接種於24孔培養板，1ml/孔；當細胞處於對數生長期時，每孔加入終濃度為0.1mg/ml的HSPC016蛋白質，培養24h後加入終濃度為3.7×107Bq/ml的3H-TdR，繼續培養6h；終止培養，棄培養液；用0.01mol/L的PBS洗滌2次，用0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化；用10％TCA重複洗2次；加入0.5ml 0.3Eq NaOH，在60℃處理30min，然後冷至室溫；收集裂解液，移入閃爍瓶中，加5ml閃爍液，用液體閃爍記數儀測定每分脈衝數(cpm)。結果表明與對照組相比，HSPC016重組蛋白對第3代DPC的增殖及DNA合成沒有顯著促進作用(P＝0.271138)；而HSPC016重組蛋白對第9代DPC的增殖及DNA合成具有顯著的促進作用(P＝0.008647)(見圖9)。
權利要求
1.一種基因工程人毛乳頭細胞HSPC016基因的表達載體，其特徵在於該載體為含有人毛乳頭細胞HSPC016基因功能序列的質粒pET-22b(+)，HSPC016編碼序列位於pET-22b(+)載體上Nde I和Xho I酶切位點之間，載體是pET-22b(+)；克隆HSPC016基因的引物為P1 5』-CATATGTCCGGCCGCGAAGGT-3』(Nde I)P2 5』-CTCGAGCTTTTTGCCAGATTTCT-3』(XhoI)。在引物P2的設計中，已經去掉HSPC016基因ORF的終止密碼子，使表達的蛋白帶上載體pET-22b(+)的Xho I酶切位點之後序列翻譯的6×His純化標籤。
2.一種基因工程菌，其特徵在於它是大腸桿菌(Escherichia coli)BL21(DE3)，它被權利要求1所述的載體所轉化。
3.一種製備人毛乳頭細胞HSPC016目的蛋白的方法，其特徵在於IPTG誘導大腸桿菌pET-22b(+)/HSPC016/BL21表達目的蛋白HSPC016，經對重組工程菌發酵、離心收集細菌、超聲破菌、分離上清和沉澱、鑑定表達形式和純化得到可溶性目的蛋白HSPC016。
4.如權利要求3所述的方法，其特徵在於重組工程菌pET-22b(+)/HSPC016/BL21的發酵方法如下採用德國B.Braun 5L發酵罐，發酵過程中種子菌10％比例接種，保持70％溶氧、溫度37℃、pH7.0，在A600未達到2時不加補料，之後每0.5h流加補料一次使葡萄糖、胰化蛋白腖和8％酵母抽提物的終濃度分別為0.5％、0.2％、和0.2％；在第4次補料後待葡萄糖濃度降為0.1％時加入IPTG 500μmol/L誘導6h收菌；發酵過程在級聯溶氧控制的分批培養基礎上，流加補料。
5.如權利要求3所述的方法，其特徵在於發酵過程所用培養基為改良M9-CAA培養基，是在M9-CAA的基礎上添加0.6％酵母浸出液和2mg/L ZnCl2·4H2O、2mg/LCoCl2·4H2O、4mg/L FeSO4·16H2O、5mg/L H3BO3、1.6mg/L MnCl2·4H2O、4mg/LCuSO4而成。
6.如權利要求3所述的方法，其特徵在於離心收集細菌、超聲破菌、分離上清和沉澱步驟如下(1)將離心收集的485g溼菌按80g/份分成6份分別用10倍體的不同緩衝液重懸；(2)高壓均質機70MPa破菌3次，油鏡檢查破菌效果；(3)細胞破碎液16000g×30min 4℃離心收集上清液；(4)上清液16000g×30min 4℃離心棄沉澱；(5)上清過0.22μm濾膜，收集濾液。
7.如權利要求3所述的方法，其特徵在於載體pET-22b(+)上Xho I酶切位點之後的6×His純化標籤可以與鎳離子特異結合，因此，選用鎳離子親和純化填料選自Chelating Sepharose HP或Chelating Sepharose FF純化。
全文摘要
本法發明涉及一種基因工程人毛乳頭細胞HSPC016基因的表達載體，該載體為含有人毛乳頭細胞HSPC016基因功能序列的質粒pET－22b(+)，HSPC016編碼序列位於pET－22b(+)載體上Nde I和Xho I酶切位點之間，載體是pET－22b(+)。本發明還涉及一種被上述載體所轉化的基因工程菌，並提供製備人毛乳頭細胞HSPC016目的蛋白的方法，通過IPTG誘導大腸桿菌pET－22b(+)/HSPC016/BL21表達目的蛋白HSPC016。本發明的優點在於目的蛋白質表達量高，表達率在28％以上；加入6×His純化標籤，利於蛋白純化；選擇pET－22b(+)作為表達可溶性外源蛋白HSPC016的載體，既保證了目的蛋白的高表達，又維持了目的蛋白在合成過程中形成的正確構象，保持了生物學活性。
文檔編號C12R1/19GK101067138SQ20071007835
公開日2007年11月7日 申請日期2007年3月30日 優先權日2007年3月30日
發明者郝飛, 鄒鋒, 宋志強 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院