基因工程靶向抗神經膠質瘤Acp-W1蛋白及製備方法和用途的製作方法

2023-07-23 22:09:21 1

專利名稱：基因工程靶向抗神經膠質瘤Acp-W1蛋白及製備方法和用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，本發明涉及一種基因工程靶向抗神經膠質瘤Acp-Wl蛋 白，同時還涉及靶向抗神經膠質瘤Acp-Wl蛋白重組的製備方法，還涉及該基因工程蛋白 Acp-Wl的用途，基因工程生產的耙向抗神經膠質瘤蛋白在動物模型水平上能高效抑制 神經膠質瘤的增殖和轉移，具有開發成抗神經膠質瘤藥物的應用價值。
背景技術：
腦神經膠質瘤是中樞神經系統最常見的腫瘤，其發生率約佔全部顱內腫瘤的40%， 患者平均存活時間為一年。目前所有治療措施(如手術切除、化學治療、放射治療和 免疫治療等)的療效和應用潛力都極為有限。針對這一嚴峻現狀，迫切需要研究和開發 一種有效的治療神經膠質瘤的藥物。1995年，Ullrich發現人腦神經膠質瘤細胞表達一種獨特的電壓依賴的氯電流，而 這種電流可以被來源於蠍毒液的氯毒素Chlorotoxin有效抑制，從而有效地降低瘤細胞 增殖速度和腫瘤細胞的轉移。隨後，在動物模型上進一步證實Chlorotoxin可選擇性抑 制神經膠質瘤。因此，篩選神經膠質瘤細胞所特有的氯離子通道的抑制劑可發展成為抗 神經膠質瘤的選擇性靶向新藥。現代科學研究表明，蠍毒的成分具有多種生理、藥理活性，對抗腫瘤、治療風溼、 抗癲癇以及心血管疾病有重要治療作用。但是其成分相當複雜，而且成分的結構和物理 化學性質相似，難以分離，許多成分所起的作用甚至相反，而且有效成分往往含量低， 這些無疑都限制了蠍毒的研究和應用。特別是蠍毒氯毒素Chlorotoxin只有36胺基酸 的小肽，在蠍毒中的含量非常低，從蠍毒混合物分離和純化Chlorotoxin的產量低和成 本昂貴，這嚴重限制了蠍毒氯毒素Chlorotoxin抗神經膠質瘤藥物的研發工作。儘管採 用基因工程技術可以生產大量的蛋白質，然而蠍毒氯毒素Chlorotoxin僅由36個氨基 酸組成，是一個很小的蛋白質多肽，如果採用基因工程的辦法生產重組Chlorotoxin, 那麼Chlorotoxin在受體表達菌中易於被蛋白酶降解，而且這麼小蛋白的表達量不高和後期純化困難。因此，通過人工改造蠍毒氯毒素Chlorotoxin,使Chlorotoxin與其它 標籤融合，形成一個較大有生物活性的融合蛋白成為了高效開發Chlorotoxin靶向抗神 經膠質瘤藥物研發的最佳途徑。發明內容本發明的目的是在於提供了一種基因工程靶向抗神經膠質瘤Acp-Wl蛋白。該蛋白 穩定性好，易於保存。本發明的另一個目的是在於提供了一種基因工程靶向抗神經膠質瘤Acp-Wl蛋白的 製備方法。該方法簡單易行，操作方便，易於生產，製備的蛋白純度高，產量高。本發明的再一個目的是在於提供了一種基因工程靶向抗神經膠質瘤Acp-Wl蛋白在 製備治療或預防神經膠質瘤的藥物中的應用。為了實現上述目的，本發明採用以下技術措施一種基因工程靶向抗神經膠質瘤Acp-Wl蛋白。通過分子生物學方法，申請人分子 設計了靶向抗神經膠質瘤Acp-Wl蛋白。一種分離的蛋白Acp-Wl，其序列為SEQ ID NO: 1所示的胺基酸序列。申請人發現Acp-Wl蛋白以液態形式在-20。C下保存6個月以上和 以乾粉形式在4'C下保存12個月以上，其生物活性不變。Acp-Wl蛋白穩定性好，易於保存。本發明涉及一種基因工程靶向抗神經膠質瘤蛋白以及生產靶向抗神經膠質瘤蛋白 的方法。該基因工程靶向抗神經膠質瘤Acp-Wl蛋白的生產方法簡單，後期純化得率高， Acp-Wl蛋白的生物活性好。Acp-WlQGPLGSDDDDKMCMPCFTTDHQMARKCDDCCGGKGRGKCYRPRCLCR (SEQ ID NO: 1)。一種基因工程耙向抗神經膠質瘤Acp-Wl蛋白的製備方法。它包括下列步驟A、設計引物設計4條PCR擴增引物進行2輪PCR擴增獲取W1基因，正向引物為Pl: 5'GCCGGATCCGATGACGATGACAAAATGTGTATGCCGTGCTTCACTACC3'，引物P2: 5' CAATCGTCACATTTACGTGCCATCTGGTGATCGGTAGTGAAGCACGGCAT3'; 反向引物為P3 : 5' CGTAAATGTGACGATTGCTGTGGTGGCAAAGGTCGTGGTAAATGCTACCG3'，引物P4 : 5， GCCCTCGAGTCAACGGCACAGACGCTGCGGACCGTAGCATTTACCACGAC3'。B、兩輪PCR擴增W1基因第一輪PCR擴增用引物P2和引物P3，第二輪PCR 擴增用引物Pl和引物P4。第一輪PCR反應的試劑如下將5微升的10x聚合酶緩衝 液、4微升的脫氧核糖核苷酸(dNTP)混合物、1微升的引物P2、 1微升的引物P3、 0.25微升的耐熱DNA聚合酶(TaqDNA)和37.75微升的無菌水混合。PCR反應條件 94"C預變性300秒、94'C變性45秒、55'C復性45秒、72'C延伸45秒、72"C最後延伸 200秒，循環32次。第二輪PCR中使用引物P1和引物P4，加入第一輪PCR擴增產物 稀釋50倍的模板1微升，其它反應條件不變，獲得特異性的擴增帶(圖l)。C、將PCR擴增W1基因融合到穀胱苷肽轉移酶(GST)的下遊，表達和純化Acp-Wl蛋白PCR擴增產物凝膠電泳回收後用BamHI和XhoI雙酶切，酶切後的片段插入 經BamHI和Xhol雙酶切的表達載體pGEX-6p-l(購自Pharmacia公司)，構建重組表達 質粒，轉化大腸桿菌Rossetta(DE3)(購自Promega)。對轉化的大腸桿菌異丙基-P-D-硫代半乳糖苷(IPTG，購自華美生物工程公司)誘導培養後，收集菌體，懸浮於緩衝 液(50mM Tris-Cl， l.OmM EDTA， pH8.0)中，超聲波破菌並離心，所得上清通過GS T親和層析膠後可收集洗脫得到的融合蛋白。收集得到的融合蛋白溶液再經超慮脫鹽和 色譜分離，獲得基因工程Acp-Wl蛋白(圖2)，純度達到95% (圖3)。基因工程Acp-Wl蛋白作為藥物在治療神經膠質瘤中的用途。它包括下列步驟A、 建立大鼠神經膠質瘤C6細胞皮下移植瘤動物模型收穫大鼠神經膠質瘤C6(購 自上海細胞所)培養細胞並配成1. 5X 16個/ml濃度的懸液，按0. 2-0. 3ml的體積注射 於每隻實驗大鼠(150g士10g)右前腋皮下，接種7至10天，即可在右前肢腋下隨手觸 摸到腫瘤顆粒。正常培養7天後，挑選成瘤較好、腫瘤大小適宜的個體作為實驗的模型 動物(圖4)。B、 Acp-Wl靶向大鼠神經膠質瘤釆用氯胺T法將方文身才性元素'"I標記GST蛋白和Acp-Wl蛋白。取巳通過碘飽和甲狀腺的模型大鼠15隻，隨機均分為3組，試驗組注 射131I-Acp-Wl蛋白，另兩組注射游離的Na1311 (由中國原子能科學研究院同位素)和'"I-GST蛋白做對照組。注射方式為尾靜脈注射，劑量20pl。分別於5min、10min、30min、 60min、 120min和180min時，採用斷頸法處死實驗動物，分別取血液以及心臟、肺、 肝、腎、胰、胃、大腦、肌肉和腫瘤組織塊作為樣品，以FT-613自動計算放免測量儀 (購自北京核儀器廠)記錄樣品的脈衝數，記錄時間30秒，換算出單位重量樣品的放 射強度(脈衝數)以及樣本單位放射量權重((某樣品單位重量脈衝數/樣本單位重量脈 衝數總和〕X100%)。統計分析發現，在180分鐘內，荷瘤大鼠腫瘤組織內131I-Acp-Wl 的含量隨時間的延長而不斷增加(富集)，而其它非腫瘤組織則不具有這種現象(圖5)， 表明重組Acp-Wl蛋白對由C6細胞所誘發的腫瘤組織有明顯的特異靶向作用。C、 體內抑制大鼠神經膠質瘤增殖大鼠腋下接種C6細胞7天後，挑選已成瘤的 個體12隻隨機分為3組，分別對3組動物腹腔注射Acp-Wl蛋白、GST蛋白和生理鹽水。 蛋白溶液濃度2PgA4，注射劑量3組均為100W/只大鼠，頻率為每2天注射一次，共 注射7次。最後一次注射後再將動物詞養5天，觀察腫瘤生長情況，解剖摘取腫瘤前採 用斷頸法處死動物，剝離皮下腫瘤組織並稱量各自瘤重，比較分析兩組間的差異。結果 表明，兩組動物皮下腫瘤平均重量分別為生理鹽水組0.3259士0. 1114g; GST蛋白組 0. 3399±0. 1965g;Acp-Wl蛋白組0. 0432±0. 0217g。Acp-Wl蛋白實際抑瘤率為86. 74%。 統計學分析也顯示兩組間腫瘤均重差異極顯著，顯示Acp-Wl蛋白具有很強的抑瘤效果(圖6)。D、 體內抑制大鼠神經膠質瘤轉移大鼠腋下接種C6細胞14天後，挑選已成瘤的 個體15隻隨機分為3組，分別對3組動物腹腔注射Acp-Wl蛋白、GST蛋白和生理鹽水。 蛋白溶液濃度2^gAa，注射劑量3組均為100W/只大鼠，頻率為每2天注射一次，共 注射7次。最後一次注射後再將動物飼養7天，觀察腫瘤生長情況，解剖摘取腫瘤前採 用斷頸法處死動物，觀察各組動物肺部腫瘤轉移情況，比較分析兩組間的差異。結果表 明，Acp-Wl蛋白試驗組動物的肺基本上是正常的，而GST蛋白和生理鹽水的試驗動 物的肺出現了腫瘤(圖7)。統計學分析也顯示兩組間腫瘤轉移差異極顯著，顯示Acp-Wl 蛋白具有很強的抑制腫瘤轉移的效果(圖7)。可見，本發明具有如下特點(1)基因工程生產Acp-Wl蛋白產量高。實驗室小試 生產95%純度以上的Acp-Wl蛋白產量達到30mg/L培養物，中試發酵水平達到500mg/L 培養物；(2) Acp-Wl穩定性高。Acp-Wl是一個由272胺基酸組成的31. 5 KDa大小的蛋白，具有很高的穩定性，不易變質；(3)易於生產。使用親和層析、超慮脫鹽和高效液 相色譜3個純化操作步驟，就可以得到95%以上色譜純的Acp-Wl蛋白；(4) Acp-Wl 藥物效果顯著。動物實驗表明，重組Acp-Wl蛋白不僅對神經膠質瘤組織具有特異靶向 性，而且能有效抑制神經膠質瘤惡性增殖和轉移。


圖1重疊PCR方法擴增Wl基因示意圖M: DNA Mark Ladder2000; 1:引物P2和P3的擴增帶；2:引物Pl和P4的擴增帶。圖2工程菌BL21(pGEX/Acp-Wl)的誘導表達示意圖1:未經誘導轉化pGEX-Acp-Wl的全細胞蛋白提取物；2:經IPTG誘導轉化pGEX-pGEX-Acp-Wl的全細胞蛋白提取物；3:純化的基因工程Acp-Wl蛋白；4:中分 子量蛋白質Mark。圖3基因工程Acp-Wl蛋白的HPLC分析圖4建立大鼠神經膠質瘤C6細胞皮下移植瘤動物模型(A):大鼠神經膠質瘤C6細胞皮下移植瘤動物外形照片(接種21天)；(B):對應A圖大鼠神經膠質瘤C6細胞皮下移植瘤動物解剖照片。 圖5Acp-Wl蛋白耙向大鼠神經膠質瘤(A):生理鹽水對照組mI在大鼠不同組織中的增長速率；(B): GST蛋白在大鼠不同組織中的增長速率；(C): 131I-Acp-Wl蛋白在大鼠不同組織中的增長速率。 圖6 Acp-Wl蛋白體內抑制大鼠神經膠質瘤增殖(A):生理鹽水、GST蛋白和Acp-Wl蛋白處理組大鼠神經膠質瘤解剖結果；(B): 生理鹽水、GST蛋白和Acp-Wl蛋白處理組大鼠神經膠質瘤重量及其抑瘤率；(C): 生理鹽水、GST蛋白和Acp-Wl蛋白處理組大鼠神經膠質瘤重量的矩形圖。 圖7 Acp-Wl蛋白體內抑制大鼠神經膠質瘤轉移(A):生理鹽水和Acp-Wl蛋白處理組大鼠肺的腫瘤轉移情況統計；(B):典型的生理鹽水和Acp-Wl蛋白處理組大鼠肺解剖照片(a: —只具有+ + +腫瘤嚴重程度 的生理鹽水對照組大鼠肺；b: —只沒有發生病變的Acp-Wl蛋白組大鼠肺)。
具體實施方式
實施例l:分子設計W1基因基於已報導的蠍毒氯毒素Chlorotoxin(蛋白登記號P45639)的胺基酸序列，利用 常規方法推斷編碼蛋白質的核苷酸序列，同時考慮大腸桿菌密碼子偏好性。在此基礎上， 分別設計引物進行PCR擴增獲取目的基因Wl 。正向引物為Pl : 5'GCCGGATCCGATGACGATGACAAAATGTGTATGCCGTGCTTCACTACC3'，引物P2 : 5' CAATCGTCACATTTACGTGCCATCTGGTGATCGGTAGTGAAGCACGGCAT3'; 反向引物為P3 : 5' CGTAAATGTGACGATTGCTGTGGTGGCAAAGGTCGTGGTAAATGCTACCG3'，引物P4 : 5' GCCCTCGAGTCAACGGCACAGACAACGCGGACCGTAGCATTTACCACGAC3'。第一輪PCR擴增用引物 P2和引物P3，第二輪PCR擴增用引物P1和引物P4。第一輪PCR反應的試劑如下 將5微升的10xTaq聚合酶緩衝液、4微升的dNTP混合物、1微升的引物P2、 1微升的 引物P3、 0.25微升的TaqDNA聚合酶和37.75微升的無菌水混合。PCR反應條件94 'C預變性300秒、94。C變性45秒、55。C復性45秒、72'C延伸45秒、72。C最後延伸200 秒，循環32次。第二輪PCR中使用引物P1和引物P4，加入第一輪PCR擴增產物稀 釋50倍的模板1微升，其它反應條件不變。實施例2: Acp-Wl蛋白重組表達載體的構建 A: Wl和pGEX-6p-l的雙酶切與連接將實施例1中所得PCR產物經過酚:氯仿異戊醇(25: 24: l)抽提，無水乙醇(2. 5 倍體積)沉澱後用50^1滅菌水溶解沉澱。用限制性內切酶BamHI和Xhol (Takara公 司產品)對回收的PCR產物和表達載體pGEX-6p-l質粒進行酶切。酶切反應 BamHI(14U/nl)和XhoI(20U^il)各l)al， 10倍緩衝液2.5^1,， PCR產物或pGEX-6p-l質粒 50-100ng，加無菌水至總體積為25pl。 37'C水浴5小時，酶切產物經酚氯仿異戊醇抽 提，無水乙醇(2.5倍體積)沉澱後用TJ)NA連接酶(Takara公司產品)將PCR產物與 表達載體pGEX-6p-l連接。連接反應T4DNA連接酶(1U 1) 1^1， PCR產物與表達 載體pGEX-6p-l的摩爾比為3: 1，並且DNA總量為O.lng， 5倍連接酶反應緩衝液4^1， 加無菌水至總體積為2(^1， 16'C放置24小時。B:大腸桿菌DH5a和Rossetta(DE3)感受態細胞的製備DH5ct (購自中國典型培養物保藏中心，該菌株DH5a為普通菌株)感受態細胞的製備在劃線平板上挑取DH5a單菌落，接種於5mlLB培養液，37°C， 250rpm搖床中 培養過夜；以1%量轉接於5ml LB培養基中，生長至OD,至lj 0.4 0.6，取菌液lml 於預冷的1.5ml Eppendorf管中，冰浴5 10分鐘，4°C 12,000rpm離心20 30秒，收 集菌體，倒置1分鐘，再冰浴10分鐘；沉澱重懸於lml預冷的0.1M CaCl2中，冰浴 20 40分鐘，4°C 12,000rpm離心20 30秒，收集菌體，將菌體重懸於150^1預冷的 CaCl2中，冰浴2 7小時，4'C冰箱保存，如放置在-7(TC則可保存6個月。Rossetta(DE3)感受態細胞的製備同於DH5a感受態細胞的製備。C-連接產物的轉化和陽性克隆的鑑定將實施例2A步驟中的20[xl連接反應液加到100^1的DH5a感受態細胞，混勻，冰 浴30分鐘，42'C水浴卯秒(不能搖動)，再冰浴2分鐘；加等體積2XLB培養液，37 'C搖床(120rpm)溫育1小時；搖勻菌液，取200|11塗布於LB/AP+瓊脂平板上，待菌 液吸乾後倒置於37'C培養12 16小時，觀察結果。加氨苄青黴素瓊脂平板(LB/AP+)上挑取單菌落10個，於500pl含氨苄的LB液 體培養基中37'C振搖4小時，取2pl菌液作為模板，以實施例1中的正反向引物P1、 P2、 P3、 P4進行PCR。 PCR篩選的陽性克隆子進一步使用限制性酶切反應鑑定。兩者 都為陽性結果的克隆子送上海三博公司進行測序分析。測序引物是針對pGEX-6p-l質 粒的通用測序引物pGEX5'primer。實施例3:重組Acp-Wl基因工程菌的製備將實施例2C步驟中測序正確的陽性克隆子按照鹼裂解法提取重組表達質粒 pGEX-Acp-Wl (方法見《分子克隆》第二版)。按照實施例2C步驟中的轉化方法將提取 的pGEX-Acp-Wl質粒轉入實施例2B步驟製備的大腸桿菌感受態Rossetta(DE3)細胞中。 平板為LB/AP+瓊脂平板。挑取單克隆子獲得基因工程菌Rossetta(DE3) (pGEX-Acp-Wl)。實施例4:重組Acp-Wl蛋白的表達和純化在含氨苄青黴素的LB液體培養基中以1:100的比例接種克隆子(重組大腸桿菌Ro ssetta (DE3) /pGEX-Acp-Wl)， 37。C培養至OD6。。=0. 8時加入IPTG(終濃度為0. ImM) 對培養物進行誘導，然後將培養物在28'C培養4小時以進行目的基因的表達。濃縮誘 導後的培養物50倍，超聲波破細胞(80HZ,30秒/次，至培養物變清亮為止)，12000rpm離心15分鐘，所得上清加入到GST親和層析膠中充分混合後26'C作用1小時使Acp-W 1蛋白與GST親和層析膠充分結合。用含50rnM的EDTA(乙二胺四乙酸)的Tris-Cl(三羥 甲基氨基甲烷鹽酸)緩衝溶液(l. OmM, pH8. O)反覆衝洗GST親和層析膠去除雜蛋白。然後 用10mM的GSH (還原型穀胱甘肽)溶液按照50ml/L培養物洗脫Acp-Wl蛋白。洗脫的A cp-Wl蛋白通過50ml的lOKDa超慮管(Millipore， Centricon， USA)離心濃縮脫鹽， 離心速度為3500rpm/min，溫度為4°C。然後濃縮脫鹽的Acp-Wl蛋白進行HPLC (美國 安吉倫公司產品)純化。HPLC的參數設置為分離柱子C18 (EliteHPLC， China, 10 X250隱，5—，流速5ml/min，液相為含有0. 1%的三氟乙酸TFA的乙腈(CH3CN: 10% to 80%)洗脫液，紫外檢測設置在280nm處。手工收集Acp-Wl蛋白峰，並且冷凍乾燥 (一4(TC)。通過Tris-Tricine緩衝液的十二垸基磺酸鈉聚丙烯醯氨凝膠電泳(SDS-P AGE)檢測收集液中的重組Acp-Wl蛋白，並用Bradford方法測定含量。高效液相色譜 鑑定蛋白純度達到95%。實施例5:大鼠神經膠質瘤C6細胞皮下移植瘤動物模型的建立收穫C6培養細胞並配成1. 5X 1(f個/ml濃度的懸液，按0. 2-0. 3ml的體積注射於 每隻實驗SD大鼠(150g土10g，購自湖北省試驗動物中心)右前腋皮下，接種7至10 天，即可在右前肢腋下隨手觸摸到腫瘤顆粒。正常培養7天後，挑選成瘤較好、腫瘤大 小適宜的個體作為實驗的模型動物。實施例6: Acp-Wl耙向大鼠C6細胞皮下移植瘤採用氯胺T法將方文射性元素1311標記GST蛋白和Acp-Wl蛋白。取已通過碘飽和甲狀腺的模型大鼠15隻，隨機均分為3組，試驗組注射^I-Acp-Wl蛋白，另兩組注射 游離的Na1311和131I-GST蛋白做對照組。注射方式為尾靜脈注射，劑量20^1。分別於 5min、 10min、 30min、 60min、 120min和180min時，採用斷頸法處死實驗動物，分別 取血液以及心臟、肺、肝、腎、胰、胃、大腦、肌肉和腫瘤組織塊作為樣品，以FT-613 自動計算放免測量儀記錄樣品的脈衝數，記錄時間30秒，換算出單位重量樣品的放射 強度(脈衝數)以及樣本單位放射量權重((某樣品單位重量脈衝數/樣本單位重量脈衝 數總和〕X100%)。統計分析發現，在180分鐘內，荷瘤大鼠腫瘤組織內131I-Acp-Wl的 含量隨時間的延長而不斷增加(富集)，而其它非腫瘤組織則不具有這種現象，表明重組Acp-Wl蛋白對由C6細胞所誘發的腫瘤組織有明顯的特異靶向作用。實施例7: Acp-Wl蛋白體內抑制大鼠神經膠質瘤增殖大鼠腋下接種C6細胞7天後，挑選已成瘤的個體12隻隨機分為3組，分別對3 組動物腹腔注射Acp-Wl蛋白、GST蛋白和生理鹽水。蛋白溶液濃度2PgAa，注射劑量 3組均為100W/只大鼠，頻率為每2天注射一次，共注射7次。最後一次注射後再將動 物飼養5天，觀察腫瘤生長情況，解剖摘取腫瘤前採用斷頸法處死動物，剝離皮下腫瘤 組織並稱量各自瘤重，比較分析兩組間的差異。結果表明，兩組動物皮下腫瘤平均重量 分別為生理鹽水組0. 3259±0. 1114g; GST蛋白組0. 3399±0. 1965g; Acp-Wl蛋白組 0. 0432±0. 0217g。 Acp-Wl蛋白實際抑瘤率為86. 74%。統計學分析也顯示兩組間腫瘤均 重差異極顯著，顯示Acp-Wl蛋白具有很強的抑瘤效果。實施例8: Acp-Wl蛋白體內抑制大鼠神經膠質瘤轉移大鼠腋下接種C6細胞14天後，挑選已成瘤的個體15隻隨機分為3組，分別對3 組動物腹腔注射Acp-Wl蛋白、GST蛋白和生理鹽水。蛋白溶液濃度2PgAi1，注射劑量 3組均為100ri/只大鼠，頻率為每2天注射一次，共注射7次。最後一次注射後再將動 物飼養7天，觀察腫瘤生長情況，解剖摘取腫瘤前採用斷頸法處死動物，觀察各組動物 肺部腫瘤轉移情況，比較分析兩組間的差異。結果表明，Acp-Wl蛋白試驗組動物的肺 基本上是正常的，而GST蛋白和生理鹽水的試驗動物的肺出現了腫瘤。統計學分析也 顯示兩組間腫瘤轉移差異極顯著，顯示Acp-Wl蛋白具有很強的抑制腫瘤轉移的效果。SEQUENCE LISTING〈110〉 武漢大學〈120〉基因工程靶向抗神經膠質瘤Acp-Wl蛋白及製備方法和用途 〈130〉基因工程靶向抗神經膠質瘤Acp-Wl蛋白及製備方法和用途〈160〉 1<170〉 Patentln version 3.1〈210〉 1〈211〉 272〈212〉 PRT 〈213〉人工合成〈400〉 1Met Ser Pro lie Leu Gly Tyr Trp Lys lie Lys Gly Leu Val Gin Pro15 10 15Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu20 25 30Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu35 40 45Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr lie Asp Gly Asp Val Lys50 55 60Leu Thr Gin Ser Met Ala lie lie Arg Tyr lie Ala Asp Lys His Asn 65 70 75 80Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu lie Ser Met Leu Glu85 90 95Gly Ala Val Leu Asp lie Arg Tyr Gly Val Ser Arg lie Ala Tyr Ser100 105 110Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu115 120 125Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn130 135 140Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp 145 150 155 160Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu165 170 175Val Cys Phe Lys Lys Arg lie Glu Ala lie Pro Gin lie Asp Lys Tyr180 185 190Leu Lys Ser Ser Lys Tyr lie Ala Trp Pro Leu Gin Gly Trp Gin Ala195 200 205Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Glu Val Leu210 215 220Phe Gin Gly Pro Leu Gly Ser Asp Asp Asp Asp Lys Met Cys Met Pro 225 230 235 240Cys Phe Thr Thr Asp His Gin Met Ala Arg Lys Cys Asp Asp Cys Cys245 250 255Gly Gly Lys Gly Arg Gly Lys Cys Tyr Arg Pro Arg Cys Leu Cys Arg 260 265 270
權利要求
1. 一種分離的多肽，其序列為SEQ ID NO1所示的胺基酸序列。
2、 一種製備權利要求l所述的一種基因工程靶向抗神經膠質瘤Acp-Wl蛋白的方法， 其步驟是A、 設計引物設計4條PCR擴增引物進行2輪PCR擴增獲取W1基因，正向引 物為Pl: 5'GCCGGATCCGATGACGATGACAAAATGTGTATGCCGTGCTTCACTACC3'，引物P2: 5' CAATCGTCACATTTACGTGCCATCTGGTGATCGGTAGTGAAGCACGGCAT3'; 反向引物為P3 : 5' CGTAAATGTGACGATTGCTGTGGTGGCAAAGGTCGTGGTAAATGCTACCG3'，引物P4 : 5， GCCCTCGAGTCAACGGCACAGACAACGCGGACCGTAGCATTTACCACGAC3';B、 兩輪PCR擴增W1基因第一輪PCR擴增用引物P2和引物P3，第二輪PCR 擴增用引物P1和引物P4，第一輪PCR反應的試劑如下將5微升的10xTaq聚合酶緩 衝液、4微升的dNTP混合物、1微升的引物P2、 1微升的引物P3、 0.25微升的TaqDNA 聚合酶和37.75微升的無菌水混合，PCR反應條件94'C預變性300秒、94'C變性45 秒、55'C復性45秒、72r延伸45秒、72'C最後延伸200秒，循環32次，第二輪PCR 中使用引物P1和引物P4，加入第一輪PCR擴增產物稀釋50倍的模板1微升，其它反 應條件不變，獲得擴增帶；C、 Acp-Wl蛋白的表達和純化PCR擴增產物凝膠電泳回收後用Saw/7I和J^01 雙酶切，酶切後的片段插入經SflmM和Wol雙酶切的表達載體pGEX-6p-l ，構建重組 表達質粒，轉化大腸桿菌Rossetta(DE3),對轉化的大腸桿菌異丙基-P -D-硫代半乳糖 苷誘導培養後，收集菌體，懸浮於緩衝液中，超聲波破菌並離心，所得上清通過GST 親和層析膠後收集洗脫液得到融合蛋白，再經超慮脫鹽和色譜分離，獲得基因工程Ac p-Wl蛋白。
3、 權利要求1所述的一種基因工程靶向抗神經膠質瘤Acp-Wl蛋白在製備治療或 預防神經膠質瘤的藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種基因工程靶向抗神經膠質瘤Acp-W1蛋白及製備方法和應用，本發明分離了一種蛋白質，其序列為SEQ ID NO1所示的胺基酸序列。基因工程所涉及的引物，將蠍毒氯毒素的核苷酸序列插入表達載體中pGEX-6p-1，構成重組表達質粒；重組質粒轉化大腸桿菌Rossetta(DE3)，然後細胞裂解經親和層析、超慮脫鹽和色譜純化得到Acp-W1蛋白。Acp-W1蛋白對神經膠質瘤有特異靶向作用，且能有效抑制大鼠神經膠質瘤的增殖，具有靶向抗神經膠質瘤的作用。Acp-W1蛋白在製備治療或預防神經膠質瘤藥物中的應用。本發明方法簡單易行，操作方便，產量高，生物活性好。
文檔編號C07K14/435GK101270157SQ20081004755
公開日2008年9月24日 申請日期2008年4月30日 優先權日2008年4月30日
發明者輝 劉, 孫正博, 曹志賤, 李文鑫, 範少忠, 蔣達和 申請人:武漢大學